Différence de potentiel nasale pour quantifier le Transport des ions Trans épithélial chez la souris

La différence de potentiel nasal est une méthode précieuse pour caractériser le phénotype des souris transgéniques modélisant la mucoviscidose. Il permet d’étudier l’efficacité de nouveaux types de thérapies pour la mucoviscidose. Les principaux avantages de la technique sont qu’elle fournit des mesures fiables chez les souris qui se reproduisent en continu.

Il réduit la mortalité associée et permet de répéter l’essai chez le même animal. Pour préparer le cathéter nasal à double lumière, maintenez le milieu d’un tube en polyéthylène de 20 centimètres de long dans la flamme environ 10 à 15 secondes jusqu’à ce qu’il soit suffisamment mou pour être tiré. Ensuite, écartez les deux extrémités pour obtenir un tube capillaire très fin d’environ 15 centimètres de long et un diamètre extérieur de 0,1 millimètre pour la sonde nasale.

Ensuite, nettoyez et dégraissez les deux capillaires avec de l’éthanol pur. Assemblez-les avec du ruban adhésif et collez-les ensemble à l’aide de colle cyanoacrylate. Coupez l’excédent de longueur des sondes avec une lame de rasoir pour obtenir le cathéter à double lumière d’environ huit centimètres de long.

Ensuite, injectez de l’eau à travers les deux lumières pour vérifier qu’elles sont perméables et faites une marque à une distance de cinq millimètres de la pointe. Par la suite, préparez un mélange de crème en mélangeant la crème électrolytique et la solution saturée de potassium à trois molaires dans un rapport de un à un, en évitant la formation de minuscules bulles d’air. Pour le dispositif expérimental, afin d’éviter l’hypothermie pendant et après le test, utilisez deux coussins chauffants, l’un pour le dispositif de mesure, et l’autre pour la boîte dans laquelle l’animal sera placé pour la récupération à la fin du test.

Allumez l’ordinateur, qui est connecté à la mémoire de données, à l’impédance d’entrée élevée et au voltmètre haute résolution. Ouvrez ensuite le logiciel de capture de données. Connectez les électrodes au voltmètre.

Trempez la pointe des électrodes ensemble dans le mélange de crème. Vérifiez la valeur initiale du décalage de l’électrode et rejetez les électrodes si la valeur est supérieure à plus ou moins deux millivolts. Ensuite, allumez la pompe péristaltique et insérez le tube de la pompe dans la lumière perfusante du cathéter nasal.

Remplissez une lumière du cathéter nasal avec un mélange de crème électrolytique à l’aide d’une pointe de pipette de 10 microlitres. Adaptez le cathéter à un connecteur de tube en silicone et remplissez le connecteur avec un mélange de crème. Ensuite, insérez l’électrode positive dans le connecteur.

Vérifiez la valeur de décalage du pont d’électrode de mesure et rejetez les ponts si la valeur est supérieure à plus ou moins deux millivolts. Par la suite, connectez la sortie proximale du tube de la pompe au flacon contenant la solution sélectionnée pour la perfusion nasale. Connectez ensuite la sortie distale du tube de pompe à la lumière de perfusion du cathéter nasal.

Ensuite, remplissez la deuxième lumière du cathéter nasal avec la solution fraîche A1. Trempez l’extrémité du cathéter nasal dans la solution contenant le flacon A.Inversez la direction de la pompe péristaltique pour remplir la longueur du cathéter nasal correspondant à 10 secondes de perfusion. Par la suite, pliez une feuille de tissu absorbant pour former un oreiller de trois centimètres de large qui servira de support à la tête de la souris. Couvrez le coussin chauffant avec la feuille de tissu absorbant.

Ensuite, posez la souris sur le dos sur le coussin chauffant et collez les membres et la queue sur le coussin. Ensuite, insérez le cathéter intraveineux de référence dans l’espace sous-cutané d’un membre postérieur. Retirez l’aiguille et adaptez-la dans le connecteur du tube en silicone.

Remplissez le cathéter et le connecteur avec un mélange de crème. Ensuite, connectez l’électrode de mesure positive au cathéter nasal et l’électrode de référence négative au cathéter inséré dans l’espace sous-cutané du membre postérieur de l’animal. Ensuite, fixez le cathéter et l’électrode avec du ruban adhésif au besoin pour éviter tout déplacement.

Après avoir placé l’électrode de référence et les ponts, vérifiez à nouveau la valeur de décalage du pont de l’électrode de mesure en trempant l’extrémité du cathéter nasal dans le mélange de crème d’électrode à l’intérieur du connecteur du cathéter IV. Enregistrez la valeur de décalage finale stable. Maintenant, fixez les oreilles de la souris avec du ruban adhésif sur le coussin chauffant dans un espace libre entre les deux morceaux de tissu absorbant.

Fixez l’éclat sans toucher les yeux. Pour absorber le liquide de la cavité buccale, déplacez la langue sur le côté et insérez une mèche pointue de papier filtre d’environ un centimètre dans la bouche. Pour absorber le liquide qui s’écoule de la narine perfusée, placez un deuxième morceau de papier filtre au niveau du nez.

Vérifiez la valeur de contrôle positif du potentiel épithélial en plaçant l’embout du cathéter nasal à l’intérieur de la bouche. En le tenant avec une pince fine et sous un bon éclairage direct, introduisez délicatement le cathéter nasal dans une narine, jusqu’à quatre à six millimètres de l’extrémité du nez. Cinq minutes après l’injection des anesthésiques, inclinez doucement le coussin chauffant d’environ 30 degrés avec la tête de l’animal vers le bas.

Surveillez la valeur maximale de la DP de base. Lorsqu’il est stable pendant plus de 30 secondes, commencez à perfuser la muqueuse nasale à 10 microlitres par minute avec les quatre solutions tamponnées successivement. Perfuser la première solution pendant 10 secondes, puis chaque solution suivante pendant cinq minutes, ou jusqu’à ce qu’une tension stable ait été atteinte.

Arrêtez de perfuser la forskoline lorsque la réponse transitoire de la forskoline commence à diminuer. Après l’évaluation, relâchez la souris du coussin chauffant. Administrez-le avec le mélange d’antagonistes anesthésiques et transférez-le dans la boîte de récupération avec un coussin chauffant jusqu’à récupération complète.

Voici les tracés nasaux représentatifs de la MP d’une souris homozygote, normale et homozygote pour la mutation CFTR de délétion F508, ainsi que les valeurs individuelles obtenues pour les paramètres de la DP nasale. La réponse à l’amiloride est la différence entre les valeurs de la nasale à la fin et au début de la perfusion de la muqueuse nasale avec une solution saline tamponnée basale contenant de l’amiloride. La réponse sans chlorure est la différence entre les valeurs de la nasale à la fin et au début de la perfusion de la muqueuse nasale avec une solution saline tamponnée sans chlorure, plus de l’amiloride.

La réponse à la forskoline est la différence entre les valeurs de la nasale à la fin et au début de la perfusion de la muqueuse nasale avec une solution saline tamponnée sans chlorure, plus de la forskoline et de l’amiloride. La réponse totale du chlorure est la somme des deux derniers paramètres obtenus sous une perfusion de chlorure nulle. Le projet peut être utilisé pour explorer, fournir les transfuges de transport chez la souris, mais aussi chez le gamin, chez le grand, et dans le modèle de mucoviscidose du furet.

Et les transfuges de transport de sodium dans le modèle de souris eunuque. Tous les transporteurs peuvent être étudiés en adoptant le protocole. Travailler dans la cavité nasale des rongeurs est extrêmement délicat en raison de la paroi essentielle des entrées sensorielles de la région nasale du visage.

La mort adéquate de l’anesthésie est particulièrement difficile lors de l’opération dans la cavité nasale de la souris.