Name: Nano-capteurs pour détecter l’activité protéase In Vivo pour le diagnostic non invasif (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Découvrez la conception de nano-capteurs pour mesurer l'activité protéase in vivo via l'urine, offrant un diagnostic non invasif. Cette méthode amplifie les signaux biologiques pour détecter précocement diverses maladies.

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Ce travail a été financé par un directeur de NIH New Innovator Award (prix no DP2HD091793). Q.D.M. est pris en charge par le programme de bourses de recherche recherche supérieures de NSF (Grant No. DGE-1650044). B.A.H est pris en charge par les instituts nationaux de santé GT BioMAT formation Grant sous attribution numéro 5T32EB006343 ainsi que du Président Georgia Tech Fellowship. G.A.K. est titulaire d’une bourse de carrière à l’Interface scientifiques du fonds Burroughs Bienvenue. Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement l’opinion officielle de la National Institutes of Health.

Approbation institutionnelle Institutional Animal Care et utilisation Comité (IACUC) à l’établissement du chercheur est nécessaire de procéder à l’expérimentation animale suivantes. En outre, les installations standard de soins aux animaux (p. ex., abritant des chambres, cagoules animaux stériles, chambres d’isofluorane pour anesthetization et CO2 chambres pour euthanasie éthique de point de terminaison) sont nécessaires pour réaliser ces expériences. Spéciaux de formation et d’assistance avec ces installations peuvent être fournis par le laboratoire de recherche physiologique (CTR) dans son établissement. Tous les travaux d’animaux a été approuvé par IACUC à Georgia Tech (protocole : A14100).
1. synthèse de nanoparticules (IONP) d’oxyde de fer
Remarque : Sécurité : la synthèse de nanoparticules d’oxyde de fer complète doit être effectuée à l’aide d’équipements de protection individuelle et sous un produit chimique fumées hotte.
<ol><li>Dans un tube conique de 15 mL, refroidir 1 mL d’hydroxyde d’ammonium 30 % dans un seau à glace pendant 30 min.</li>
	<li>Laver une fiole d’Erlenmeyer avec de l’eau désionisée de 250 mL et ajouter 10 mL d’eau distillée double (ddH2O). Immergez l’extérieur de la fiole dans un bain de glace reposant sur une plaque de remuer/chaleur. Utiliser une pipette en plastique pour débit N2 du gaz dans le ddH2O dans le ballon. Bulle de 15 minutes avec N2 à désoxygéner.</li>
	<li>Pèsent 224 µmol (4,5 grammes) de dextran (poids moléculaire (MW) = 20 kDa) dans un tube conique de 50 mL. Ajouter H2O tel que le volume final du mélange, y compris le dextran, soit 20 mL. Vortex vigoureusement pour dissoudre le dextran.</li>
	<li>Pèsent 290 µmol (78,5 g) de chlorure de fer (III) hexahydrate, ajoutez à la solution de dextran et vortex de dissoudre.</li>
	<li>Filtrer la solution obtenue à travers un filtre de 0,2 µm.</li>
	<li>Transférer 1 mL réfrigéré d’hydroxyde d’ammonium dans 9 mL de l’eau désoxygénée. Retour à 4 ° C.</li>
	<li>Peser les 367 µmol (73,0 grammes) de fer (II) chlorure tétrahydraté, dissoudre dans 1 mL de ddH sans oxygène2O et filtrer à travers un filtre de 0,2 µm.</li>
	<li>Transférer la solution dextran-iron(III) dans l’erlenmeyer de 250 mL et désoxygéner avec N2 pendant 15 minutes sur la glace. Mélanger avec une agitation magnétique bar tournant à 1 600 tr/min.</li>
	<li>Pour créer une atmosphère d’azote homogène, cap le ballon avec un septum en caoutchouc. Perforation de la cloison avec une 18 aiguille à flux N2 de calibre dans le ballon. Insérer une aiguille de 18 calibre séparé comme une prise de courant.</li>
	<li>Ajoutez 467 µL de la solution de fer (II) à la solution de dextran-iron(III) avec une seringue de 1 mL, en remuant avec une barre magnétique remuer à 1600 tr/min. Ce ratio de fer (II) de fer (III) se traduit par une réaction équilibrée qui produira la magnétite ou Fe3O4.</li>
	<li>Ajouter que le réfrigéré diluer le hydroxyde d’ammonium goutte à goutte dans la solution de dextran de fer (II) - fer (III) - pour amorcer le processus de nucléation21. Assurez-vous que chaque gouttelette se mélange bien avant de tomber dans un autre. Terminer la réaction après l’addition de 1 à 2 mL d’hydroxyde d’ammonium.</li>
	<li>Arrêter l’écoulement du N2 et retirer le bouchon en caoutchouc. Retirer la baignoire de glace et le remplacer par un bain d’eau chaude, tout en continuant de remuer la solution. S’assurer que la température de la solution atteint 75 ° C et laisser incuber pendant 75 minutes.</li>
	<li>Enlever le ballon de la plaque chaude/remuer et doublement filtrer la solution sur 0,2 µm puis 0,1 µm filtres pour enlever les particules grossières.</li>
	<li>Echange de tampon les particules en FD2O, à l’aide de 100 kDa moléculaire poids coupés de concentrateurs (m.w.c.o.) pour supprimer les excès dextran de la solution, qui devrait être très visqueuse. Remplacer les filtres si le débit reste sombre même après 2-3 tours, ce qui indique que le filtre peut-être avoir enfreint.<ol>
<li>Échange de la mémoire tampon avec des filtres de spin, centrifuger à 4 ° C à 4800 X g pendant 15 minutes, jeter le cheminement, et ajouter nouveau tampon à la solution IONP. Répétez 3 à 5 fois.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Déterminer la concentration de nanoparticules à l’aide d’un spectrophotomètre/lecteur. Prendre mesures d’absorbance à 400 nm et l’utilisation de l’absorptivité molaire de IONP à cette longueur d’onde (ε = 2,07 x 106 cm-1 M-1) pour déterminer la concentration des particules de IO.</li>
	<li>Resuspendre les IONPs à 10 mg/mL dans ddH2O (habituellement volume total est d’environ 3 mL) et assurez-vous d’utiliser des tubes en polypropylène pour cette étape pour la compatibilité chimique. Ajouter 1,6 volumes de 5 M NaOH, puis ajouter 0,65 volumes de l’épichlorhydrine. Rigoureusement mélanger sur un agitateur de plaque à température ambiante pendant 12 heures pour relier dextran.</li>
	<li>Utiliser une seringue de 20 mL avec une aiguille de calibre 18 pour transférer la solution IONP dans la membrane de dialyse de m.w.c.o. de 50 kDa. Placer la membrane de dialyse dans 4 L FD2O et remplacer des H2O quelques fois (toutes les 2-3 heures). Incuber pendant la nuit.</li>
	<li>Mesure de la concentration et porter IONPs à 5 mg/mL (voir étape 1.15). Ajouter hydroxyde d’ammonium pour atteindre 20 % (v/v) et agiter à température ambiante pendant 12 heures &gt; à aminate la surface du IONPs. Echange de tampon à l’aide de filtres de m.w.c.o. de 30 kDa (voir 1.14).</li>
	<li>Réglez le volume jusqu'à 2,5 à 3,5 mL avant la purification finale par Fast protéine chromatographie en phase liquide (FPLC ; voir Table des matières pour colonne de gel filtration).</li>
	<li>Diffusion dynamique de la lumière (DLS) permet de déterminer le rayon hydrodynamique de IONPs (attendus entre 10 à 100 nm, taille moyenne 40 à 50 nm). Pour ce faire aliquotage 1 mL de 100 X échantillon IONP dilué dans une cuvette, placer dans la machine et utiliser le logiciel du fabricant pour prendre la mesure. Remarque : La population totale de IONPs se situera entre 10 et 100 nm par des mesures de DLS, mais la majorité de la population est d’environ le diamètre moyen, qui varie de 40 à 50 nm. Si l'on veut limiter la plage de taille, on peut encore utiliser chromatographie d’exclusion afin d’isoler les fractions avec différents diamètres. IONPs doivent être conservés à 4 ° C.</li>
</ol>2. peptide Design, conjugaison à IONP et In Vitro de Validation
<ol><li>Synthétiser un substrat de peptide (par exemple, par une installation de base ou dans le commerce) pour une protéase de la cible avec un journaliste fluorescent N-terminaux tels que l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) et un résidu de cystéine terminale C pour permettre le couplage thiol-médiée. Remarque : Dans le cas de cette étude pour MMP9, le peptide utilisé était FITC-PLGVRGK-C, avec kchat/km ~ 2,0 x 105 M-1s-1.</li>
	<li>Aliquote 0,5 mg de IONP (à 1 mg/mL) et l’échange de mémoire tampon dans la mémoire tampon de couplage (50 mM le Borate de Sodium avec EDTA 1 mM, pH = 8,5) en utilisant un spin de m.w.c.o. 10 kDa du filtre (Voir l’étape 1.14).</li>
	<li>Dissoudre Succinimidyl iodoacétate (SIA) dans le diméthylformamide (DMF) pour atteindre une concentration de ~ 30 mg/mL et ajouter SIA à IONP à un rapport molaire de 500 SIA:IONP. Remarque : Le SIA est un hétérobifonctionnel Croix linker qui intervient dans le couplage des amines sur IONPs pour les groupes sulfhydryles sur le substrat de peptide.</li>
	<li>Incuber pendant 1 à 2 heures à température ambiante dans l’obscurité. Si quitter du jour au lendemain, incuber à 4 ° C.</li>
	<li>Exchange à l’aide d’un filtre de spin m.w.c.o. 10 kDa dans le tampon de couplage pour supprimer SIA n’a pas réagi de la mémoire tampon (voir étape 1.14).</li>
	<li>Amener la solution du produit final à 1 mg/mL (0,5 mL de solution). Mélanger le peptide d’intérêt à un rapport molaire de 90 : 1 (peptide : IONP) avec 20 kDa se terminant par thiol polyéthylène glycol (PEG) dans un rapport molaire de 20:1 (PEG : IONP). Cette solution de peptide-PEG se mêlent IONP.</li>
	<li>Incuber une nuit à température ambiante sur un agitateur de plaque sur la vitesse la plus élevée, couvrant les tubes en aluminium pour éviter le photoblanchiment de molécules fluorescentes.</li>
	<li>Ajouter L-cystéine dans un rapport molaire de 500 : 1 (C:IONP) pour neutraliser toutes les molécules de SIA n’a pas réagis. Incuber pendant 1 heure à 25 ° C dans un agitateur à vitesse plus élevée à la température ambiante.</li>
	<li>Purifier par FPLC (voir 1.1.19). Utilisez un spectrophotomètre pour mesurer l’absorbance de la solution de l’échantillon et calculer le rapport de Peptide : IONP selon ce qui suit. Après purification, stocker le produit à 1 mg/mL à 4 ° C dans du PBS.<ol>
<li>Utilisez un spectrophotomètre pour mesurer l’absorbance de la solution échantillon à 400 nm (unéchantillon, 400) et la longueur d’onde d’absorbance maximale pour le fluorophore utilisé, qui est 488 nm pour FITC (unéchantillon, 488). Mesurer l’absorbance d’une solution IONP stock amine aux mêmes deux longueurs d’onde (400 nm et 488 nm), qui sont respectivement représentés comme uneNP, 400 et uneNP, 488.</li>
		<li>Utiliser les équations 1 et 2 pour calculer le normalisée A400 et une valeurs488 . <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq1.jpg">Équation 1 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq2.jpg">Équation 2</li>
		<li>Une400 et une488 représentent les valeurs normalisées de l’échantillon. Utilisez ces valeurs pour calculer le taux de Peptide : IONP avec l’équation 3. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq3.jpg">Équation 3</li>
		<li>Où <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq4.jpg"> et <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq5.jpg"> sont les absorptivités molaires de la IONP et le fluorophore, respectivement. Pour ces particules <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq4.jpg"> = 2,06 x 106 M-1cm-1 et pour FITC <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq5.jpg"> = 72 000 M-1cm-1, alors la valeur de <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq6.jpg"> devrait être 28,75. Les taux de Peptide : IONP typique devraient être dans la gamme de 20:1 à 50 : 1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Valider les fonctionnalités des sondes en effectuant un essai in vitro clivage avec.<ol>
<li>Avec du PBS (1 % de BSA), une solution de nanoparticules 18 µL avec une concentration de 200 nM de peptide. Mélanger avec 2 µL de protéase d’intérêt (MMP9 ; 0,1 - 1 mg/mL).</li>
		<li>Incuber dans un lecteur de plaques à 37 ° C pendant 1 heure, en prenant des mesures de fluorescence (en utilisant l’excitation appropriée et les longueurs d’onde d’émission, qui sont 485 nm et 528 nm pour FITC, respectivement) toutes les 1-2 minutes pour surveiller le clivage.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. administration de nano-capteurs et Urine de dépistage du Cancer
Remarque : Pour plus de détails sur le modèle de l’exemple, consultez notre précédent rapport13.
<ol><li>Créer une cage métabolique pour prélèvement d’urine en obtenant un manchon cylindrique au sommet d’une plaque 96 puits. Pendant la collecte de l’urine, placez une souris à l’intérieur de la douille et couvrir avec un couvercle de boîte de Pétri pour empêcher la fuite de l’animal.</li>
	<li>Préparer une solution injectable (volume maximum de 200 µL) contenant des nano-capteurs à une concentration de 3 000 mg/kg (~ 50 µmol) de peptide dans du sérum physiologique stérile.</li>
	<li>Chez les souris femelles, 8 - semaine vieux, nues, portant xénogreffe LS174T Tumeurs colorectales à un fardeau de ~ 100-300 mm3, qui devrait avoir lieu sur environ jour 10, administrer NANOCAPTEUR solution par injection dans la veine queue. Immédiatement après l’injection, placez les souris dans les cages métaboliques et noter le temps d’injection pour chaque souris.</li>
	<li>À 60-90 minutes après l’injection, retirez le manchon cylindrique de plaque à 96 puits. Empêcher les souris et appliquez une légère pression sur la vessie pour induire la souris pour annuler toute urine restant dans l’assiette. Recueillir toutes les urines (200-500 µL).</li>
	<li>Analyser les échantillons d’urine par immunoprécipitation de purifier FITC de l’urine et d’augmenter la sensibilité. Utilisation de billes magnétiques couplées à l’anticorps anti-FITC.<ol>
<li>Tout d’abord, laver 25 mg de billes magnétiques 3 fois avec le tampon de l’enduit et porter le volume final à 225 µL. Remarque : Il est important de faire le tampon de revêtement (borate de sodium 0,1 M, pH 9,5), tampon de blocage (PBS, 0,5 % de BSA, 0,05 % de Tween-20, pH 7,4) et tampon de lavage (PBS, 0,1 % de BSA, 0,05 % de Tween-20, pH 7,4) frais à que chaque fois et environ 20 mL de chacun soient nécessaire.</li>
		<li>Ajouter 200 µL d’anti-FITC (5 mg/mL) et 200 µL de sulfate d’ammonium (3 M). Incuber pendant 16 à 24 heures à 37 ° C sur un agitateur.</li>
		<li>Ajouter la solution d’un séparateur magnétique, retirez le surnageant, remplacer par 625 <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq7.jpg"> Λ blocage de la mémoire tampon et incuber à 37 ° C pendant la nuit. Puis laver 3 fois avec le tampon de lavage et stocker dans 1,25 mL de tampon de lavage.</li>
		<li>Incuber 2 µL d’urine 5 µl de billes magnétiques (20 mg/mL) et porter à un volume total de 50 µL avec du PBS (0,01 % Tween 20). Incuber pendant 60 min.</li>
		<li>Laver deux fois avec 50 µL PBS (0,01 % Tween 20) à l’aide d’un séparateur magnétique de recueillir des billes magnétiques après chaque lavage.</li>
		<li>Éluer deux fois avec 32,5 µL d’acide acétique 5 %. Neutraliser l’élution regroupée (70 µL) 35 µl de 2 M Tris pour atteindre un pH final de ~ 7.</li>
		<li>Lire sur un lecteur de plaque (voir Table des matières) à approprié longueurs d’onde d’excitation et d’émission de fluorescence de l’urine de quantifier. Calculer la concentration de journaliste fluorescent contre une échelle de concentrations connues de fluorophore gratuit.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Choi, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+clearance+of+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Renal clearance of nanoparticles.</a> Nature Biotechnology. 25 (10), 1165-1170 (2007).</li>
<li>Harris, T. J., von Maltzahn, G., Derfus, A. M., Ruoslahti, E., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/anie.200600259">Proteolytic actuation of nanoparticle self-assembly.</a> Angewandte Chemie (International edition in English). 45 (19), 3161-3165 (2006).</li>
<li>Kwon, E. J., Dudani, J. S., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+tumour-penetrating+nanosensors+of+protease+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive tumour-penetrating nanosensors of protease activity.</a> Nature Biomedical Engineering. 1, (2017).</li>
<li>Villanueva, J., Nazarian, A., Lawlor, K., Tempst, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+Peptidase+activities+in+complex+proteomes+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Monitoring Peptidase activities in complex proteomes by MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1167-1183 (2009).</li>
<li>Villanueva, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+exoprotease+activities+confer+tumor-specific+serum+peptidome+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Differential exoprotease activities confer tumor-specific serum peptidome patterns.</a> The Journal of Clinical Investigation. 116 (1), 271-284 (2006).</li>
</ol>

Le Dr Kwong est co-fondateur et sert de conseiller à Glympse Bio, qui développe des produits liés à la recherche décrite dans cet article. Cette étude pourrait influer sur sa situation financière personnelle. Les conditions de cette entente ont été examinées et approuvées par Georgia Tech conformément à sa politique de conflit d’intérêts

Cette méthode décrit le développement de nano-capteurs basés sur les activités consistant en protéase substrats conjugués à un noyau de nanoparticules. L’événement de clivage protéolytique est surnommé le « switch pharmacocinétique », parce que produits peptidiques clivées sont plus petites que la taille de filtration rénale de 5 nm23 et filtre dans l’urine pour produire un signal non invasif. Par conséquent, il est important d’utiliser des nanoparticules ou transporteurs avec un rayon hydrodynami...

Protéases sont des enzymes multifonctionnels qui se spécialisent dans l’hydrolyse des liaisons peptidiques et ont un contrôle important sur nombreux processus biologiques, y compris l’homéostasie, allostasie et maladie1. Une altération de l’état d’activité de la protéase a été corrélée à une variété de maladies, notamment le cancer et les maladies cardiovasculaires, rendant les candidats attrayants protéases pour le développement en biomarqueurs cliniques2,3. En outre, une activité protéase est pathogenèse fonctionnellement lié à distinctes, des patients et le pronostic de la maladie4. De façon générale, biocapteurs ont été développés pour détecter différents phénomènes biologiques et d’autres maladies comme le cancer, des maladies neurodégénératives et transfert d’électron processus5,6,7,8 , 9. plus précisément, les capteurs de protéase axée sur le substrat ont été mis au point pour détecter l’activité de la protéase et incluent des sondes fluorogéniques pour diagnostic imaging10 et isotopiquement étiquetés substrats peptidiques de in vitro détection par spectrométrie de masse à11. En outre, fondé sur l’activité des sondes ont été développés, qui contiennent des régions comme substrat qui lient ou modifient la cible protéase12. Avec cette méthode, la protéase cible est irréversiblement inhibée lorsque le site actif est modifié et analyse nécessite la récolte de tissus, ce qui limite les applications in vivo . Toutefois, il est important de détecter l’activité protéase dans vivo, parce que la régulation de l’activité de la protéase est fortement tributaire du cadre d’autres activités biologiques telles que la présence d’inhibiteurs endogènes.
L’objectif de ce travail est de décrire la formulation de nano-capteurs basés sur les activités qui détectent l’activité protéase dans vivo en produisant un signal mesurable dans l’urine. Cette plateforme est utilisée comme diagnostic non invasif de discriminer les maladies complexes telles que le cancer à l’aide de dysrégulation de l’activité protéase comme biomarqueur fonctionnel. Notre plateforme NANOCAPTEUR se compose des nanoparticules d’oxyde de fer (IONP) conjugués à des substrats de protéase. Ces substrats sont terminées par un journaliste fluorescent qui s’échappe lorsque protéases clivent le substrat. Ces IONPs circulent en vivo, localiser les sites de la maladie et exposent les substrats aux protéases d’associés à la maladie actives. Après clivage, reporters fluorescents sont libérés et, en raison de leur petite taille, sont filtrés dans l’urine, tandis que les substrats clivés sur le IONP restent dans le corps. Par conséquent, une augmentation des activités de protéase en vivo se traduira par des concentrations plus élevées de journaliste dans l’urine (Figure 1). Notre plate-forme étant une analyse d’urine, aucune plateforme d’imagerie n’est nécessaire et signaux de diagnostic sont enrichies dans l’urine.
Cette plate-forme peut être conçue pour détecter une variété de maladies dont le cancer, la fibrose et thrombose13,14. Nous décrivons ici la conception de nano-capteurs pour détecter les altitudes dans la matrice metallopeptidase 9 (MMP9) activité comme biomarqueur du cancer colorectal. Le cancer colorectal est la deuxième cause de décès par cancer aux États-Unis, avec environ 136 800 nouveaux cas et 50 300 décès en 2014 seulement15. Les cellules tumorales colorectal produisent MMP9, qui s’est avérée pour piloter la progression maligne, dégradation de la matrice, ainsi que16de la métastase. En outre, nous avons identifié un substrat adapté de peptide (PLGVRGK) pour MMP9 de la littérature17. Cette plate-forme peut être utilisée pour la détection précoce du cancer et de faible coût point-of-care diagnostic13,14,18,19,20,21.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57937/57937fig1.jpg"> Figure 1 : schéma de NANOCAPTEUR activité In vivo. Nano-capteurs circulent dans le corps et localiser les sites de la maladie. Ensuite, liée à la maladie des protéases clivent substrats peptidiques présentés par IONPs. La taille des fragments clivées permet la clairance rénale, obligeant à localiser dans l’urine. Après que l’animal urine, ces fragments peptidiques peuvent être analysés par leur molécule de journaliste. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57937/57937fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

<table><tbody><tr><td>0,2 et micro ; Filtres pour seringue</td><td>m VWR</td><td>4652</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille 18G</td><td>VWR</td><td>89134-024</td><td></td></tr><tr><td>15 mL coniques</td><td>VWR</td><td>89039-670</td><td></td></tr><tr><td>250 mL Erlenmeyer Flacon</td><td>VWR</td><td>89000-362</td><td></td></tr><tr><td>Barre d’agitation</td><td>VWR</td><td>58949-006</td><td></td></tr><tr><td>Plaque chauffante/agitateur magnétique</td><td>VWR</td><td>97042-634</td><td></td></tr><tr><td>Acide</td> <td>acétique glacialVWR</td><td>97064-482</td><td></td></tr><tr><td>Albumine de sérum de bovin (BSA)</td><td>Thermo Fisher</td><td>A13100</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de fer (III) hexahydraté</td><td>Sigma</td><td>236489</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de fer (II) tétrahydraté</td><td>Sigma</td><td>44939</td><td></td></tr><tr><td>Épichlorhydrine</td><td>Sigma</td><td>45340-500ML-F</td><td></td></tr><tr><td>DMF</td><td>Sigma</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Hydroxyde</td><td>Sigma</td><td>320145-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>granulés Sigma</td><td>221465-500G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>Borate de sodium</td><td>Sigma</td><td>B9876</td><td></td></tr><tr><td>L-Cystéine</td><td>Sigma</td><td>168149-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Comprimés PBS</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Dextran</td><td>Pharmacosmos</td><td>5510 0020 9006</td><td></td></tr><tr><td>Amicon 15 mL 10k filtres, 24 pk</td><td>Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>Amicon 15 mL 30k filtres, 24 pk</td><td>Millipore</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>Amicon 15 mL 100k filtres, 24 pk</td><td>Millipore</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern Panalytical</td><td>NanoZS</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer Cassette de dialyse</td><td>LifeTech</td><td>66130</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Tosylactivated</td><td>LifeTech</td><td>65501</td><td></td></tr><tr><td>SIA</td><td>Life Tech</td><td>22349</td><td></td></tr><tr><td>PEG 20k</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SH-20K-1g</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-fluorescéine [2A3]</td><td>GeneTex</td><td>GTX10257</td><td></td></tr><tr><td>Hiload 16/600 superdex 200</td><td>GE Healthcare</td><td>45-002-490</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de plaques</td><td>Fisher</td><td>BTCYT5M</td><td></td></tr><tr><td>BD Seringues à insuline</td><td>Fisher</td><td>NC0872854</td><td></td></tr></tbody></table>

nano-capteurs pour détecter l’activité protéase in vivo pour le diagnostic non invasif

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Protéases sont des enzymes multifonctionnels qui se spécialisent dans l’hydrolyse des liaisons peptidiques et contrôlent les processus biologiques larges incluant l’homéostasie et allostasie. En outre, dysrégulation de l’activité protéase disques pathogenèse et est un biomarqueur fonctionnel des maladies comme le cancer ; par conséquent, la capacité de détecter l’activité protéase dans vivo peut fournir des renseignements cliniquement pertinents pour le diagnostic biomédical. Le but du présent protocole est de créer des nano-capteurs qui sonde de protéase activité in vivo en produisant un signal quantifiable dans l’urine. Ces Nano-capteurs de protéase se composent de deux éléments : une NANOPARTICULE et le substrat. Les fonctions de nanoparticules pour augmenter le débit Half-Life et substrat de circulation sur les sites de maladies cibles. Le substrat est une séquence de peptide court (6-8, AA), qui est conçue pour être spécifique à un groupe de protéases ou de protéase de la cible. Le substrat est conjugué à la surface de la NANOPARTICULE et se termine par un journaliste, comme un marqueur fluorescent, pour la détection. Comme dysrégulation protéases cleave le substrat de peptide, le journaliste est filtré dans l’urine pour la quantification comme biomarqueurs de l’activité de la protéase. Dans les présentes, nous décrivons la construction d’un NANOCAPTEUR pour métalloprotéinase matricielle 9 (MMP9), qui est lié à la progression tumorale et les métastases, pour le dépistage du cancer colorectal dans un modèle murin.

La majorité de la population des IONPs est autour du diamètre moyen, qui varie de 40 à 50 nm. Après pegylation, cette gamme de taille a une demi-vie de circulation d’environ 6 heures13 in vivo (voir la Figure 2 a). Si l'on veut choisir pour une grandeur particulière, on peut utiliser la chromatographie d’exclusion pour isoler les fractions IONP avec différents diamètres. Les nanoparticules de TEM apparaîtra comme individuels ...

Protéases sont étroitement réglementées des enzymes impliquées dans les processus biologiques fondamentaux et la dysrégulation protéase activité disques progression des maladies complexes telles que le cancer. Objectif de cette méthode consiste à créer des nano-capteurs qui mesurent l’activité protéase dans vivo en produisant un signal de clivage qui est détectable dans l’urine de l’hôte et la maladie est discriminatoire.

Nano-capteurs pour détecter l’activité protéase In Vivo pour le diagnostic non invasif

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le mélange de protéas et les diagnostics, tels que la conception de sondes capables de détecter la progression des maladies en mesurant l’activité des protéases in vivo. Le principal avantage de cette méthode est que les diagnostics développés seront non invasifs et peuvent en fait amplifier la détection de signaux biologiques. Cette méthode peut être appliquée à de nombreuses maladies, car de nombreux proteuses sont en fait des moteurs majeurs de la pathogenèse.Dans la hotte chimique, transférez un ml d’hydroxyde d’ammonium à 30 % dans un tube conique de 15 ml. Placez ce tube dans un seau à glace et laissez-le refroidir pendant 30 minutes. Lavez une fiole Ehrlenmeyer de 250 ml avec de l’eau déminéralisée.Ajoutez ensuite 10 ml d’eau distillée double. Plongez le ballon dans un bain de glace reposant sur une plaque chauffante. À l’aide d’une pipette en plastique, commencez à faire couler l’azote gazeux dans l’eau distillée deux fois dans le ballon.Faites bouillir pendant 15 minutes pour désoxygéner. Ensuite, pesez 4,5 g de dextrine dans un tube conique de 15 ml. Ajouter de l’eau de manière à ce que le volume final du mélan

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Le kit de détection de protéase fluorescent est conçu pour la mesure de l'activité de la protéase à l'aide fluorométrie. Il est également approprié pour la détection de traces de contamination de la protéase. La méthode est basée sur la hydroysis protéolytique d'une formulation exclusive d'un substrat marqué FITC caséine.

L&#39;utilisation du kit de détection de protéase fluorescent pour déterminer l&#39;activité de protéase

Nanoparticules fluorescentes fabriqués dans notre laboratoire sont utilisés pour des concentrations d'ions d'imagerie et de flux d'ions dans les systèmes biologiques tels que les cellules au cours du liquide interstitiel lors de signalisation et de l'homéostasie physiologique.

Nanoparticules fluorescentes pour la mesure de la concentration d&#39;ions dans les systèmes biologiques

Cette vidéo présente un test in vitro permettant de quantifier l’activité de la sérine protéase des neutrophiles dans des échantillons d’expectorations. L’échantillon contenant la protéase sécrétée est incubé à l’aide d’un rapporteur fluorescent portant un motif de reconnaissance. Le clivage du motif par la protéase permet l’émission individuelle de fluorescence par le fluorophore donneur et accepteur du rapporteur, indiquant l’activité de la protéase dans l’échantillon.

Dosage in vitro de l’activité de la sérine protéase des neutrophiles à l’aide d’un rapporteur fluorescent

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L’utilisation d’un test de base de β-lactamase conductimétriques biocapteur pour détecter des Interactions biomoléculaires

L’objectif général du présent protocole est de synthétiser des nano-capteurs fonctionnels pour la portable, rentable, et une détection rapide des spécifiquement les bactéries pathogènes grâce à une combinaison de relaxation magnétique et modalités d’émission de fluorescence.

Pathogènes d’origine alimentaire préalable à l’aide de magnéto-fluorescent NANOCAPTEUR : Détection rapide d’e. Coli O157 : H7

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Découvrez la conception de nano-capteurs pour mesurer l'activité protéase in vivo via l'urine, offrant un diagnostic non invasif. Cette méthode amplifie les signaux biologiques pour détecter précocement diverses maladies.

Nano-capteurs pour détecter l’activité protéase In Vivo pour le diagnostic non invasif

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