Name: In Vivo Photomarquage des cellules dans le côlon pour évaluer le potentiel migratoire des cellules hématopoïétiques chez les souris néonatales (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-10T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Découvrez le photomarquage in vivo des cellules du côlon chez les souris néonatales pour étudier le trafic des cellules hématopoïétiques vers les sites extra-intestinaux. Cette technique révèle les interactions hôte-microbiome.

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Nitya Jain a été soutenu par une bourse de Transition de carrière de NIH/NIAID 1K22AI116661-01.

Toutes les procédures d’animaux ont été effectués avec l’approbation d’et dans le respect de l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) au Massachusetts General Hospital.
ATTENTION : Ce protocole implique l’utilisation d’un laser de classe 3 b (LG3). Lunettes de protection laser LG3 doivent toujours être utilisés lors de l’utilisation de ce laser. Des directives appropriées de formation et de la sécurité doivent être respectées pour éviter les risques de blessures.
1. conception et montage de Laser
<ol><li>Raccorder la diode électroluminescente (LED) (405 nm, 19,3 mW, 1400 mA, couplé fibre) la LED driver via le câble de connecteur M8 4 broches qui vient est attaché à la LED. Bien serrer la vis pour fixer la connexion.</li>
	<li>Avant de raccorder le câble de raccordement d’optogenetics à la LED, tenir le connecteur d’ouverture de la LED à la lumière pour s’assurer il y a aucun obstacle visible. Coup sur le trou pour éliminer tout obstacle si nécessaire et insérer le câble de raccordement d’optogenetics dans l’ouverture.</li>
	<li>Connectez la canule de fibre optique pour le câble de raccordement optogenetics en y insérant la canule ou l’autre extrémité du manchon connecteur. Raccordez l’autre extrémité du manchon connecteur pour le câble de raccordement.  Appliquer la pression nécessaire pour sécuriser la connexion, mais veillez à ne pas plier ou casser la fibre optique dans la canule. Remarque : La canule de fragiles fibre optique est couvert avec le capuchon de protection chaque fois que le laser n’est pas en cours d’utilisation.</li>
	<li>Le mode d’onde continue (CW) avec la molette de réglage en continu à 0 et la limite actuelle fixée à 1,2 A. la valeur du pilote de LED</li>
</ol>2. Photoconversion de cellules dans le côlon
Remarque : Les souris mâles et femelles ont été exposées à la colique 405 nm lumière 1-2 jour (s) après leur naissance et ont été sacrifiés avant 1 semaine d’âge.
<ol><li>Sécuriser un endroit sombre avec un accès à une prise électrique. Branchez le conducteur de LED. Remarque : Cette procédure est effectuée dans la lumière blanche minime, car une exposition prolongée des souris à la lumière ambiante peut-être causer une photoconversion non désirée des cellules. La lumière rouge est utilisée comme une alternative. ATTENTION : L’étape suivante implique l’utilisation d’un anesthésique animal. L’administration de l’anesthésie se déroule sous une hotte de classe II ou en utilisant un autre système de nettoyage approprié. L’inhalation de l’anesthésique peut causer des étourdissements, somnolence ou même l’inconscience.</li>
	<li>Anesthésier la souris par l’exposition à l’isoflurane 4-5 % à 100 % d’O2 dans une boîte d’induction. Vérifiez la bonne profondeur de l’anesthésie en pinçant fermement une patte arrière (pas de réponse). Maintenir l’anesthésie par un cône de nez à environ 2 % isoflurane. Éviter l’exposition des gestionnaire d’isoflurane par utilisation d’une hotte appropriée ou un anesthésique périphérique antiradicalaire.</li>
	<li>Positionnez la souris anesthésiée pour l’exposition de colique en utilisant 1 main à la peau du cou au dos de la souris doucement avec le pouce et l’index. Retourner la souris afin d’exposer l’abdomen. Desserrer l’étau si la souris commence à perdre sa couleur rose ou si son rythme de la respiration commence à ralentir. Fixer la queue de la souris entre l’anneau et les petits doigts.</li>
	<li>Avec l’autre main, retirez le capuchon protecteur de la canule. Tout en conservant l’axe long de la canule parallèle à la ligne médiane de la souris, introduire doucement la canule de fibre optique à travers l’anus dans le côlon afin que tous les 5 mm de la fibre optique sont à l’intérieur de la souris. Remarque : Cette procédure est effectuée lentement et avec soin à ne pas perforer la paroi du côlon. Minutes en remuant et le vrillage de la canule facilite l’avancement dans le côlon.</li>
	<li>Enfiler les lunettes de sécurité et augmenter le laser actuel à la valeur maximale (tout le chemin vers la droite). Confirmer la présence de la lumière UV en regardant l’abdomen translucide de la souris. Remarque : Les lunettes de protection laser LG3 diminuent considérablement la visibilité. Avoir un collègue (équipement de protection usure) aider à enfiler les lunettes et allumer le laser.</li>
	<li>Exposer le côlon à la lumière du laser pour un total de 2 min. Retirer la canule de 1 mm environ toutes les 30 s pour maximiser la zone luminale exposée à la lumière. À la fin de 2 min, éteindre le laser.</li>
	<li>Retirez lentement la canule de la souris. Après avoir récupéré de l’anesthésie dans une cage vide chaude, retourner la souris à la cage.</li>
</ol>3. isolement des Lymphocytes intestinaux
<ol><li>Préparer 1 L de tampon de sérum (HBSS/CS) de Hank Balanced Salt Solution/veaux, 200 mL de tampon de bande épithéliales, 500 mL de lavage médias et 200 mL d’acide tétraacétique (EDTA)-lavage médias libres. Remarque : Les volumes de réactifs sont calculés pour un échantillon de taille 9.<ol>
<li>Faire le tampon HBSS/CS (HBSS ; CS 5 %) en ajoutant 50 mL de CS à 950 mL de HBSS. Conservez-le sur glace.</li>
		<li>Préparer le tampon bande épithéliales [HBSS CS 5 % ; 1 mM le dithiothréitol (DTT) ; 5 mM EDTA ; 15 mM 4-(2-Hydroxyethyl) pipérazine-1-ethanesulfonic acide (HEPES) (pH 7,2 à 7,5)] en ajoutant 10 mL de CS, 200 µL de TNT, 2 mL d’EDTA 0,5 M et 3 mL d’un tampon HEPES 1 M 1 M à 185 mL du HBSS. Placer le tampon bande épithéliales dans un bain-marie à 37 ° C.</li>
		<li>Faire le support de lavage (1 % CS, HBSS ; 1 mM EDTA) en ajoutant 5 mL de CS et 1 mL d’EDTA 0,5 M à 494 mL de HBSS. Conserver à température ambiante.</li>
		<li>Préparer les médias de lavage sans EDTA (HBSS ; CS 1 % ; 15 mM HEPES) en ajoutant 2 mL de CS et 3 mL de 1 M HEPES à 195 mL de HBSS. Conserver à température ambiante.</li>
		<li>Faire un tampon de FACS [1 x en solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (pH = 7,2) ; CS 2 %] en ajoutant 10 mL de CS à 490 mL de PBS. Conservez-le sur glace.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparer le plat de collection de tissu en plaçant une passoire de cellule 70 µm à l’intérieur d’une boîte de Petri de 60 x 10 mm. Ajouter 10 mL de tampon HBSS/CS (HBSS ; 5 % un tampon CS effectuée à l’étape 3.1.1 et stockés sur la glace) pour le plat et placez-le sur la glace.</li>
	<li>Euthanasier la souris via une surdose d’isoflurane inhalé à l’aide de nettoyage appropriés de l’anesthésique (une exposition d’environ 3 min à > isoflurane 4 % dans l’air ambiant ou à 100 % de O2). Après un arrêt apparent de la respiration et mouvement-reflex, vérifier l’absence de douleur profonde en pinçant fermement une patte arrière (à l’aide de forceps est recommandé). S’assurer que l’euthanasie via une décapitation en utilisant une paire de ciseaux chirurgicaux ou un nouveau rasoir. Remarque : La dislocation cervicale n’est pas recommandée pour cette étape en raison de la taille et l’âge de l’animal. Ces méthodes sont compatibles avec les orientations de AVMA 2013 sur l’euthanasie et approuvés par l’IACUC MGH.</li>
	<li>Récolter le côlon à l’aide de ciseaux et pinces propres à ouvrir l’abdomen. Refléter les intestins sur 1 côté de l’abdomen de la souris pour exposer le côlon. Retirer le côlon tout en premier ensuite il juste distale (vers l’anus) pour le caecum. Puis, tout en tenant fermement le côlon avec une pince, utiliser des ciseaux pour couper à travers l’urètre au rectum. Couper le côlon comme à proximité de l’anus que possible. Récolter la rate après avoir enlevé le côlon (voir étapes 4.1-4.2 ci-dessous). Remarque : Alors que le protocole de photoconversion cible uniquement environ 25 % du côlon du nouveau-né (5 mm de la canule de fibre optique), tout le côlon est récolté afin d’aider à l’isolement cellulaire.</li>
	<li>Nettoyer le côlon à l’aide de pinces à pousser le contenu hors du côlon et sur une serviette en papier sec. Homogénéiser le tissu en utilisant des lames de rasoir pour hacher finement le côlon en une pâte sur le couvercle d’une boîte de Petri et puis transférer cette pâte à la crépine de la cellule dans la boîte de Pétri.</li>
	<li>Ajouter un propre 8 mm long magnétique à la crépine et placer le plat sur une plaque de 9 broches agitateur magnétique. Régler la vitesse de bar agitation magnétique à 800 tr/min et incuber les cellules pendant 5 min à température ambiante. Jeter le tampon et répéter le lavage à l’aide de 10 mL de HBSS/CS (le HBSS, tampon de CS 5 % effectuée à l’étape 3.1.1 et stockés sur la glace). Jeter le tampon à la fin du cycle de lavage.</li>
	<li>Dissocier les cellules épithéliales en ajoutant 10 mL de tampon préchauffée bande épithéliales (le HBSS ; 5 % CS ; 1 millimètre DTT ; 5mM EDTA ; un tampon HEPES [pH 7,2 à 7,5] 15mM qui a été fait à l’étape 3.1.2 et stocké dans un bain-marie à 37 ° C) à la crépine de la cellule et remuez à 800 tr/min pendant 30 min dans un 3 Incubateur de 7 ° C. À la fin de l’incubation, transférer le tampon enrichi dans la fraction épithéliale dans un tube propre de 15 mL. Remarque : L’épithélium et cellules associées (cellules épithéliales intestinales et les lymphocytes épithéliales intestinales) sont libérées dans la mémoire tampon, tandis que les cellules dans la intact lamina propria restent sur le tamis de la cellule au cours de cette étape11.<ol>
<li>Centrifuger la fraction épithéliale intestinale (intraépithéliaux) enrichie à 700 x g pendant 5 min à température ambiante. Jeter le surnageant et Resuspendre le culot dans 1 mL de tampon de FACS. Le stocker sur la glace pour une utilisation à l’étape 3.15.</li>
	</ol></li>
	<li>Laver la fraction de la lamina propria dans la crépine de la cellule 2 x avec HBSS/CS. Pour ce faire, ajouter 10 mL de solution HBSS/CS (HBSS ; tampon de CS 5 % qui a été faite à l’étape 3.1.1 qui a été stockée sur glace) à la crépine de la cellule et remuez-le à 800 tr/min pendant 5 min dans un incubateur à 37 ° C. Jeter le tampon après chaque lavage.</li>
	<li>Laver l’échantillon 2 x dans les médias de lavage. Ajouter 10 mL de lavage médias (HBSS ; 1 % CS, tampon de EDTA 1 mM qui a été fait à l’étape 3.1.3 et stocké à température ambiante) à la crépine de la cellule et remuez-le à 800 tr/min pendant 15 min dans un incubateur à 37 ° C. Jeter le tampon après chaque lavage.<ol>
<li>Après avoir utilisé les médias de lavage, le stocker sur la glace pour l’utiliser à l’étape 3.14.</li>
	</ol></li>
	<li>Laver l’échantillon 2 x avec HBSS/CS. Ajouter 10 mL de tampon HBSS/CS (HBSS ; tampon CS 5 % effectuée à l’étape 3.1.1 qui a été stockée sur glace) à la crépine de la cellule et remuez-le à 800 tr/min pendant 5 min dans un incubateur à 37 ° C. Jeter le tampon après chaque lavage.</li>
	<li>Incuber le tissu dans le tampon de lavage sans EDTA. Ajouter 10 mL de tampon de lavage sans EDTA (un tampon HEPES 15 mM qui a été fait à l’étape 3.1.4 et stocké à température ambiante, HBSS ; CS 1 %) à la crépine de la cellule et incuber la plaque pendant 10 min à température ambiante sans remuer. Jeter le tampon à la fin de cette étape.</li>
	<li>Laver l’échantillon 2 x avec HBSS/CS et préparer la solution d’enzyme. Ajouter 10 mL de HBSS/CS (HBSS, tampon de CS 5 % effectuée à l’étape 3.1.1 qui a été stockée sur glace) de la mémoire tampon à la crépine de la cellule et remuez-le à 800 tr/min pendant 10 min dans un incubateur à 37 ° C. Jeter le tampon après chaque lavage.<ol>
<li>Préparer la solution d’enzyme (sans EDTA laver tampon ; 0,1 mg/mL DNase I ; collagénase 167 mg/mL) pendant la deuxième période de lavage : ajouter 9 mg de DNase I et 15 mg de collagénase lyophilisée pour 90 mL d’EDTA-free laver tampon. Conserver la solution à température ambiante.</li>
	</ol></li>
	<li>Digérer la fraction de la lamina propria contenue dans la crépine de la cellule pour obtenir des lymphocytes (LPLs) de la lamina propria . Ajouter 10 mL de la solution d’enzyme (l’EDTA exempt de tampon de lavage ; 0,1 mg/mL DNase I ; 167 mg/mL de tampon de collagénase effectuée à l’étape 3.12.1 et stockés à température ambiante) à la crépine de la cellule et remuez-le à 800 tr/min pendant 45 min dans un incubateur à 37 ° C. NOTE : LPLs sont libérées dans la solution après digestion enzymatique.<ol>
<li>Recueillir la solution enzymatique contenant les cellules et la filtrer à travers un tamis de cellules nouvelles dans un tube conique de 50 mL.</li>
	</ol></li>
	<li>Ajouter 20 mL de support de lavage à froid (le HBSS ; CS 1 % ; EDTA 1mM tampon fait à l’étape 3.1.3 et stockée sur glace à l’étape 3.9.1) aux cellules filtrées pour bloquer l’activité de la collagénase dans la solution d’enzyme. Centrifuger le tube à 700 x g pendant 6 min à température ambiante. Jeter le surnageant et Resuspendre le culot contenant LPLs dans 1 mL de tampon de FACS.</li>
	<li>Combiner la Lei (de l’étape 3.7.1) et les fractions LPL (de l’étape 3.14) et leur tache avec l’anticorps conjugué fluorescent pour la cytométrie (voir étape 5). NOTE : IEL et LPL fractions peuvent être colorées séparément si vous désirez informations compartiment.</li>
</ol>4. isolement des Lymphocytes de la rate
<ol><li>Préparer le tube de prélèvement en ajoutant 500 µL de tampon de FACS dans un tube de microcentrifuge. Le stocker sur la glace.</li>
	<li>Après avoir enlevé le côlon (étape 3.4), la rate toute la récolte et le placer dans le tube de prélèvement. Stocker le tissu sur la glace.</li>
	<li>À l’aide d’un homogénéisateur tissu électrique, homogénéiser la rate dans un tube de microcentrifuge pendant environ 1 min. Centrifuger l’échantillon à 300 g [micro centrifugeuse] pendant 5 min à température ambiante et aspirer hors le surnageant.</li>
	<li>Effectuer la lyse des globules rouges en resuspendant l’échantillon dans 500 µL de tampon de lyse (ACK) de chlorure d’ammonium-potassium à déclencher la mort cellulaire par lyse osmotique. Laisser l’échantillon à incuber 1 à 2 min à température ambiante et ensuite il resuspendre dans 725 µL de tampon de FACS.</li>
	<li>Centrifuger l’échantillon à 300 g [micro centrifugeuse] pendant 5 min à température ambiante et aspirer hors le surnageant. Resuspendre le culot dans 500 µL de tampon de FACS et filtrez-le à travers une passoire de cellule de 40 µm dans un nouveau tube de microcentrifuge. Transférer la totalité de l’échantillon dans un tube de microcentrifuge nouvelle et souiller avec l’anticorps conjugué fluorescent pour la cytométrie (voir étape 5).</li>
</ol>5. identification de Dendra-r+ des cellules à l’aide de Flow Cytometry
<ol><li>Centrifuger les échantillons IEL/LPL et rate à 300 g [micro centrifugeuse] pendant 5 min à température ambiante et aspirer hors le surnageant.</li>
	<li>Remettre en suspension les pellets dans 100 µL d’anticorps mix de coloration. Préparer l’anticorps souillant le mélange en ajoutant 1 µL d’anticorps anti-CD45 conjugué fluorescent à 100 µL de tampon de FACS par échantillon. Remarque : Il est important titrer les anticorps utilisés pour la cytométrie en flux avant l’expérience pour déterminer la concentration optimale où lie la saturation se produit.</li>
	<li>Incuber les échantillons pendant 35 minutes sur la glace (dans un endroit sombre).</li>
	<li>Remettre en suspension les échantillons dans 300 µL de tampon de FACS et les centrifuger à 300 g [micro centrifugeuse] pendant 5 min à température ambiante. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les échantillons dans 325 µL de tampon de FACS. Analyse des échantillons sur un cytomètre en flux.</li>
</ol>

<ol><li>Maynard, C. L., Elson, C. O., Hatton, R. D., Weaver, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+interactions+of+the+intestinal+microbiota+and+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system.</a> Nature. 489, 231-241 (2012).</li>
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<li>Morton, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoscopic+photoconversion+reveals+unexpectedly+broad+leukocyte+trafficking+to+and+from+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 6696-6701 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L’identification et la caractérisation de cellules qui interagissent avec et sont influencés par la microflore du côlon sont importants et devraient faciliter la compréhension de comment les informations depuis le microenvironnement de la muqueuse sont relayées au reste du corps. Une méthode pour l’étude de la migration cellulaire axés sur l’intestin nécessite l’isolement de cellules associées aux intestin suivie d’un transfert adoptif dans des souris destinataires pour déterminer leurs habitudes de tissu-homing et fonct...

Le tube digestif de mammifères héberge des centaines d’espèces de bactéries qui existent dans une relation symbiotique avec l’hôte1. Les cellules immunitaires présentes dans le milieu local appliquer une coexistence pacifique avec ces microbes et d’établissent une barrière protectrice contre les invasions de l’agent pathogène. Ainsi, bidirectionnel des interactions entre les cellules immunitaires et la microflore sont essentielles pour établir une communauté commensale qui sensibilise le système immunitaire et définit le seuil de réactivité immunitaire aux agents pathogènes. Modifications dans la boîte de composition ou dysbiose, microbienne perturbent l’homéostasie immunitaire et perturbent les circuits réglementaires qui répriment les inflammations intestinales menant à médiation immunitaire maladies comme le diabète de Type 1 et de l’EIA,2,3 .
La période immédiatement après que la naissance est une unique fenêtre du développement au cours de laquelle les communautés microbiennes intestinales commencent à mettre en place en même temps le système immunitaire mûrit4. Le microbiote postnatal n’est pas stable, les changements dans la composition de la communauté qui se trouve naturellement et souvent5. Les cellules immunitaires qui interagissent avec le microbiote résident dans deux sites anatomiques distinctes dans l’intestin - la lamina propria et l' épithélium intestinal6. Nombreux types de cellules immunitaires sont présents dans l’intestin, y compris les lymphocytes (telles que les lymphocytes T, lymphocytes B et les cellules lymphoïdes innées) ainsi que des cellules myéloïdes (qui comprennent les macrophages, les monocytes et les cellules dendritiques). Ces cellules, également connu sous le nom de cellules hématopoïétiques, effectuent une multitude de fonctions qui préservent la barrière intestinale et de maintenir l’homéostasie.
En plus de leurs fonctions de réglementation aux sites intestinales, cellules immunitaires de la muqueuse peuvent aussi porter des messages microbiennes aux sites extra-intestinales de réglementer l’immunité systémique7,8,9. C’est un domaine d’intérêt croissant de recherche et met en évidence la nécessité de méthodes identifier les cellules immunitaires qui migrent hors de tissus intestinaux afin de sonder leur fonction. Le protocole indiqué ici utilise un modèle de souris disponibles dans le commerce qui consiste à exploiter une protéine fluorescente et pour marquer les cellules. PhAMexcisés souris ubiquitaire expriment une protéine fluorescente verte de Dendra2 qui est irréversiblement en fluorescence rouge lors de l’activation par ultraviolet (UV) léger10. À l’aide d’une canule de fibre optique pour livrer 405 lumière nm dans le côlon des souris nouveau-nées, nous démontrons que photoconverted les cellules hématopoïétiques, qui ont étaient originaires ou ont transité par le colon se trouve dans la rate.

<table><tbody><tr><td><Laser>fort</></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>forteDiode électroluminescente (LED)</td><td>THORLABS</td><td>M405FP1</td><td>ATTENTION : il s’agit d’un laser de classe 3b. Des lunettes de sécurité doivent être portées lors de l’utilisation du laser. Il émet une longueur d’onde de 405 nm avec un courant de 1400 mA. Il est couplé à la fibre. Il accepte le connecteur SMA. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1</td></tr><tr><td>pilote de LED</td><td>THORLABS</td><td>LEDD1B</td><td>Pilote un courant constant de 1200 mA à travers le laser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616</td></tr><tr><td>Câble patch Optogenetics</td><td>THORLABS</td><td>M87L01</td><td>Câble de 1 m de long avec connecteur SMA. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&pn=M87L01#11454</td></tr><tr><td>Canule à fibre optique</td><td>Lentilles doriques&nbsp ;</td><td>MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45</td><td>Canule de 5 mm de long avec un diamètre extérieur de 500 &micro ; m et un diamètre intérieur de 480 &micro ;m. La valeur NA est de 0,5. La virole est en zircone, de 1,25 mm de diamètre extérieur. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036</td></tr><tr><td>Alimentation</td><td>THORLABS</td><td>KPS101</td><td>Fournit 15 V avec un courant de 2,4 A https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101</td></tr><tr><td>lunettes de sécurité laser LG3.</td><td>Verres THORLABS</td><td>LG3</td><td>Orange avec 47 % de transmission de la lumière visible https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&pn=LG3#2523</td></tr><tr><td>Lumière rouge&nbsp ;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>74327-10</td><td>Lampe 15 W</td></tr> <tr><td>https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciencesIsolation des cellules intestinales</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-893-1389</td><td>ATTENTION : l’inhalation de cet anesthésique peut provoquer des étourdissements, de la somnolence ou même une perte de conscience. Cet anesthésique doit être utilisé dans une cagoule de classe II. https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3</td></tr><tr><td>1X HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025076</td><td>sans Ca/Mg https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&searchTerm=14025076&searchType=RAPID&matchedCatNo=14025076</td></tr><tr><td>Sérum de veau</td><td>Hyclone AZM</td><td>197696</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td>0,5 M de concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>10197777001</td><td>ATTENTION : nocif en cas d’ingestion et provoque une irritation de la peau. Concentration de 1 M https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>Concentration 1 M https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080</td></tr><tr><td>boîte de Pétri</td><td>Corning</td><td>353004</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&searchTerm=08772F&searchType=RAPID&matchedCatNo=08772F</td></tr><tr><td>crépine à cellules de 70 microns</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712</td></tr><tr><td>Barre d’agitation micro magnétique</td><td>Fisherbrand</td><td>1451364</td><td>Rincez à l’éthanol à 70 % après chaque utilisation. Rincez plusieurs fois à l’eau distillée avant chaque utilisation. La barre mesure 8 mm de long avec une forme octogonale. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364</td></tr><tr><td>Plaque d’agitation magnétique</td><td>Corning Laboratory Stirrers</td><td>440826</td><td>https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&persist=true&ip=no&gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE</td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Roche</td><td>5401020001</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en&region=US&gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>10104159001</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-027</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027</td></tr><tr><td>Aide à la pipette</td><td>Thermo Scientific</td><td>14387165</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165</td></tr><tr><td>10 mL Pipette sérologique</td><td>Falcon</td><td>357530</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659</td></tr><tr><td>Pipette sérologique de 25 mL</td><td>Falcon</td><td>357515</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659</td></tr><tr><td>tube à centrifuger conique de 15 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>339651</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650</td></tr><tr><td>tube à centrifuger conique de 50 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>339653</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650</td></tr><tr><td>Suspension unicellulaire</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>tubes Eppendorf</td><td>Seal-Rite</td><td>1615-5500</td><td>Contient 1,5 mL. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx</td></tr><tr><td>Homogénéisateur de tissus&nbsp ;</td><td>Kimble</td><td>K7495400000</td><td>Nécessite 2 piles AA. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000</td></tr><tr><td>Embouts de l’homogénéisateur&nbsp ;</td><td>Kimble</td><td>7495210590</td><td>Plastique, pointes de 0,5 mL https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590</td></tr><tr><td>tampon de lyse ACK</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01</td></tr><tr><td>crépine à cellules de 40 microns</td><td>Falcon</td><td>08-771-1</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711</td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BV786 anti-souris CD45&nbsp ;</td><td>BD</td><td>564225</td><td>Clone 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225</td></tr><tr><td>Live/Dead</td><td>Invitrogen</td><td>L34962</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962</td></tr><tr><td>OtherRazor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> lames</td><td>VWR</td><td>55411-050</td> À <td>utiliser pour la décapitation. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades</td></tr></tbody></table>

in vivo photomarquage des cellules dans le côlon pour évaluer le potentiel migratoire des cellules hématopoïétiques chez les souris néonatales

In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice

Les communautés bactériennes entériques sont établies tôt dans la vie et influencent la fonction et le développement des cellules immunitaires. Le microbiote néonatal est sensible à nombreuses influences externes, y compris l’utilisation d’antibiotiques et l’alimentation, qui a des répercussions susceptibilité à des maladies auto-immunes et inflammatoires. Désordres tels que le maladie inflammatoire de l’intestin (MII) sont caractérisés par un afflux massif de cellules immunitaires à l’intestin. Cependant, les cellules immunitaires conditionnées par la microflore peuvent en outre émigrer hors de l’intestin d’influer sur les réponses immunitaires aux sites extra-intestinales. Ainsi, il est nécessaire pour identifier et caractériser les cellules qui peuvent porter des messages microbiennes des intestins aux sites distales. Nous décrivons ici une méthode pour marquer les cellules dans le côlon des souris nouveau-nées in vivo permettant leur identification sur les sites extra-intestinales après la migration.

Un câble à fibre optique a été utilisé pour livrer le 405 lumière nm dans les colones de 2 - jours ans PhAMexcisés souris. Dans des expériences antérieures, une exposition de s 30 était déterminé à donner une photoconversion maximale des cellules du côlon avec un minimum cytotoxicité (Figure 1A). Par conséquent, séquentiels 30 expositions de s des différents segments du côlon ont été réalisées comme décrit dans le protocole. Suite ...

Le protocole décrit ici utilise une approche de photomarquage chez des souris nouveau-nées d’identifier spécifiquement les cellules immunitaires qui ont émigrent du côlon aux sites extra-intestinales. Cette stratégie sera utile pour étudier les interactions hôte-microbiome en début de vie.

In Vivo Photomarquage des cellules dans le côlon pour évaluer le potentiel migratoire des cellules hématopoïétiques chez les souris néonatales

Enteric bacterial communities are established early in life and influence immune cell development and function. The neonatal microbiota is susceptible to ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie des muqueuses concernant les interactions entre le microbiome immunitaire de l’hôte néonatal et les interactions entre les cellules et le microbiome immunitaire, telles que les cellules transportent-elles des messages microbiens et, dans l’affirmative, de quelles cellules s’agit-il ? Le principal avantage de cette technique est qu’elle marque de manière non spécifique et irréversible les cellules résidentes du côlon chez les souris infantiles, ce qui nous permet de déterminer leurs schémas de trafic vers les sites extra-intestinaux. Pour assembler le laser, connectez la diode électroluminescente, ou LED, au pilote de LED via le câble de connecteur M8 à quatre broches de la LED et serrez soigneusement la vis pour fixer la connexion.Tenez l’ouverture du connecteur de la LED près de la lumière pour vous assurer qu’il n’y a pas d’obstructions visibles. Insérez le câble de raccordement optogénétique dans l’ouverture. Insérez la canule dans l’une ou l’autre des extrémités du manchon du connecteur.Fixez ensuite l’autre extrémité du manchon du connecteur à l’extrémité du câble de raccordement, en conn

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Cet article décrit une méthode pour l'étiquetage de peau embryonnaire et les vaisseaux sanguins du thymus.

Une méthode pour l&#39;étiquetage dans les vaisseaux sanguins souris embryonnaires

Le cytomégalovirus (HCMV) infection humaine des nouveau-nés représentent une cause importante de déficience mentale, mais les événements moléculaires conduisant à la pathogenèse induite par le virus sont encore mal compris. Pour étudier la dynamique de l'infection du cerveau, nous avons adapté animal...

Utilisation d&#39;<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie à suivre la progression de cytomégalovirus souris une infection expérimentale chez les prématurés

Nous décrivons un protocole général pour le suivi in vivo de cellules à l'aide de l'IRM dans un modèle de souris ex vivo avec des cellules marquées. Un protocole typique pour le marquage de cellules, le traitement d'acquisition d'image et la quantification est inclus.

In vivo 19 F IRM pour le suivi cellulaire

Combinatoires 5 protéines fluorescentes de marquage des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques permet in vivo suivi clonale par confocale et microscopie à deux photons, apportant des éclairages sur la moelle osseuse hématopoïétique architecture lors de la régénération. Cette méthode permet de cartographier de sort non-invasif des cellules HSPCs dérivés spectrale codés dans des tissus intacts pour de longues périodes de temps après la transplantation.

In vivo suivi clonale de cellules souches hématopoïétiques et progénitrices Marqué par cinq protéines fluorescentes confocale et multiphotonique Microscopie

La nature des interactions entre les cellules souches hématopoïétiques et progénitrices (HSPCs) et les niches de la moelle osseuse est mal comprise. Mesure des modifications de matériel et un protocole d'acquisition en plusieurs étapes permettent l'utilisation de deux photons et la microscopie confocale à l'image ex vivo des HSPCs marqués hébergés dans les zones de la moelle osseuse, les interactions de suivi et mouvement.

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Les monocytes sont des régulateurs clés de l’immunité innée et jouent un rôle critique dans le renouvellement du système phagocytaire mononucléaire périphérique et en cas d’inflammation. Ce manuscrit décrit la procédure d’imagerie en temps réel de la moelle osseuse de la calvaria de souris pour étudier le mécanisme de mobilisation des monocytes.

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Nous détaillons un protocole pour surveiller le comportement des neutrophiles et des monocytes dans les veines mésentériques à l’état d’équilibre et dans des conditions inflammatoires en utilisant la microscopie confocale intravitale sur des souris anesthésiées.

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Les mécanismes qui régissent la motilité interstitielle des cellules CD4 T effecteurs aux sites d'inflammation sont relativement peu connus. Nous présentons une approche non invasive pour visualiser et manipuler dans des cellules in vitro -primed T CD4 dans le derme de l' oreille enflammée, ce qui permet pour l' étude du comportement dynamique de ces cellules in situ.

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Protocoles pour une évaluation quantitative de la chimiotaxie des lymphocytes et des migrations sont des outils importants pour la recherche de l’immunologie. Un protocole in vitro est décrit ici, que les permis en temps réel, multiplexés évaluation de la migration cellulaire, ainsi qu’un complémentaire en vivo technique propice suivi de cellules natives de rate.

Quantifier la chimiotaxie Monocyte humain In Vitro et lymphocytes murins traite In Vivo

Nous décrivons une méthode pour visualiser gFP-étiquetée IELs utilisant l'imagerie intravitale de l'intestin grêle murine par microscopie confocale de disque de rotation inversée. Cette technique permet le suivi des cellules vivantes dans la muqueuse jusqu'à 4 h et peut être utilisée pour étudier une variété d'interactions intestinales immunisées-épithéliales.

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La migration des neutrophiles repose sur le remodelage rapide et continu de la membrane plasmique en réponse au chimioattractant et à ses interactions avec le microenvironnement extracellulaire. Il s’agit d’une procédure basée sur la microscopie subcellulaire intravitale pour étudier la dynamique du remodelage membranaire dans les neutrophiles injectés dans l’oreille de souris anesthésiées.

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Découvrez le photomarquage in vivo des cellules du côlon chez les souris néonatales pour étudier le trafic des cellules hématopoïétiques vers les sites extra-intestinaux. Cette technique révèle les interactions hôte-microbiome.

In Vivo Photomarquage des cellules dans le côlon pour évaluer le potentiel migratoire des cellules hématopoïétiques chez les souris néonatales (Vidéo) | JoVE Journal

In Vivo Photomarquage des cellules dans le côlon pour évaluer le potentiel migratoire des cellules hématopoïétiques chez les souris néonatales

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