Réversion chimique des cellules souches pluripotentes humaines classiques à un état semblable au naïf avec une puissance améliorée de différenciation multilignée

La méthode LIF-3i ramène les cellules souches pluripotentes humaines conventionnelles à un état pluripotent plus primitif avec des caractéristiques biochimiques, transcriptionnelles et épigénétiques de l'épiblaste humain pré-implantatoire. Cette méthode améliore la fonctionnalité des cellules souches pluripotentes humaines conventionnelles en diminuant l'expression génique dirigée vers la lignée et en effaçant la variabilité interlignée de la différenciation dirigée couramment observée parmi les lignées hPSC indépendantes. En utilisant cette méthode, les cellules souches pluripotentes humaines chimiquement converties maintiennent une stabilité caryotypique et épigénomique après un passage prolongé, y compris au niveau des loci imprimés et peuvent être différenciées directement avec des efficacités améliorées sans nécessiter d'étape de re-amorçage.

La méthode LIF-3i ouvrira de nouvelles voies d'investigation dans la biologie du développement humain précoce et pourrait faire progresser la médecine régénérative en améliorant la différenciation des cellules souches pluripotentes humaines, le ciblage génique et la génération de chimères interspécifiques. Pour commencer le protocole, maintenez et développez des cellules souches pluripotentes humaines conventionnelles ou hPSC avec des caryotypes normaux validés dans des co-cultures avec un fibroblaste embryonnaire de souris ou un système de culture nourricière à base de MEF ou dans un système de culture sans nourriture. Préparez les nourrices MEF dans une assiette à six puits gélatinisée précédemment préparée au moins un jour avant le passage des cultures hPSC conventionnelles adaptées à LIF-5i.

Après que les cultures hPSC conventionnelles aient atteint environ 50% de confluence, remplacez le milieu de culture hESC standard par deux millilitres par puits de milieu Leukemia Inhibitory Factor 5i ou LIF-5i. Cultivez et maintenez les hPSC conventionnelles et les MEF jusqu'à deux jours dans LIF-5i dans un incubateur CO2. Changez le milieu LIF-5i quotidiennement pour les adapter à leur passage ultérieur et à la réversion stable en LIF-3i.

Pour les cultures conventionnelles sans nourrice, cultivez les hPSC dans LIF-5i uniquement pendant une nuit avant le passage le lendemain matin. Avant le passage, lavez les hPSC conventionnelles adaptées à LIF-5i une fois avec du PBS et ajoutez un millilitre de réactif de dissociation cellulaire dans chaque puits. Ensuite, incubez la plaque pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius dans un incubateur CO2.

Après l'incubation, triturez doucement les cellules avec une pipette dans une suspension cellulaire unique. Collectez la suspension cellulaire dans le milieu hESC dans au moins une dilution de deux dans un tube conique stérile de 15 millilitres et triturez doucement les cellules par pipetage pour obtenir une suspension cellulaire unique. Centrifugez les cellules à 300 g pendant cinq minutes.

Après la centrifugation, aspirez et jetez le surnageant et remettez en suspension le pellet cellulaire dans un à deux millilitres de milieu LIF-5i. Ensuite, comptez les cellules. Lavez la plaque MEF pré-plaquée à six puits deux fois avec deux millilitres de PBS par puits.

Distribuez une à deux fois 10 à la sixième puissance de cellules dans deux millilitres de milieu LIF-5i dans un puits d'une plaque MEF lavée au PBS. Placez la plaque dans un incubateur CO2. Le lendemain, faites doucement tourbillonner la plaque pour soulever toutes les cellules non attachées et aspirez le milieu et remplacez-le par deux millilitres de milieu LIF-5i.

Répétez cette étape quotidiennement pendant trois à cinq jours ou jusqu'à ce que les cellules soient à 60 à 70% de confluent. Ce protocole prend en charge une réversion rapide et massive de type naïf d'une large gamme de lignées de cellules souches pluripotentes embryonnaires humaines et induites tant que les préparations de cellules souches pluripotentes humaines avec une différenciation marquée ou des caryotypes anormaux sont méticuleusement exclues. Après l'adaptation initiale à LIF-5i, passez les cultures stables LIF-3i suivantes tous les trois à quatre jours dans un cabinet de sécurité biologique ou lorsque les cultures atteignent 60 à 70% de confluent.

Jetez le milieu de culture et lavez chaque puits des cultures LIF-5i-LIF-3i en ajoutant doucement deux millilitres de PBS. Jetez le PBS et ajoutez un millilitre de solution de détachement cellulaire. Incubez les cellules pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius dans un incubateur CO2.

Après l'incubation, collectez la suspension cellulaire, ajoutez du milieu hESC non traité dans une dilution de deux et triturez doucement les cellules par pipetage pour obtenir une suspension cellulaire unique. Transférez la suspension dans un tube conique stérile de 15 millilitres. Centrifugez les cellules à 300 g pendant cinq minutes puis aspirez et jetez le surnageant.

Remettez en suspension le pellet dans le milieu LIF-3i, puis comptez les cellules. Ensuite, plaquez deux fois 10 à la cinquième puissance de cellules par puits sur les MEF irradiés dans la plaque à six puits gélatinisée pour le passage de routine des cultures LIF-3i. Pour les cultures initialement adaptées à LIF-5i, placez une densité initiale plus élevée avant le premier passage dans les MEF LIF-3i.

Le passage N-hPSC pendant au moins quatre à sept passages de bulk continus dans le milieu LIF-3i avant l'utilisation de N-hPSC dans des études fonctionnelles ou la cryopréservation. Enregistrez le nombre de passages de N-hPSC dans des milieux conventionnels ou LIF-3i. Les colorations immunofluorescentes et les western blot ont détecté l'expression des isoformes activées phosphorylées et totales de STAT3 et Erk1/2, marqueurs clés de la pluripotence moléculaire.

Les colorations à l'hématoxyline et à l'éosine des microsections de tératome ont révélé une différenciation robuste dans les trois couches germinales avec des lignées d'ectoderme, de mésoderme et d'endoderme bien structurées. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de convertir efficacement les cellules souches pluripotentes humaines conventionnelles en masse à un état de type naïf en utilisant la méthode chimique universelle séquentielle LIF-5i à LIF-3i. Avant d'essayer ce protocole, il est important de commencer par une faible passation de lignées de cellules souches pluripotentes humaines conventionnelles qui se conforment aux caryotypes normaux.

Les cultures de cellules souches pluripotentes humaines conventionnelles devraient être principalement non différenciées et contenir peu de cellules spontanément différenciées avant de commencer. L'étape initiale et brève d'adaptation à LIF-5i améliore considérablement l'expansion clonale des cellules souches pluripotentes humaines conventionnelles et leur permet d'être ensuite converties de façon naïf avec LIF-3i seul en grandes quantités, évitant ainsi le besoin de sélectionner ou de sous-cloner des colonies rares de cellules souches pluripotentes humaines naïfs plus tard. L'optimisation supplémentaire de cette méthode chimique utilisant un inhibiteur de tankyrase dans des conditions de culture définies, sans nourrice et conformes aux BPF facilitera la génération efficace et cliniquement utile d'un large éventail de types cell