Name: Tissu-spécifique miRNA, profilage de l’Expression à l’aide de la souris coeur Sections en hybridation in Situ (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Apprenez la détection simultanée de miARN et de protéines dans les sections de tissu cardiaque de souris par hybridation in situ et immunomarquage. Cette méthode permet d'étudier la localisation des biomolécules avec une grande précision.

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Nous tenons à remercier Athanasios Papangelis, des observations critiques sur le manuscrit. FM est pris en charge par le Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC ; BB/M009424/1). IP est pris en charge par l’American Heart Association scientifique Development Grant (17SDG33060002).

Échantillons de tissu de coeur de souris pour cette étude ont été obtenus en conformité avec les lois et directives institutionnelles et ont été approuvés par le Comité d’utilisation et de Yale University Institutional Animal Care.
1. préparation de la solution
<ol><li>Préparer la RNase ddH gratuit2O, en traitant les 5 L de ddH2O 5 ml de diéthylpyrocarbonate de 0,1 % (DEPC) pendant la nuit (O/N), à température ambiante (RT). Autoclave (121 ° C) pour désactiver le CPDE. Utilisation traitée DEPC ddH2O pour la préparation de solutions en aval comme indiqué. ATTENTION : DEPC est un cancérigène connu, seulement manipuler sous la hotte.</li>
	<li>Préparer 1 solution Saline tamponnée au Phosphate (PBS) de x en dissolvant 5 comprimés de PBS dans 1 L de ddH traitée DEPC2O. Autoclave (121 ° C).</li>
	<li>Préparer un détergent non ionique de 0,1 % / PBS (PBST) en diluant 1 mL de détergent non ionique pour 1 L de PBS 1 x.</li>
	<li>Préparer les 90 %, 70 %, 50 % et 30 % d’éthanol dans ddH traitée DEPC2O.</li>
	<li>Préparer un 10 mg/mL solution de protéinase K (ProK) dans ddH traitée DEPC2O. aliquote et conserver à-20 ° C. Préparer une solution de travail 20 μg/mL de ProK en diluant 100 μL de solution mère ProK dans 50 mL de ddH traitée DEPC2O. Make frais avant utilisation.</li>
	<li>Préparer 4 % paraformaldéhyde (PFA) en ajoutant 2 g de l’IFP dans 50 mL de PBS 1 x. Chauffer à 65 ° C sous agitation occasionnels, jusqu'à la dissolution. Aliquote et conserver à-20 ° C. ATTENTION : PFA est un cancérigène connu, seulement manipuler sous la hotte.</li>
	<li>Préparer une solution de NaCl à 3 M en ajoutant 87,8 g pour 500 mL de ddH2O. Autoclave (121 ° C).</li>
	<li>Préparer une solution 1 M de MgCl2 en ajoutant 20,3 g dans 100 mL de ddH2O. Autoclave (121 ° C).</li>
	<li>Préparer 1 M Tris pH 8.0 par dissolution 121,1 g dans 800 mL de ddH2O. ajuster le pH à 8.0 avec quelques gouttes de 1 N HCl, porter le volume à 1 L et autoclave (121 ° C). Préparer une solution de 50 mM Tris pH 8.0 en diluant 2,5 mL de 1 M Tris pH 8.0 à 47,5 mL de ddH2O.</li>
	<li>Préparer 1 M Tris pH 9,5 par dissolution 60,6 g dans 400 mL de ddH2O. ajuster le pH à 9,5 avec quelques gouttes de 1 N HCl, porter le volume à 500 mL et autoclave (121 ° C).</li>
	<li>Préparer 0,13 M 1-méthylimidazole pH 8.0 par dilution 1,6 mL de 1-méthylimidazole à 130 mL de ddH traitée DEPC2O. ajuster le pH à 8.0 avec environ 450 µL de 12 N HCl. Ajouter 16 mL de NaCl 3 M et porter le volume à 160 mL. Faire des frais avant utilisation. ATTENTION : 1-méthylimidazole est nocif pour la peau, des yeux et des muqueuses, seulement manipuler sous la hotte.</li>
	<li>Préparer le chlorhydrate de 0,16 M N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide (EDC) en diluant 176 µL d’EDC à 10 mL de 0,13 M 1-méthylimidazole. Ajuster le pH à 8,0 avec environ 100 µL de 12 N HCl. faire frais avant utilisation. ATTENTION : EDC est nocif pour la peau, des yeux et des muqueuses, seulement manipuler sous la hotte.</li>
	<li>Préparer 1 % H2O2 en diluant 1,5 mL 30 % H2O2 dans 50 mL de solution 1 PBS x. Faire des frais avant utilisation.</li>
	<li>
Préparer 20 x SSC pH 7.0 en dissolvant 175,3 g de NaCl et 88,2 g de citrate de sodium (Na3C6H5O7) à 800 mL de ddH2O. ajuster le pH à 7.0 avec quelques gouttes de 1 N HCl, porter le volume à 1 L et autoclave (121 ° C).
	<ol>
<li>Préparer une solution de travail de 2 x SSC pH 7.0 en diluer 20 mL de 20 x SSC pH 7.0 à 180 mL de ddH2O.</li>
		<li>Préparer une solution de 1 x SSC pH 7.0 en diluant 2,5 mL de 20 x SSC pH 7.0 à 47,5 mL de ddH2O.</li>
		<li>Préparer une solution de 0,2 x SSC pH 7.0 en diluant 5 mL 2 x SSC pH 7.0 dans 45 ml de ddH2O.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer 1 x solution d’hybridation en diluant 0,5 mL de tampon ISH x microRNA 2 dans 0,5 mL de ddH traitée DEPC2O. Make frais avant utilisation.</li>
	<li>Préparer la solution mère de 200 mM de Levamisole en ajoutant 250 mg pour 5 mL de ddH2O. aliquote et conserver à-20 ° C.</li>
	<li>Préparer la solution de saturation pour l’étape 5 (10 % moutons serum/1% BSA/0,2 mM Levamisol) en diluer 1 mL de sérum de moutons dans 9 mL PBST et en ajoutant 0,1 g de BSA. Ajouter 10 μL de Levamisole avant d’utiliser. Faire des frais avant utilisation.</li>
	<li>Préparez-la solution blocage étape 6 (10 % chèvre serum/1% BSA) diluer 1 mL de sérum de chèvre dans 9 mL de PBST et l’ajout de 0,1 g de BSA. Conserver à 4 ° C et utiliser dans une semaine.</li>
	<li>Préparer une solution prestaining en diluant 3,3 mL de 3 M de NaCl 5 mL 1 M MgCl2, 10 mL de 1 M Tris pH 9.5, 100 µL de Tween-20, 100 µL de Levamisole en mL 81,5 ddH2O. Make fraîches avant leur utilisation.</li>
	<li>Utilisez le nitrobleu de tétrazolium (comprimés de phosphate (CBPI) NBT)/5-bromo-4-chloro-3-indoly pour préparer les 20 mL de solution de substrat de Phosphatase alcaline (PA) selon les instructions du fabricant. Ajouter 20 μL de Levamisole. Faire des frais avant de l’utiliser et protéger de la lumière.</li>
	<li>Préparer la solution de KTBT en ajoutant 4 g de Tris, 4,4 g de NaCl et 375 mg de KCl dans 500 mL de ddH2O. Autoclave (121 ° C).</li>
	<li>Facultatif : Préparer une solution de travail DAPI (1 μg/mL) en diluant 50 μL de la solution DAPI (1 mg/mL) dans 50 mL de PBS 1 x. Remarque : Des solutions standards tels que NaCl 3 M, 1 M MgCl2, 1 M Tris-HCl, exempte de nucléase ddH2O, 1 x PBS et 20 x SSC peuvent être achetés par ailleurs. Pour ce protocole, les pots de 50 mL verre Coplin ou les mailer diapositive polypropylène 20 mL pots ont été utilisés.</li>
</ol>2. préparation du tissu
Remarque : Les sections de coeur de souris utilisées ici ont été préparées par Yale pathologie tissulaire Services, du formol-fixe/paraffine tissu, couper à 5 μm et positionnées diapositives chargées.
<ol><li>
Réhydratation des tissus.
	<ol>
<li>Réchauffer les diapositives à 60 ° C pendant 10 min, au four jusqu'à ce que la paraffine est visiblement fonte hybridation.</li>
		<li>Incuber les lames dans un bocal en verre Coplin contenant 50 mL d’agent de compensation disponible dans le commerce (voir Table des matières) pendant 10 minutes, deux fois.</li>
		<li>Incuber les lames dans un bocal en verre Coplin contenant 50 mL d’éthanol à 100 % pendant 2 min, deux fois, suivie de l’éthanol à 90 % pendant 2 min, éthanol à 70 % pendant 2 min, deux fois, éthanol à 50 % pendant 2 min et 30 % éthanol pendant 2 min.</li>
		<li>Incuber les lames dans un bocal en verre Coplin contenant 50 mL de ddH traitée DEPC2O pendant 5 min.</li>
		<li>Incuber les lames dans un bocal en verre Coplin contenant 50 mL de PBS 1 x pendant 5 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tissu de-proteinating.
	<ol>
<li>Incuber les lames dans un bocal en verre Coplin contenant 50 mL de 20 μg/mL de solution de travail ProK, à 37 ° C pendant 15 min dans le four de l’hybridation. ATTENTION : Sous digestion peut entraîner à pauvres ou aucun aménagement de signal, tandis que la digestion excessive peut entraîner la dégradation des tissus et le développement de la coloration de fond. Optimisation peut-être être nécessaire pour cette étape (1 – 20 μg/mL ProK, 5 – 20 min d’incubation, RT-37 ° C).</li>
		<li>Laver les lames dans un bocal en verre Coplin contenant 50 mL de PBS 1 x pendant 5 min, à la droite, deux fois.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fixation du tissu.
	<ol>
<li>Utilisez un stylo hydrophobe pour dessiner un cercle hydrofuge autour du tissu sur chaque diapositive.</li>
		<li>Appliquer 500 µL de solution PFA de 4 % à la durée de chaque diapositive et incuber les lames horizontalement pendant 10 min, à température ambiante.</li>
		<li>Laver les lames dans un bocal en verre Coplin contenant 50 mL de PBS 1 x pendant 5 min, à la droite, deux fois.</li>
		<li>Laver les lames dans un bocal en verre Coplin contenant 50 mL de 0,13 M 1-méthylimidazole pendant 10 min, à la droite, deux fois.</li>
		<li>Appliquez 500 µL de solution d’EDC de 0,16 M à la longueur de la lame et incuber les lames horizontalement pendant 1 h à RT, dans une chambre humidifiée.</li>
		<li>Rincer les lames dans un bocal en verre Coplin contenant 50 mL de 50 mM Tris pH 8.0 à température ambiante.</li>
		<li>Rincer les lames dans un bocal en verre Coplin contenant 50 mL de PBS 1 x à la droite, deux fois. Remarque : Les étapes de fixation PFA et EDC sont requis pour la réticulation de miRNA et ne devraient pas être omises. 31
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bloc de peroxydase endogène.
	<ol>
<li>Incuber les lames dans un bocal en verre Coplin contenant 50 mL 1 % H2O2 pendant 30 min à température ambiante.</li>
		<li>Rincer les lames dans un bocal en verre Coplin contenant 50 mL de PBS 1 x à la droite, deux fois.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. l’hybridation
<ol><li>Le préchauffage de solution d’hybridation (500 µL par lame) à 50 ° C dans le four de l’hybridation, jusqu'à ce que la température de la cible, est atteinte (10 à 15 min).</li>
	<li>Préparer la chambre de l’hybridation en plaçant 2 morceaux de filtre ou de papier de soie dans le fond de la chambre et de mouiller le papier avec 50 % formamide/1 x SSC. ATTENTION : Le Formamide est nocif pour la peau, seule poignée sous la hotte, des yeux et des muqueuses.</li>
	<li>Appliquer 200 µL de solution d’hybridation à la longueur de la lame. Incuber les lames horizontalement pendant 1 à 3 h à 50 ° C, dans une chambre humidifiée.</li>
	<li>Préparer la solution de la sonde en mélangeant sonde stock de 0,5 µL (25 µM) dans 250 µL de solution d’ofhybridization (concentration finale 50 nM) dans un tube de 1,5 mL. Remarque : Différents miARN est exprimées à différents niveaux, donc optimisation concernant la concentration de la sonde peut être requise pour cette étape (1 à 50 nM), afin de n’éviter aucun signal ou développement de fond élevé.</li>
	<li>Appliquer 250 µL de solution de la sonde à la longueur de la lame et placer une lamelle couvre-objet gratuit RNase sur le dessus. Éviter la formation de bulles.</li>
	<li>Bien sceller la chambre hybridation avec parafilm et incuber O/N à 50 ° C. Remarque : La température d’hybridation doit être réglée entre 30 ° C au-dessous de la température de fusion de RNA (Tm) de chaque sonde. Optimisation peut être exigée. Ici, 50 ° C est utilisée comme la température d’hybridation/cycle de lavage pour miRNA-182, ajuster en fonction des différentes sondes.</li>
</ol>4. rigueur lavages
<ol><li>Préchauffer à 200 mL de 2 x SSC à 50 ° C dans le four de l’hybridation, jusqu'à ce que la température de consigne est atteinte (20 à 40 min).</li>
	<li>Laver les lames dans un bocal en verre Coplin contenant 50 mL de 2 x SSC à 50 ° C pendant 5 min, ou jusqu'à ce que les lamelles desserrer.</li>
	<li>Laver les lames dans un bocal en verre Coplin contenant 50 mL de 2 x SSC à RT pendant 5 minutes, deux fois.</li>
	<li>Laver les lames dans un bocal en verre Coplin contenant 50 mL de 0,2 x SSC à RT pendant 5 min.</li>
	<li>Laver les lames dans un bocal en verre Coplin contenant 50 mL de PBST RT pendant 5 min.</li>
	<li>Laver les lames dans un bocal en verre Coplin contenant 50 mL de PBS 1 x à ta pendant 5 min. Remarque : Utilisation de conditions sans RNase n’est plus nécessaire puisque les hybrides ARN-ARN sont considérées comme stables.</li>
</ol>5. creuser la détection des anticorps
<ol><li>Utilisez un stylo hydrophobe pour re-dessiner un cercle hydrofuge autour du tissu sur chaque diapositive, si nécessaire.</li>
	<li>Déposer 500 µL de bloquant la solution à la longueur de la lame. Incuber les lames horizontalement pendant 30 min à la droite, dans une chambre humidifiée.</li>
	<li>Préparer la solution d’anticorps DIG (1:1, 000) en dilution 0,5 μL d’anticorps DIG dans 500 µL de solution d’ofblocking dans un tube de 1,5 mL. ATTENTION : L’optimisation peut être requise pour cette étape (1/500 – 1:2, 000).</li>
	<li>Appliquer 500 µL de solution d’anticorps de creuser à la longueur de la lame. Incuber les lames horizontalement pendant 1 h à RT, dans une chambre humidifiée.</li>
	<li>Laver les lames dans un bocal en verre Coplin contenant 50 mL de PBST RT pendant 5 min, trois fois.</li>
	<li>Laver les lames dans un bocal en verre Coplin contenant 50 mL de prestaining solution à ta pendant 5 minutes, deux fois.</li>
	<li>Incuber les lames dans un bocal de mailer polypropylène diapositive contenant 20 mL de solution de substrat ofAP à 37 ° C, pendant 6 à 24 h, abri de la lumière. ATTENTION : Développement de la couleur doit être vérifié que chaque 2 h. optimisation peuvent être nécessaires pour cette étape.</li>
	<li>Laver les lames dans un bocal en verre Coplin contenant 50 mL de solution KTBT à RT pendant 5 minutes, deux fois.</li>
	<li>Laver les lames dans un bocal en verre Coplin contenant 50 mL de PBS 1 x à ta pendant 5 min.</li>
</ol>6. cTnT détection d’anticorps
<ol><li>Utilisez un stylo hydrophobe pour re-dessiner un cercle hydrofuge autour du tissu sur chaque diapositive, si nécessaire.</li>
	<li>Déposer 500 µL de bloquant la solution à la longueur de la lame. Incuber les lames horizontalement pendant 1 h à RT, dans une chambre humidifiée.</li>
	<li>Préparer la solution d’anticorps cTnT (1/100) en diluant 2 μL d’anticorps cTnT en solution d’ofblocking 200 μL dans un tube de 1,5 mL.</li>
	<li>Appliquer 200 µL de solution d’anticorps cTnT à la longueur de la lame. Incuber les lames horizontalement O/N à 4 ° C, dans une chambre humidifiée.</li>
	<li>Laver les lames dans un bocal en verre Coplin contenant 50 mL de PBS 1 x à ta pendant 5 min, trois fois.</li>
	<li>Préparer la solution d’anticorps anti-rabbit-568 (1/500) en dilution 0,5 μL d’anticorps anti-rabbit-568 dans la solution d’ofblocking 250 μL dans un tube de 1,5 mL.</li>
	<li>Appliquer 250 µL de solution d’anticorps anti-rabbit-568 à la longueur de la lame. Incuber les lames horizontalement pendant 1 h à RT, dans une chambre humidifiée.</li>
	<li>Laver les lames dans un bocal en verre Coplin contenant 50 mL de PBS 1 x à ta pendant 5 min, trois fois.</li>
	<li>En option : Appliquer 250 µL de solution de travail DAPI à la longueur de la lame et incuber les lames horizontalement pendant 1 min à ta, abri de la lumière.</li>
	<li>Laver les lames dans un bocal en verre Coplin contenant 50 mL de PBS 1 x à ta pendant 5 minutes, deux fois.</li>
</ol>7. montage et imagerie
<ol><li>Monter les lames avec 2 à 3 gouttes de milieu de montage et une lamelle de verre. Laisser les lames sécher à plat, O/N, à 4 ° C, abri de la lumière.</li>
	<li>Passez à épifluorescence ou microscopie confocale.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

détection de transcription de miRNA est possible par le biais de différentes techniques qui varient dans la sensibilité, de spécificité et de puissance quantitative. Ici, nous démontrons l’accouplement de miRNA hybridation in situ avec immunostaining et décrire un protocole qui permet pour évaluer les niveaux d’expression des molécules de miRNA et protéine, sur les mêmes sections de coeur simultanée. Tout d’abord, nous montrons comment faire une hybridation in situ de creuser-étiquetée LNA miRNA sondes ...

micro-ARN (miARN) est courts (18 – 25 nucléotides), ARN monocaténaire, non codantes qui fonctionnent comme des régulateurs négatifs de l’expression des gènes au niveau post-transcriptionnel à inhiber la traduction de l’ARN messager (ARNm) et/ou promotion de dégradation de l’ARNm 1. miARN est transcrits d’introns ou des exons du codage ou non codantes des gènes et sont clivés dans le noyau par DROSHA, à précurseur miARN (pré-miARN), qui sont des structures de tige-boucle courte de 70 nucléotides2. Suite cytoplasmique à l’exportation, les pré-miARN est transformés par DICER en miARN matures qui s’étendent sur 18 – 25 nucléotides3,4. Par la suite, le complexe silencieux RNA-induced (RISC) intègre ces miARN comme ARN simple brin, qui permet leur liaison à la région 3' non traduite (3'-UTR) de leurs ARNm cible pour réprimer leur expression3,5 .
Dans les trois dernières décennies, puisqu’ils ont été d’abord identifiés, miARN ont émergé à maîtres régulateurs de l’expression des gènes, dont les niveaux d’expression sont étroitement contrôlé6. Rôles des miARN ont été décrits à l’orgue développement7,8,9,10,11,12, maintien de l’homéostasie du13,14 , ainsi que des contextes maladie qui incluent neurologiques15,16,17,18,19, cardiovasculaires20, maladies auto-immunes21 ,22et autres cancers23,2425. L’intérêt croissant pour la pertinence des modèles d’expression de miRNA a avancé la nécessité de méthodes de détection fiable des transcriptions de miRNA. Ces méthodes incluent PCR en temps réel, microarrays, Northern blot, hybridation in situ et autres, qui varient dans la sensibilité, la spécificité et la puissance quantitative, principalement dû au fait que miRNA transcriptions sont constituées de courtes et des séquences très homologues6.
Nous avons récemment rapporté un rôle important pour miRNA-182 dans le développement de l’hypertrophie myocardique26, une condition qui décrit l’adaptation structurelle du coeur en réponse aux demandes hémodynamiques élevé27,28. L’hypertrophie cardiaque se caractérise par l’augmentation de la masse myocardique, qui, si associé à retouche inadaptés29, peut conduire à un risque accru d’insuffisance cardiaque, une condition représentaient 8,5 % du total des décès attribuables aux cardiovasculaire 30de la maladie.
Nous décrivons ici notre protocole qui combine hybridation in situ avec une sonde (DIG) Locked Nucleic Acid (LNA) et les immuno-coloration pour la détection simultanée de miRNA et protéine molécules sur des sections de tissu de coeur de souris, digoxigénine marquée dans notre modèle de l’hypertrophie cardiaque.

<table><tbody><tr><td>Diéthylpyrocarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5758</td><td>DEPC</td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Tween-20</td> American <td>Bioanalytical</td><td>AB02038</td><td>tensioactif non ionique</td></tr><tr><td>Histoclear</td><td>National Diagnostics</td><td>HS-200</td><td></td></tr><tr><td>Protéinase K, recombinante, PCR Grade</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3115879001</td><td>ProK</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>PFA</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>ThermoFisher</td><td>S271</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium hexahydraté</td><td>ThermoFisher</td><td>M33</td><td>MgCl2</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6066</td><td></td>Solution d’acide</tr><tr><td>chlorhydrique, 1 N</td><td>ThermoFisher</td><td>SA48</td><td>HCl</td></tr><tr><td>Solution d’acide chlorhydrique, 12</td><td>N ThermoFisher</td><td>S25358</td><td>HCl</td></tr><tr><td>1-Methylimidazole</td><td>Sigma Aldrich</td><td>336092</td><td></td></tr><tr><td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&prime ;-chlorhydrate d’éthylcarbodiimide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>39391</td><td>EDC</td></tr><tr><td>Solution de peroxyde d’hydrogène H2O2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>216763</td><td>H2O2</td></tr><tr><td>Citrate trisodique dihydraté</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S1804</td><td>Citrate de sodium</td></tr><tr><td>miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE)</td><td>Qiagen</td><td>339450</td><td>scramble miRNA/U6 snRNA</td></tr><tr><td>miRCURY Sonde de détection</td><td>QIagen</td><td>YD00615701</td><td>5'-DIG et 3'-DIG marqué</td></tr><tr><td>Chlorhydrate de lévamisol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31742</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9647</td><td>BSA</td></tr><tr><td>NBT/BCIP Comprimés</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11697471001</td><td>NBT-BCIP</td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>ThermoFisher</td><td>P217</td><td>KCl</td></tr><tr><td>DAPI solution (1mg/ml)</td><td>ThermoFisher</td><td>62248</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>Lamelle en verre</td><td>ThermoFisher</td><td>12-545E</td><td>Couvre-objet en</td></tr><tr><td>verre Couvre-objet en plastique</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>HS40 22mmX40mmX0.25mm</td><td>Couvercle en plastique sans RNA-ase</td></tr><tr><td>Anti-Digoxigénine-AP, Fab fragments</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11093274910</td><td>Anticorps DIG</td></tr><tr><td>Stylo barrière hydrophobe</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td>Stylo Pap</td></tr><tr><td>Anti-Cardiaque Troponine T Anticorps</td><td>Abcam</td><td>ab92546</td><td>cTnT</td></tr> anticorps<tr><td>Anticorps secondaire à absorption croisée IgG (H+L) de chèvre, Alexa Fluor 568</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11011</td><td>anticorps anti-lapin-568</td></tr><tr><td>Milieu de montage à fluorescence Dako</td><td></td><td>S3023</td><td>Sérum</td></tr> de <tr><td>mouton</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3772</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Formamide désionisé</td><td>américain </td> Four de <td>bioanalyse AB00600</td><td></td></tr><tr><td>d’hybridation</td><td>ThermoFisher</td><td>UVP HB-1000 Hybridizer</td><td></td></tr></tbody></table>

tissu-spécifique mirna, profilage de l’expression à l’aide de la souris coeur sections en hybridation in situ

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

micro-ARN (miARN) est des transcriptions d’ARN simple brin qui se lient à des ARN messagers (ARNm) et inhibent leur traduction ou promouvoir leur dégradation. A ce jour, les miARN ont été impliqués dans un grand nombre de processus biologiques et la maladie, qui a signifié la nécessité pour les méthodes de détection fiable des transcriptions de miRNA. Nous décrivons ici un protocole détaillé pour digoxigénine marqués (DIG) Locked Nucleic Acid (LNA) miRNA basée sur sonde détection, combiné avec la protéine immunostaining sur des sections de coeur de souris. Tout d’abord, nous avons réalisé une technique hybridation in situ à l’aide de la sonde pour identifier l’expression miRNA-182 dans les sections de centre de contrôle et de la souris de l’hypertrophie cardiaque. Ensuite, nous avons effectué immunostaining cardiaque protéine troponine T (cTnT), sur les mêmes sections, de localiser co miRNA-182 avec les cellules cardiomyocytes. Utilisant ce protocole, nous avons pu détecter miRNA-182 à travers une phosphatase alcaline selon Dosage colorimétrique et cTnT par coloration fluorescente. Ce protocole peut être utilisé pour détecter l’expression de n’importe quel miRNA d’intérêt au moyen de sondes LNA creuser-étiqueté et expression de la protéine pertinentes sur des sections de tissu cardiaque souris.

hybridation de miRNA in situ a été optimisée sur des sections de coeur de souris à l’aide d’un scramble miRNA et U6-snRNA, qui ont servi de témoins positifs et négatifs respectivement. Une coloration positive est indiquée en bleu, tandis que la coloration négative est indiquée par le manque de développement de la couleur (Figure 1 a-1 b). Cardiomyocyte expression spécifique de miRNA-182 a été évaluée dans des sections de coeur de con...

micro-ARN (miARN) est des séquences d’ARN courts et très homologues, agissant comme organismes de réglementation post-transcriptionnelle des ARN messagers (ARNm). Les méthodes actuelles de détection de miRNA varient dans la sensibilité et la spécificité. Les auteurs décrivent un protocole qui combine l’hybridation in situ et immunostaining pour la détection simultanée de miRNA et protéine molécules sur des sections de tissu cardiaque souris.

Tissu-spécifique miRNA, profilage de l’Expression à l’aide de la souris coeur Sections en hybridation in Situ

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine des microARN, en fournissant des outils pour détecter la lcalisation relative des molécules de protéines et de microARN. Le principal avantage de cette technique est que vous pouvez détecter à la fois des molécules de protéines et de microARN à partir de la même section tissulaire. Ce protocole commence par une réhydratation des tissus montés sur diapositives.Réchauffez les toboggans à 60 degrés Celsius pendant 10 minutes dans le four d’hybridation. La paraffine devrait fondre visiblement. Ensuite, incubez les glissières dans un bocal coplin en verre contenant un agent de compensation disponible dans le commerce pendant 10 minutes.Fais ça deux fois. Ensuite, transférez les diapositives du lavage au lavage pour réhydrater les tissus. Une fois hydratés, incuber les tissus dans proteinase K solution de travail à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes.Pour enlever la proteinase K, lavez les glissières en 1x PBS deux fois. Maintenant, réparez les tissus. Tout d’abord, faire des réservoirs sur les diapositives à l’aide d’un stylo hydrophobe pour dessiner un cercle hydrofuge autour des préparations.Ensuite, appliquez 500

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Un débit élevé In situ</emMéthode d&#39;hybridation> pour caractériser les modes d&#39;expression d&#39;ARNm dans les fœtus de souris tractus urogénital

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