Name: Un modèle murin d’ostéogenèse Distraction (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-14T12:45:00.000+00:00
Duration: 4 min 24 s
Description: Découvrez un modèle murin d'ostéogenèse par distraction utilisant un distracteur sur mesure pour étudier la régénération osseuse. Cette méthode permet une analyse détaillée des mécanismes de guérison tissulaire.

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Les auteurs remercient Mme Makiko Kato pour fournir des encouragements pour compléter cette étude. Nous remercions également la Division des animaux d’expérimentation et recherche médicale Engineering, Nagoya University Graduate School of Medicine, le boîtier de la souris.

Toutes les expériences ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par le Comité de l’utilisation de notre institution et animalier. Stériliser tous les instruments avant la procédure.
1. préparation d’un moule pour créer le distracteur sur mesure
<ol><li>Faire deux anneaux incomplets (diamètre extérieur, 20 mm, diamètre intérieur, 10 mm), qui font partie de la distraction, avec une feuille de cire de paraffine (145 mm x 74 mm) à l’aide d’un sculpteur de cire Evans.<ol>
<li>Faire 4 des mêmes pièces. Utilisez une spatule cire chauffée avec un brûleur à gaz. Empiler les quatre anneaux pour une épaisseur de 5 mm. fournir l’espace pour la vis d’expansion et de l’aiguille et 8 x 2 mm 5 mm x 2 mm respectivement avec le sculpteur de cire Evans (Figures 1 a, 1 b).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incorporer des modèles en cire dans le matériau d’empreinte silicone et créer un moule pour les anneaux de résine (Figure 1C).</li>
	<li>Après durcissement du matériau d’empreinte silicone (environ 5 min à température ambiante), supprimer les modèles en cire.</li>
</ol>2. production du distracteur sur mesure
<ol><li>Appliquer la vaseline finement et uniformément au moule silicone. Mélanger 3 g de résine dentaire de polymérisation et verser immédiatement dans le moule silicone. La valeur pendant 5 min à température ambiante (RT).</li>
	<li>Retirer la bague résine polymérisée du moule et polir avec un bar de carbure et d’un micromoteur dentaire pour enlever la bavure (environ 1 min). Deux anneaux de résine est requises pour chaque distracteur sur mesure.<ol>
<li>Répétez la procédure pour créer le nombre requis de segments de résine (Figure 1D).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Laissez un espace d’environ 2 mm, à fixer les anneaux de résine avec de la cire utilitaire et sécurisé de l’extérieur de la vis d’expansion complètement avec de la résine transparente. La valeur de la résine pendant 5 min à température ambiante. Lorsque la polymérisation est terminée, retirez le bouton à vis expansion (Figure 1E).</li>
</ol>3. Protocole chirurgical
<ol><li>Utilisez la souris mâles de 8 semaines.</li>
	<li>Induire l’anesthésie avec une injection intrapéritonéale de la médétomidine chlorhydrate à 0,3 mg/g, le midazolam à 4 mg/kg et butorphanol tartrate à 5 mg/kg de poids corporel.<ol>
<li>Rasez soigneusement et désinfecter la zone chirurgicale avec la solution d’iode 10 % ensuite administrer 0,5 % du chlorhydrate de lidocaïne à la jambe droite.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Faire une incision longitudinale de la peau (environ 15 mm de longueur) à droite bas de la jambe avec un bistouri n ° 15. Carrément séparer les muscles sous-jacents, en prenant soin de ne pas pour enlever tous du périoste. L’approche de l’extérieur pour rejoindre facilement le péroné. Coupez le péroné avec des ciseaux.</li>
	<li>Saisir la cheville avec une pince stérile mince étroite et utiliser une aiguille stérile de 27 G pour faire un trou dans l’os du talon d’environ 5 mm. L’aiguille doit pénétrer la peau, des os et la peau dans cet ordre. L’aiguille pénètre, couper la pointe et la racine avec une pince afin que l’aiguille est d’environ 15 mm.<ol>
<li>Faire un autre trou de la même manière, environ 2 – 3 mm proximaux. Organiser autour de la cheville et passez deux aiguilles 25 G sous le genou de la même manière. Après que les aiguilles pénètrent, couper les pointes et les racines avec une pince (Figure 1F).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placez le distracteur sur mesure telles qu’il soit parallèle à la direction de l’extension. Fixer les aiguilles et l’appareil assez résine dentaire de polymérisation pour remplir les rainures de l’appareil. Attendre que la polymérisation à compléter (environ 5 min) (Figure 1G).</li>
	<li>Veillez à ne pas endommager les tissus environnants. Couper au milieu de la diaphyse du tibia à l’aide d’un disque de coupe très mince tout en appliquant une solution saline (1 à 2 mL).</li>
	<li>Refermer la plaie avec une suture en nylon de 4-0.</li>
	<li>Donner des injections sous-cutanées de la buprénorphine (0,1 mg/kg) pour l’analgésie immédiatement après l’opération. Continuer la buprénorphine chaque 12 h par jour postopératoire 7 et si nécessaire, par la suite.</li>
</ol>4. Protocole de distraction
Remarque : Il existe différents rapports sur le taux de distraction et de la période de latence, mais ici, les protocoles représentant sont indiqués.
<ol><li>Après une période de latence de 5 jours, commencez la distraction à un taux de 0,2 mm/12 h. Pour l’extension, utilisez la partie pointue attachée à la vis d’expansion rapide. Déplacer la broche dans le sens de la flèche jaune, attaché à la vis de prolongation (Figure 1E).</li>
	<li>L’anesthésie n’est pas nécessaire durant l’extension. Tenir la queue avec le petit doigt et de palmiers et accrocher le dispositif d’extension avec l’index et le pouce.</li>
	<li>Effectuer l’extension (0,2 mm pour 1/4 de tour). Continuer l’allongement pendant 8 jours, qui se traduira par un déficit total de 3,2 mm.</li>
</ol>5. analyse
<ol><li>Analyse de la radiographie : à l’issue de la prolongation, évaluer la régénération osseuse avec la tomographie par ordinateur sous anesthésie générale par l’isoflurane de 2,0 %. Remarque : Si le soin a été apporté en ce qui concerne la position de l’appareil d’extension, il est possible de l’évaluer avec radiographie simple même lorsque le dispositif est attaché.</li>
	<li>L’analyse histologique : soigneusement éloigner l’appareil de manière à ne pas provoquer un site de distraction de fracture lors de l’échantillonnage. Fixer l’échantillon dans 10 % de formol tamponné neutre pendant 24 h à température ambiante. Détartrer la cafetière avec une solution de Morse (citrate de sodium 10 %, 20 % d’acide formique) durant la nuit à 4 ° C.</li>
</ol>

<ol><li>Watson, J. T. <a target="_blank" href="https://journals.lww.com/jaaos/Fulltext/2006/00001/Distraction_Osteogenesis.37.aspx">Distraction osteogenesis.</a> The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 14, 168-174 (2006).</li>
<li>Ilizarov, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tension-stress+effect+on+the+genesis+and+growth+of+tissues%3A+Part+II.+The+influence+of+the+rate+and+frequency+of+distraction%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Orthopaedics+and+Related+Research%22%5BJournal%5D)">The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues: Part II. The influence of the rate and frequency of distraction.</a> Clinical Orthopaedics and Related Research. 239, 263-285 (1989).</li>
<li>Wan, C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18184809">Activation of the hypoxia-inducible factor-1 alpha pathway accelerates bone regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 686-691 (2008).</li>
<li>Fujio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cell-derived+factor-1+enhances+distraction+osteogenesis-mediated+skeletal+tissue+regeneration+through+the+recruitment+of+endothelial+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Stromal cell-derived factor-1 enhances distraction osteogenesis-mediated skeletal tissue regeneration through the recruitment of endothelial precursors.</a> Bone. 49 (4), 693-700 (2011).</li>
<li>Tong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+adhesion+kinase+expression+during+mandibular+distraction+osteogenesis%3A+evidence+for+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+reconstructive+surgery%22%5BJournal%5D)">Focal adhesion kinase expression during mandibular distraction osteogenesis: evidence for mechanotransduction.</a> Plastic and reconstructive surgery. 111 (1), 211-222 (2003).</li>
<li>Rhee, S. T., El-Bassiony, L., Buchman, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+signal-+related+kinase+and+bone+morphogenetic+protein+expression+during+distraction+osteogenesis+of+the+mandible%3A+in+vivo+evidence+of+mechanotransduction+mechanism+for+differentiation+and+osteogenesis+by+mesenchymal+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+reconstructive+surgery%22%5BJournal%5D)">Extracellular signal- related kinase and bone morphogenetic protein expression during distraction osteogenesis of the mandible: in vivo evidence of mechanotransduction mechanism for differentiation and osteogenesis by mesenchymal precursor cells.</a> Plastic and reconstructive surgery. 117 (7), 2243-2249 (2006).</li>
<li>Isefuku, S., Joyner, C. J., Simpson, A. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11062353">A murine model of distraction osteogenesis.</a> Bone. 27 (5), 661-665 (2000).</li>
<li>Tay, B. K., Le, A. X., Gould, S. E., Helms, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemical+and+molecular+analyses+of+distraction+osteogenesis+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Histochemical and molecular analyses of distraction osteogenesis in a mouse model.</a> Journal of Orthopaedic Research. 16 (5), 636-642 (1998).</li>
<li>Carvalho, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+angiogenesis+in+a+murine+tibial+model+of+distraction+osteogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">The role of angiogenesis in a murine tibial model of distraction osteogenesis.</a> Bone. 34 (5), 849-861 (2004).</li>
<li>Osawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+FGFR3+promotes+bone+formation+via+accelerating+endochondral+ossification+in+mouse+model+of+distraction+osteogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Activated FGFR3 promotes bone formation via accelerating endochondral ossification in mouse model of distraction osteogenesis.</a> Bone. 105, 42-49 (2017).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Lorsqu’il est un grand animal est utilisé comme modèle expérimental, un dispositif d’extension prêtes à l’emploi peut être utilisé, et il est facile d’obtenir la bonne fixation et évaluer le fonctionnement de l’extension elle-même et le montant de l’extension. Toutefois, lorsqu’une souris est utilisée comme modèle expérimental, il est nécessaire de développer tout ou partie de l’équipement. Isefuku et coll. et Tay et coll. fait l’appareil et créé un modèle de souris7,<...

Ostéogenèse distraction (DO) est une méthode de traitement établi pour une variété de troubles squelettiques, comme les différences de longueur de branche, défauts osseux et limb difformités1. Cette stratégie de traitement unique repose sur le « principe de tension-tension » proposé par Ilizarov. La méthode nécessite plusieurs jours pour plusieurs mois pour la consolidation de latence et plusieurs semaines de distraction active jusqu'à ce que l’os mature est formé de2.
Les conditions locales hypoxiques en raison du blocage des flux de sang3,4 et une stimulation mécanique5,6 sont particulièrement importantes dans le processus de guérison de DO. Angiogenèse induite par l’hypoxie transporte l’oxygène, de nutriments, de facteurs solubles et de cellules nécessaires à la réparation des tissus localement par le biais de la circulation sanguine. Une stimulation mécanique de l’opération d’extension entraîne des réactions biologiques tels que la différenciation des cellules souches mésenchymateuses, la formation osseuse, la calcification et le remodelage. Série traitement permet la formation de non seulement les tissus durs, mais aussi les tissus mous, y compris les nerfs, les muscles, les vaisseaux sanguins et les tissus de la peau, sans la nécessité d’une greffe de cellules souches. Par conséquent, un modèle est considéré comme un excellent modèle pour l’analyse de la régénération des tissus différents.
Lapins et chiens sont les animaux les plus utilisés dans la recherche fondamentale pour DO ; Cependant, il y a quelques outils d’analyse disponibles pour ces animaux. L’utilisation d’un modèle de souris facilite une analyse plus détaillée. Il est particulièrement approprié pour les expériences utilisant des souris knock-out. Toutefois, lorsque vous utilisez une souris comme un animal expérimental, un dispositif d’extension doit être créé. Ici, nous présentons une souris tibiale modèle développé à l’aide d’un distracteur sur mesure créé à l’aide d’un outil de laboratoire dentaire et de la technique, qui a été utilisé dans une étude antérieure.

<table><tbody><tr><td>Cire de paraffine</td><td>YAMAHACHI DENTAL MFG. CO.</td><td>-</td><td>Pour la préparation d’un moule pour anneaux en résine</td></tr><tr><td>Labocone putty</td><td>GC</td> <td>Corporation-Pour</td> <td>la préparation d’un moule pour anneaux en résine</td></tr><tr><td>Cire utilitaire</td><td>GC</td> <td>Corporation-Pour</td> <td>la préparation d’un moule pour anneaux en résine</td></tr><tr><td>Vis d’expansion</td><td>Ortho Dentaurum</td><td>600-301-30</td><td>Composant du distracteur sur mesure</td></tr><tr><td>Unifast III</td><td>GC Corporation</td><td>-</td><td>Résine de polymérisation immédiate Composant du distracteur sur mesure</td></tr><tr><td>Ortho Crystal</td><td>NISSIN-Résine</td><td></td> <td>transparente Composant du distracteur sur mesure</td></tr><tr><td>Aiguille 25 G</td><td>TERUMO</td><td>NN-2516R</td><td>Pour distracteur sur mesure</td></tr><tr><td>Aiguille 27 G</td><td>TERUMO</td><td>NN-2719S</td><td>Pour distracteur sur mesure</td></tr><tr><td>Souris ICR</td><td>Chubu Kagaku Shizai</td> <td>Corporation-Experimental</td><td> animal</td></tr><tr><td>Somnopentyl</td><td>Kyoritsu</td> Seiyaku-Pentobarbital <td></td><td>sel de sodium</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>099-06571</td><td>Solution d’inhalation d’isoflurane</td></tr></tbody></table>

un modèle murin d’ostéogenèse distraction

A Mouse Distraction Osteogenesis Model

Ostéogenèse distraction (DO) est une intervention chirurgicale qui consiste à la régénération des tissus squelettiques sans greffe de cellules. Un modèle comprend trois phases : la phase de latence après ostéotomie et placement du distracteur externe ; la phase de distraction, dans lequel les extrémités osseuses séparées sont progressivement et continuellement distraits ; et la phase de consolidation. Ce distracteur sur mesure utilisée pour DO se compose de deux anneaux incomplets de résine acrylique et une vis d’expansion. Le processus a été initié en faisant un moule avec le matériau d’empreinte silicone et puis en créant le distracteur sur mesure. Résine dentaire a été coulé dans le coffrage en matériau d’empreinte silicone, et il a été autorisé à se polymériser pour créer les bagues résine incomplète requis pour le distracteur sur mesure. Ces anneaux ont été fixées par une vis d’expansion à l’aide de résine transparente. Le distracteur sur mesure créé par l’intermédiaire de cette approche était attaché sur le tibia de souris. Le tibia a été fixé à l’appareil à l’aide d’une paire d’aiguilles 25 G dans la partie proximale, une paire d’aiguilles 27 G dans la partie distale et de résine acrylique. Après une période de latence de 5 jours, distraction a été initiée à un taux de 0,2 mm/12 h. L’allongement a été poursuivi pendant 8 jours, ce qui entraîne un déficit total de 3,2 mm. Les souris ont été euthanasiées 4semaines après distraction. La formation osseuse dans l’espace de distraction a été confirmée à l’aide de la radiographie et l’histologie.

Figures 1 a et 1 b présentent des anneaux incomplets (extérieur diamètre, 20 mm intérieur diamètre, 10 mm ; épaisseur 5 mm) avec de la cire de paraffine. Deux modèles en cire ont été incorporées dans le matériau d’empreinte silicone et un moule pour les anneaux de résine (Figure 1C) a été formé. Résine polymérisée a été immédiatement coulé dans ce moule, et anneaux de résine ont été obtenus (<strong class="xf...

Nous présentons un souris tibial distraction ostéogénèse modèle développé à l’aide d’un distracteur sur mesure. L’utilisation d’une souris comme une cible d’analyse est avantageuse pour faire avancer la recherche.

Un modèle murin d’ostéogenèse Distraction

Distraction osteogenesis (DO) is a surgical procedure that involves skeletal tissue regeneration without cell transplantation. A DO model consists of the ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de la régénération des tissus durs et mous. Le principal avantage de cette technique est que l’utilisation d’une souris permet une analyse détaillée de la régénération osseuse. Commencez par une souris adulte entièrement anesthésiée.Raser et désinfecter soigneusement la zone chirurgicale avec une solution à 10% d’iode. Ensuite, administrer 0,5% d’hydrochlorure lidocaïne au membre inférieur droit. Puis, après avoir fait une incision longitudinale de la peau de 15 millimètres à la jambe inférieure droite avec un scalpel numéro 15, séparer brutalement les muscles sous-jacents, en prenant soin de ne pas enlever tout périoste.Ensuite, coupez le péroné avec des ciseaux. Saisissez la cheville avec des forceps étroits et minces, et utilisez une aiguille de calibre 27 pour faire un trou dans l’os, à environ cinq millimètres du talon. L’aiguille doit pénétrer dans la peau, l’os et la peau dans cet ordre.Lorsque l’aiguille pénètre complètement, couper la pointe et la racine à l’aide d’une pince de sorte que l’aiguille est d’environ 15 millimètres. Faire un autre trou de la même manière, environ deux à trois millimètres proximaux. Ensuite, tenez autour de la cheville, et passez une aiguille de calibre 25 sous le genou de la même manière.Après que l’aiguille pénètre, couper la pointe et la racine à l’aide d’un pincement. Faire un autre trou de la même manière, environ deux à trois millimètres distal. Placez le distrayant sur mesure de telle sorte qu’il soit parallèle à la direction d’extension.Fixez les aiguilles et l’appareil avec suffisamment de résine dentaire de polymérisation pour remplir les rainures de l’appareil. Attendez que la polymérisation se termine, ce qui devrait prendre environ cinq minutes. Puis, tout en prenant soin de ne pas endommager les tissus environnants, couper le milieu de la diaphyse du tibia à l’aide d’un disque de coupe très mince tout en appliquant une solution saline.Fermez la plaie avec une suture en nylon 4-0. Donnez des injections sous-cutanées de buprénorphine pour l’analgésie immédiatement après la chirurgie. Il existe divers rapports sur la période de latence et le taux de distraction, mais ici, des protocoles représentatifs sont affichés.Après une période de latence de cinq jours, commencer la procédure de distraction. Pour l’extension, utilisez la goupille attachée à la vis d’expansion rapide. Déplacez la goupille dans la direction de la flèche jaune fixée à la vis d’extension.Tenez la queue avec le petit doigt et la paume, et fixez le dispositif d’extension avec l’index et le pouce. Effectuez l’extension en déplaçant la goupille dans la direction de la flèche jaune de 0,2 millimètre pour un quart de tour. Continuer à allonger à la vitesse de 0,2 millimètre toutes les 12 heures pendant huit jours, ce qui se traduira par un écart total de 3,2 millimètres.Cette image montre les résultats typiques de radiographie à quatre semaines après distraction dans le modèle. L’os nouvellement formé est vu au site de distraction. Des résultats de coloration d’hématoxyline et d’éosine sont vus ici.Un pont d’os nouvellement formé a été observé, et l’os nouvellement formé pourrait être facilement distingué de l’os indigène. Nous avons présenté un modèle do tibial de souris développé à l’aide d’un distrayant sur mesure. L’utilisation d’un modèle DO de souris facilite une analyse plus détaillée.Il est particulièrement approprié pour les expériences utilisant des souris KNOCK-OUT.

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