Isolement et analyse des communautés microbiennes dans le sol, rhizosphère et racines dans des expériences de graminée vivace

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du microbiome du sol, de la rhizosphère et de l’endosphère racinaire, telles que la façon dont la diversité des communautés microbiennes change en réponse au type d’échantillon, au traitement et au génotype de la plante. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est bien adaptée aux expériences sur le terrain qui nécessitent un grand nombre d’échantillons et une réplication. La démonstration de la procédure sera faite par moi-même et Stephanie Futrell, une étudiante diplômée et technicienne de recherche de mon laboratoire.

Pour commencer le protocole, étiquetez une casserole et un seau avec une note autocollante avec les détails de l’échantillon de plante. Transportez le seau étiqueté jusqu’à la parcelle et laissez la lèchefrite au poste de travail établi sur le terrain. Choisissez au hasard et collectez deux plantes par parcelle à différents endroits de la parcelle.

Ensuite, percez le sol avec une pelle à une profondeur de 30 centimètres pour couper l’une des racines latérales qui maintiennent la plante dans le sol. Excavez les racines des plantes à l’aide de la pelle et placez la motte dans le seau étiqueté. Ramenez le godet au poste de travail sur le terrain.

Secouez les racines et utilisez une bêche ou un motoculteur à main pour enlever la terre des racines. Portez des gants et placez les racines près du poste de transformation. Après avoir secoué les racines, mélangez la terre dans la lèchefrite et brisez les mottes de terre avec une motobineuse.

Placez un échantillon de sol exempt de débris dans un sac de rangement à fermeture éclair étiqueté de 17,7 x 19,5 centimètres et placez-le sur de la glace. Stérilisez les ciseaux d’élagage à 70 % d’éthanol. Utilisez les ciseaux stériles pour exciser une variété de racines, environ quatre à six racines par plante et chaque racine d’environ neuf à 12 centimètres de long.

Placez les racines excisées dans un tube étiqueté de 50 millilitres contenant 35 millilitres de tampon phosphate autoclavé avec un tensioactif tel que Silwet L-77. Secouez les tubes pendant deux minutes pour libérer la rhizosphère de la surface des racines. Améliorez les secousses avec un générateur et un vortexer.

Avec une pince stérilisée à 70 % d’éthanol, retirez les racines du tube, épongez-les brièvement sur du papier absorbant et placez-les dans un nouveau tube étiqueté de 50 millilitres. Placez à la fois le tube contenant la rhizosphère et celui contenant les racines sur de la glace. Ajoutez environ 35 millilitres d’eau de Javel à 50 % et 0,01 % de Tween 20 dans les tubes de 50 millilitres avec les racines recueillies sur le terrain.

Agitez les tubes pendant 30 à 60 secondes. Videz l’eau de Javel, ajoutez 35 millilitres d’éthanol à 70 % et faites un vortex ou secouez les racines pendant encore 30 à 60 secondes. Après avoir secoué, versez l’éthanol à 70 % et ajoutez 35 millilitres d’eau stérile et ultra-pure et agitez l’échantillon pendant une minute.

Répétez l’étape de rinçage à l’eau deux fois de plus pour que la racine reçoive un total de trois rinçages avec de l’eau stérile et ultra-pure. Épongez les racines sur des serviettes en papier sèches et propres et utilisez une serviette en papier propre pour chaque échantillon. À l’aide d’une pince stérile et de ciseaux d’élagage, coupez les racines en morceaux d’environ cinq millimètres et placez les racines coupées dans un tube conique propre et étiqueté de 15 millilitres, puis conservez les échantillons à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient traités ultérieurement.

Agitez les tubes de 50 millilitres contenant des échantillons de rhizosphère du terrain pendant 20 à 30 secondes pour remettre l’échantillon en suspension. À l’aide d’une crépine stérile de 100 microns, filtrez l’échantillon remis en suspension dans un nouveau tube de 50 millilitres. Ensuite, centrifugez les tubes à 3 000 fois g pendant cinq minutes à température ambiante.

Versez immédiatement et jetez le surnageant. Placez les pastilles de rhizosphère dans les tubes de 50 millilitres sur de la glace. Ensuite, ajoutez 1,5 millilitre de tampon phosphate stérile sans tensioactif aux pastilles de rhizosphère et agitez-les pour remettre l’échantillon en suspension.

Pipetez le liquide en suspension dans un tube microfuge de deux millilitres propre et étiqueté. Faites tourner les tubes à 15 871 fois g pendant deux minutes à température ambiante. Videz immédiatement le surnageant et égouttez les tubes sur du papier absorbant propre.

Conservez les granulés à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient traités ultérieurement. À l’aide d’une spatule métallique stérile, remplissez un tube propre et étiqueté de deux millilitres avec environ trois grammes de terre pour l’extraction de l’ADN et évitez les petits morceaux de racines et les débris. Rincez la spatule métallique à l’éthanol à 70 % entre chaque échantillon.

Conservez cet échantillon de sol à moins 20 degrés Celsius. Dans une lèchefrite propre, videz le sac de terre dans des tamis empilés avec le plus grand tamis sur le tamis plus petit et tamisez manuellement le sol à travers les deux tamis. À l’aide d’une brosse, nettoyez soigneusement les tamis entre les échantillons.

Mettez de côté 100 à 125 grammes de sol tamisé dans un sac à fermeture éclair de 17,7 x 19,5 centimètres pour une analyse physicochimique et de texture du sol. Placez les sacs de terre à quatre degrés Celsius pour un stockage à court terme. Ensuite, versez de l’azote liquide dans un bécher en plastique avec des spatules propres et dans un mortier propre.

Placez le tissu congelé dans le mortier et broyez-le avec le pilon en une poudre fine. Ajoutez continuellement de l’azote liquide tout au long du broyage pour garder les échantillons congelés. À l’aide d’une spatule, transférez le mouchoir broyé dans un tube propre et étiqueté de deux millilitres, puis conservez le mouchoir à moins 80 degrés Celsius.

Essuyez la zone de travail avec 70 % d’éthanol et 1 % d’eau de Javel domestique. Retirez les échantillons de sol de l’entrepôt à moins 20 degrés Celsius et décongelez-les dans un seau à glace. Retirez le couvercle du tapis d’étanchéité d’une plaque d’extraction de 96 puits et placez le couvercle entre deux lingettes en papier pour le garder propre lorsqu’il n’est pas utilisé.

Recouvrez les 12 colonnes de la plaque avec des bandes PCR adhésives à 8 puits pour éviter toute contamination. Tarez un entonnoir de pesée stérile de petite taille sur une balance et pesez 200 à 250 milligrammes de terre. Soulevez délicatement la bande adhésive, placez le goulot de l’entonnoir de pesée rempli dans le puits approprié et guidez doucement l’échantillon de sol dans le puits approprié.

Replacez la bande adhésive pour couvrir le puits. Répétez ce processus pour chaque puits, en utilisant un nouvel entonnoir stérile pour chaque échantillon. Replacez le couvercle du tapis d’étanchéité sur la plaque d’extraction et stockez la plaque à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle soit prête pour l’extraction de l’ADN.

Retirez les échantillons de rhizosphère de l’entreposage à moins 20 degrés Celsius et décongelez-les dans un seau à glace. Préparez la plaque d’extraction d’ADN comme fait dans la section précédente. Placez une lingette en papier propre sur une balance, puis tarez une spatule métallique stérile sur la balance.

À l’aide de la spatule, prélevez soigneusement une partie de la pastille de rhizosphère d’un tube d’échantillon. Peser entre 200 et 250 milligrammes de l’échantillon de rhizosphère. Soulevez délicatement la bande adhésive pour découvrir le premier puits de la plaque d’extraction.

Inclinez la spatule remplie dans le puits et grattez le matériau de la rhizosphère dans le puits approprié avec un cure-dent stérile. Rincez la spatule métallique dans de l’eau puis de l’éthanol à 70 % entre les échantillons. Enfin, répétez ce processus pour chaque puits de la plaque jusqu’à ce que la plaque soit remplie, en laissant un puits vide comme contrôle de l’ébauche d’extraction.

Dans cet ensemble de données représentatives, il y avait des différences très significatives entre les types d’échantillons, et la rhizosphère et le sol semblent être plus similaires en composition l’un à l’autre que la racine. Une analyse plus poussée montre qu’il y avait également des différences très significatives dans la composition de la communauté microbienne entre la rhizosphère et le sol. L’analyse de la diversité alpha montre que les communautés microbiennes de l’endosphère étaient inférieures à celles du sol et de la rhizosphère.

La seule différence significative de diversité entre les espèces de graminées était entre les échantillons d’endosphère du barbon à balais et du panic raide. L’analyse de l’abondance relative met en évidence la dominance des protéobactéries suivies des actinobactéries dans tous les types d’échantillons. Le sol et la rhizosphère sont dominés par les acidobactéries et les chloroflexi, tandis que les racines avaient une plus grande abondance relative de bactériodètes.

L’analyse PERMANOVA de tous les types d’échantillons a permis d’élucider une différence très significative dans la composition des communautés microbiennes en fonction des espèces végétales. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer une série d’étapes à utiliser dans l’étude des microbiomes du sol, de l’endosphère et de la rhizosphère. Nous tenons à remercier l’EPSCoR du Nebraska et le programme d’infrastructure de recherche EPSCoR de la National Science Foundation Track 1 pour le financement partiel de cette vidéo éducative.