Name: Caractérisation des sous-ensembles de Monocyte humain de sang Flow Cytometry analyse (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Apprenez la caractérisation des sous-ensembles de monocytes humains par cytométrie en flux. Cette méthode standardisée permet d'évaluer l'expression des marqueurs M1 et M2 pour les études immunologiques.

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Cytométrie en flux a été réalisée dans le Flow Cytometry Facility de Core qui est pris en charge par l’Institut de Westmead pour la recherche médicale, Westmead Research Hub, Cancer Institute de New South Wales et la National Health and Medical Research Council. Cette étude a été financée par Clinical Chemistry Research and Education Fund.

Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique de recherche humaine WSLHD (HREC) (approbation AU rouge HREC/15/WMEAD/289).
1. préparation pour la cytométrie en flux de sang total
Remarque : Comme le sang humain est potentiellement infectieux, le montage de l’échantillon doit être effectué sous une hotte de biohazard.
<ol><li>Prélever les échantillons de sang des participants dans 3 mL d’éthylène diamine tétra acétique (EDTA) tubes.</li>
	<li>Déterminer le nombre de globules blancs (WBC) à l’aide d’un analyseur de hématologie ou un hémocytomètre.</li>
	<li>Diluée avec du sérum physiologique tamponné au phosphate (PBS) (pH ~ 7,4) pour ajuster la concentration d’environ 5 x 106 globules blancs/mL.</li>
	<li>Préparer la mélange maître suffisante pour le nombre de tubes (par exemple, pour les 14 tubes, préparer 16 x mélange principal) en combinant 16 x volumes de sang µL 50 µL 0,75 anti-CD14-V450, 0,5 µL anti CD16-APC et 0,625 µL anti HLA-DR-PerCP. Vortex et pipette 51,9 µL du mélange dans chaque tube (tableau 1). Remarque : Les anticorps devraient être réglées pour déterminer des concentrations optimales de coloration pour les anticorps fluorescents utilisés.</li>
	<li>Ajouter des marqueurs de surface (contrôle de M1 et M2 ou isotype, phycoérythrine (PE)) anticorps (par exemple selon le tableau 2) et PE des marqueurs de cellules T (CD3), les lymphocytes B (CD19), les neutrophiles (CD66b), et les cellules tueuses naturelles (NK) (CD56) (tableau 3). Vortex et incuber pendant 30 min, 4 ° C dans l’obscurité. Remarque : Les marqueurs pour les lymphocytes, les neutrophiles et les cellules NK sont inclus uniquement pour la validation de la méthode de blocage.</li>
	<li>Ajouter 250 µL de solution fixation combinée de globules rouges de la lyse des globules blancs, vortex, délicatement immédiatement et incuber pendant 10 min à l’obscurité à 4 ° C.</li>
	<li>Ajouter 250 µL de PBS et un essorage cellules vers le bas à 260 x g pendant 10 min à température ambiante.</li>
	<li>Retirer le surnageant, remettre en suspension les cellules dans 300 µL de 1 % de formaldéhyde. Remarque : Le formaldéhyde est toxique. Utilisez des gants en nitrile et sous hotte.</li>
	<li>Conserver à 4 ° C, abri de la lumière jusqu'à ce que l’analyse est réalisée. Remarque : Analyse des flux est recommandé dans les 48 h de préparation de l’échantillon.</li>
</ol>2. cytométrie en flux
<ol><li>Vérifiez journal cytomètre en flux pour assurer le personnel de l’établissement ont effectué des contrôles de qualité. Remarque : Pour garantir la cohérence entre les analyses, instrument de contrôle de qualité et maintenir cohérente intensités de fluorescence de cible à l’aide de billes de contrôle sont recommandées.</li>
	<li>Pour mettre en place l’expérience de cytométrie en flux, cliquez sur « nouvelle expérience puis « nouveau spécimen » et « nouveau tube » pour ajouter des tubes. Sélectionner les graphiques à deux variables en cliquant sur l’icône et utilisez les menus déroulants pour sélectionner les paramètres de l’axe. Assurer l’inclusion d’une parcelle de CD16/CD14 et une parcelle affichant un détecteur aux côtés de temps à surveiller l’acquisition.</li>
	<li>Insérez le tube et cliquez sur « Acquérir ». Vérifiez les paramètres de tension instrument assurant que détecteur de signaux ne sont pas hors échelle.</li>
	<li>Observer des cellules entrant dans la porte de monocyte de l’intrigue de CD14/CD16. La valeur seuil d’enregistrement 5 000 événements pour la porte de monocyte classique et cliquez sur « Enregistrer ».</li>
	<li>Continuer à enregistrer des données pour les tubes restants. Après que les données pour tous les tubes ont été enregistrées, exporter des données de débit sous forme de fichiers .fcs pour l’analyse. Remarque : Pour assurer l’exactitude, contrôles de couleur simple compensation doivent être enregistrés. Une matrice de compensation peut être calculée et appliquée aux données avant analyse pour tenir compte de déversement spectrale plus de15,16.</li>
</ol>3. monocyte Gate
<ol><li>Fichiers ouverts dans le logiciel d’analyse. Double-cliquez sur le nom de tube et sélectionnez Paramètres dans les menus déroulants pour visualiser les cellules sur une zone de dispersion avant FSC (A) / Nuage de FSC(H) de hauteur en avant. Créer un portail d’exclusion doublet en cliquant sur l’icône de l’outil Polygone porte et enfermant les cellules (Figure 1 a).</li>
	<li>Sélectionnez les cellules fermées (en double cliquant sur la région fermée) et dans le nouveau display case ajuster paramètres du menu déroulant pour afficher les cellules sur un FSC (A) / parcelle de diffusion latérale SSC(A). Cliquez sur l’icône porte rectangulaire puis généreusement la population de monocyte basée sur les propriétés de dispersion vers l’avant et latéraux pour exclure la majorité des lymphocytes, les cellules NK et les granulocytes (Figure 1 b).</li>
	<li>Sélectionnez les cellules fermées et réafficher sur un terrain de CD14/CD16, en sélectionnant les paramètres en utilisant les menus déroulants. Cliquez sur la porte de polygone pour sélectionner les monocytes basées sur leur forme caractéristique « ┐ » (Figure 1).</li>
	<li>Sélectionnez les cellules à déchenchements périodiques et sur un terrain de CD16/HLA-DR en utilisant les menus déroulants pour sélectionner les paramètres d’affichage les monocytes. Cliquez sur la porte de polygone pour sélectionner les cellules positives de HLA-DR et exclure tout restant NK les cellules et les neutrophiles17 (Figure 1).</li>
	<li>Sélectionnez les cellules à déchenchements périodiques et sur un terrain de CD14/HLA-DR, en utilisant les menus déroulants pour sélectionner les paramètres d’affichage les cellules positives de HLA-DR. Cliquez sur la porte de polygone et dessinez une porte pour exclure les cellules de faible haute/CD14 HLA-DR (lymphocytes B expriment des niveaux élevés de HLA-DR, mais pas de CD14) (Figure 1E). Remarque : contamination de lymphocytes B peuvent survenir et donc devrait être étudiée. Si la population non classique à la Figure 1 n’est pas distincte de cellules à sa gauche, alors que la contamination est probable. Étape 3.5 peut être ignorée si lymphocytes B sont chevauchent pas avec des monocytes non-classique.</li>
	<li>Sélectionnez les cellules fermées et utilisez les menus déroulants pour les afficher sur un terrain de CD16/CD14. Des options de tracé, sélectionnez « Complot Zebra » qui permettra aux portes de sous-ensemble de monocytes à tirer pour déterminer les proportions de sous-ensemble (Figure 1F). Remarque : si zèbre intrigue n’est pas disponible sur le logiciel d’analyse, pseudo couleur (lisse) ou contour tracé peut convenir.</li>
	<li>Cliquez sur l’icône porte rectangulaire et sélectionnez les monocytes classiques en dessinant une porte rectangulaire environ autour de la population de monocytes bas, classique de haute/CD16 CD14. Dans « Affichage », sélectionnez « Afficher les médianes » pour afficher l’intensité de fluorescence médian pour les monocytes classiques. Régler la porte de sorte que la population a une répartition égale de la médiane à gauche et à droite qui englobe toutes les cellules vers la gauche.</li>
	<li>Sélectionnez la population intermédiaire en dessinant une porte rectangulaire qui englobe les cellules vers la droite de la porte classique. Régler le bas de la porte d’exclure les cellules non classique en alignant la porte avec le fond des cercles concentriques qui relèvent entièrement de la porte de monocyte classique, qui fait en sorte que le sous-ensemble intermédiaire a une expression de CD14 comparable à la population principale classique conforme à la nomenclature actuelle.</li>
	<li>Porte le sous-ensemble non classique en dessinant une boîte rectangulaire partir du bord inférieur du sous-ensemble intermédiaire, sélectionner toutes les cellules vers le bas de la population (Figure 1F).</li>
	<li>Dans « Affichage », sélectionnez « Afficher les fréquences porte » pour déterminer le pourcentage de chaque sous-ensemble de monocytes.</li>
</ol>4. validation de la méthode de déclenchement
<ol><li>Pour déterminer si les types de cellules potentiellement contaminante sont effectivement bloquées-out, tout d’abord identifier les différentes populations cellulaires avec des anticorps dirigés contre les lymphocytes T (CD3), les lymphocytes B (CD19), neutrophiles (CD66b) et les cellules NK (CD56) (Figure 2). NOTE : Ici T cellules neutrophiles ne siègent pas à proximité de la forme « ┐ » des monocytes et sont bloqués dehors à la Figure 1.</li>
	<li>Confirment que les cellules NK sont retirées à l’étape 3.4 (Figure 1), et les cellules B sont supprimés à l’étape 3.5 (Figure 1E) comme illustré à la Figure 3. Si les cellules NK ou les lymphocytes B ne sont pas bloquées-out, réajuster les portes.</li>
</ol>5. phénotypique Monocyte Marker Expression
<ol><li>Sélectionnez les cellules de chaque sous-ensemble de monocytes. Modifier les paramètres de la liste déroulante pour créer un histogramme pour chaque sous-ensemble de monocyte (Figure 1F) affichant chaque marqueur et son isotype correspondant (Figure 4).</li>
	<li>Calculer le degré d’expression de chaque marqueur (médiane ou moyenne géométrique) par rapport au contrôle isotype respectifs.</li>
</ol>

<ol><li>Ziegler-Heitbrock, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nomenclature+of+monocytes+and+dendritic+cells+in+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood.</a> Blood. 116 (16), e74-e80 (2010).</li>
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<li>Heine, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+subpopulations+and+cardiovascular+risk+in+chronic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Monocyte subpopulations and cardiovascular risk in chronic kidney disease.</a> Nature Review Nephrology. 8 (6), 362-369 (2012).</li>
<li>Rogacev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD14%2B%2BCD16%2B+monocytes+independently+predict+cardiovascular+events%3A+a+cohort+study+of+951+patients+referred+for+elective+coronary+angiography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">CD14++CD16+ monocytes independently predict cardiovascular events: a cohort study of 951 patients referred for elective coronary angiography.</a> Journal of the American College of Cardiology. 60 (16), 1512-1520 (2012).</li>
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<li>Fadini, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unbalanced+monocyte+polarisation+in+peripheral+blood+and+bone+marrow+of+patients+with+type+2+diabetes+has+an+impact+on+microangiopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">An unbalanced monocyte polarisation in peripheral blood and bone marrow of patients with type 2 diabetes has an impact on microangiopathy.</a> Diabetologia. 56 (8), 1856-1866 (2013).</li>
<li>Satoh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbalanced+M1%2FM2+phenotype+of+peripheral+blood+monocytes+in+obese+diabetic+patients%3A+effect+of+pioglitazone%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Unbalanced M1/M2 phenotype of peripheral blood monocytes in obese diabetic patients: effect of pioglitazone.</a> Diabetes Care. 33 (1), 7(2010).</li>
<li>Chen, X., Devaraj, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytes+from+metabolic+syndrome+subjects+exhibit+a+proinflammatory+M1+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Syndrome+and+Related+Disorders%22%5BJournal%5D)">Monocytes from metabolic syndrome subjects exhibit a proinflammatory M1 phenotype.</a> Metabolic Syndrome and Related Disorders. 12 (7), 362-366 (2014).</li>
<li>Williams, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+classical+monocytes+display+unbalanced+M1%2FM2+phenotype+with+increased+atherosclerotic+risk+and+presence+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22International+Angiology%22%5BJournal%5D)">Human classical monocytes display unbalanced M1/M2 phenotype with increased atherosclerotic risk and presence of disease.</a> International Angiology. 36 (2), 145-155 (2017).</li>
<li>Wong, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+reveals+the+defining+features+of+the+classical%2C+intermediate%2C+and+nonclassical+human+monocyte+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets.</a> Blood. 118 (5), e16-e31 (2011).</li>
<li>Hijdra, D., Vorselaars, A. D., Grutters, J. C., Claessen, A. M., Rijkers, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+characterization+of+human+intermediate+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Phenotypic characterization of human intermediate monocytes.</a> Frontiers in Immunology. 4, 339(2013).</li>
<li>Zawada, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+different+strategies+for+human+monocyte+subsets+gating+within+the+large-scale+prospective+CARE+FOR+HOMe+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Comparison of two different strategies for human monocyte subsets gating within the large-scale prospective CARE FOR HOMe Study.</a> Cytometry Part A. 87 (8), 750-758 (2015).</li>
<li>Patel, V. K., Williams, H., Li, S. C. H., Fletcher, J. P., Medbury, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+inflammatory+profile+is+specific+for+individuals+and+associated+with+altered+blood+lipid+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Monocyte inflammatory profile is specific for individuals and associated with altered blood lipid levels.</a> Atherosclerosis. 263, 15-23 (2017).</li>
<li>Bayer, J., Grunwald, D., Lambert, C., Mayol, J. F., Maynadie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thematic+workshop+on+fluorescence+compensation+settings+in+multicolor+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+B%3A+Clinical+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Thematic workshop on fluorescence compensation settings in multicolor flow cytometry.</a> Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 72 (1), 8-13 (2007).</li>
<li>Szaloki, G., Goda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensation+in+multicolor+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Compensation in multicolor flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 87 (11), 982-985 (2015).</li>
<li>Abeles, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD14%2C+CD16+and+HLA-DR+reliably+identifies+human+monocytes+and+their+subsets+in+the+context+of+pathologically+reduced+HLA-DR+expression+by+CD14%28hi%29+%2FCD16%28neg%29+monocytes%3A+Expansion+of+CD14%28hi%29+%2FCD16%28pos%29+and+contraction+of+CD14%28lo%29+%2FCD16%28pos%29+monocytes+in+acute+liver+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">CD14, CD16 and HLA-DR reliably identifies human monocytes and their subsets in the context of pathologically reduced HLA-DR expression by CD14(hi) /CD16(neg) monocytes: Expansion of CD14(hi) /CD16(pos) and contraction of CD14(lo) /CD16(pos) monocytes in acute liver failure.</a> Cytometry Part A. 81 (10), 823-834 (2012).</li>
<li>Mukherjee, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Classical+monocytes+display+inflammatory+features%3A+Validation+in+Sepsis+and+Systemic+Lupus+Erythematous%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Non-Classical monocytes display inflammatory features: Validation in Sepsis and Systemic Lupus Erythematous.</a> Scientific Reports. 5, 13886(2015).</li>
<li>Lundahl, J., Halldén, G., Hallgren, M., Sköld, C. M., Hed, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+expression+of+CD11b%2FCD18+and+CD62L+on+human+monocytes+after+cell+preparation+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Altered expression of CD11b/CD18 and CD62L on human monocytes after cell preparation procedures.</a> Journal of Immunological Methods. 180 (1), 93-100 (1995).</li>
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<li>Hofer, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((slan-defined+subsets+of+CD16-positive+monocytes%3A+impact+of+granulomatous+inflammation+and+M-CSF+receptor+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">slan-defined subsets of CD16-positive monocytes: impact of granulomatous inflammation and M-CSF receptor mutation.</a> Blood. 126 (24), 2601-2610 (2015).</li>
<li>Qiu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracting+a+cellular+hierarchy+from+high-dimensional+cytometry+data+with+SPADE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE.</a> Nature Biotechnology. 29, 886(2011).</li>
<li>Thomas, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Blood+Monocyte+Subsets%3A+A+New+Gating+Strategy+Defined+Using+Cell+Surface+Markers+Identified+by+Mass+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Human Blood Monocyte Subsets: A New Gating Strategy Defined Using Cell Surface Markers Identified by Mass Cytometry.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (8), 1548-1558 (2017).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Cytométrie en flux de sang est une approche idéale pour étudier les monocytes que les cellules sont examinées dans des conditions proches de leur microenvironnement physiologique, fournissant un aperçu de leur rôle dans les maladies infectieuses et inflammatoires. En outre, l’utilisation de produits frais (c'est-à-dire, en l’État) des échantillons de sang réduit au minimum les modifications ou transformations cellulaires qui peuvent se produire en raison de stockage ou manipulation18,19, tels que ceux connus pour se produire avec les monocytes de gel-dégel 20. préparation de l’échantillon rapide est recommandée car certains marqueurs sont surexprimés si les échantillons sont conservés à température ambiante avant de la traiter19. Les concentrations optimales de marqueurs M1 et M2 ont été déterminées par titrage, et cela devrait être fait pour les tout nouveaux anticorps afin de limiter les liaisons non spécifiques tout en s’assurant que le degré de changement est due à l’expression de l’antigène et pas limités par l’absence d’anticorps. L’élimination des globules rouges et la fixation des globules blancs avec solution de lyse sont une étape importante dans le présent protocole, comme la présence de globules rouges peut interférer avec l’écoulement cytometry21,22. Notez que bien que certaines solutions de lyse soient compatibles avec une coloration non-laver, les populations plus claires sont évidentes entre nos mains lorsqu’une étape de lavage est utilisée.
Montage correct du cytomètre est également critique en comparant l’expression des marqueurs de monocyte. Nous recommandons que les chercheurs maintiennent les intensités de fluorescence des cibles cohérentes des perles de contrôle et effectuent un contrôle qualité sur l’instrument à utiliser pour fournir des résultats cohérents à travers différents échantillons courir sur des jours différents. En outre, isotype contrôles sont utilisés pour aider à interpréter n’importe quel signal de fond non spécifiques généré par la liaison des anticorps non-spécifiques. Monocytes ont des récepteurs de Fc11 élevées et sont donc sujettes à non-spécifiques. À noter, le degré de liaison non spécifique est différent pour les différents sous-ensembles, et ainsi l’utilisation d’un contrôle d’isotype devient importante lorsque l'on compare le degré d’expression de marqueurs entre sous-ensembles.
Un autre critère important à prendre en considération est le mécanisme de sélection mesures employé. Certaines études suggèrent qu’il est crucial de dessiner une porte étanche autour du monocyte population FSC(A)/SSC(A) complotent pour se débarrasser de la plupart des non-monocytaire CD16 cellules positives23,24,25, mais cela peut conduire à la perte de certains monocytes comme non-monocyte cellules monocytes sur FSC/SSC peuvent chevaucher parcelles26. Pour exclure toute les autres cellules sanguines susceptibles de contaminer les monocytes, l’inclusion d’un troisième marqueur de monocyte outre CD14 et CD16, est plutôt essentiel26,27. Pour cette raison, HLA-DR est souvent utilisé et est idéal car il n’est pas exprimée par NK cellules ou neutrophiles17,28. Bien que les lymphocytes (cellules B et les lymphocytes T) peuvent exprimer HLA-DR, ils diffèrent des monocytes à l’égard de l’expression de CD14. HLA-DR est un marqueur de troisième idéal, CD86 a aussi été recommandé5,27,29 mais non utilisée ici car c’est aussi un marqueur de M1 et ainsi son degré d’expression sur des sous-ensembles de monocyte a été évaluée.
Validation de la stratégie de blocage utilisée est d’une importance cruciale. Alors que les cellules NK sont connus pour se chevauchent avec non-classiques, si ils ne sont pas bloquées28, nous remarquons que les cellules B peuvent se chevauchent aussi avec le non-classiques (Figure 2 b) ; Si c’est le cas dans d’autres études peut dépendre le choix fluorochrome, configuration de l’instrument, sensibilité du détecteur ou même l’état pathologique en cours d’examen. Ici, le chevauchement B cellules ont montré forte expression de HLA-DR et ont été bloqués pas dehors par la sélection des cellules positives de HLA-DR dans la Figure 1. Au contraire, pour éliminer les cellules de B, nous avons utilisé une parcelle supplémentaire de CD14 / HLA-DR, où les cellules B séparent de non-classiques en raison de leur supérieur HLA-DR et faible expression CD14.
Il y a aussi des différentes manières dont les portes pour les monocytes eux-mêmes ont été tirés dans la littérature ; Il s’agit de quadrants (les sous-ensembles sont séparées par des marqueurs de quadrant) et les boîtes rectangulaires ou trapézoïdales13 (avec des cases distinctes pour chaque sous-ensemble) qui par ailleurs se distinguent par leur placement délimiter où un sous-ensemble se termine et une autre commence. Ces différences susceptibles de tenir compte du fait que les monocytes existent comme un ensemble homogène de cellules, différenciant des classiques à non-classique, plutôt que comme des populations bien distinctes. Cependant, parce que les variations de techniques pour identifier les sous-ensembles eux-mêmes peuvent conduire à des différences dans les proportions de sous-ensemble de monocyte calculé, il devient important que la méthode de blocage est raisonnablement objectif plutôt que subjectif, comme cela sera rendez la méthode plus robustes et reproductibles. Certaines études utilisent un contrôle de l’isotype pour CD16 afin de déterminer la frontière entre les sous-ensembles classique et intermédiaire30. En revanche, pour définir la séparation entre intermédiaires et non classiques, il a été proposé que la ligne de coupure peut être verticale ou oblique, avec le choix jusqu'à les enquêteurs, la condition étant qu'il doit être reproductible, mais une porte rectangulaire a été recommandée pour faciliter les comparaisons entre les études13,30,31. Ici, objectivité accrue a été obtenue en traçant les données sur un terrain de zèbre et en appliquant des règles objectives visuelles, parce que zebra parcelles fournissent un signal supplémentaire de visualisation en mélangeant le dégradé de couleur à chaque emplacement de probabilité égale sur un tracé d’isolignes traditionnel. La bordure droite du sous-ensemble classique a été dessinée de telle que la population est uniformément répartie autour de la médiane de la population. La division entre les intermédiaires et les non-classiques ont été également normalisée en ayant à la base des intermédiaires s’aligner sur le fond des cercles concentriques au sein de la population classique (c'est-à-dire la population intermédiaire clairement exprime des niveaux élevés de CD14, selon la nomenclature normalisée1).
Alors que certaines études ont suggéré l’utilisation de marqueurs additionnels, tels que C-C type de récepteur de chimiokine 2 (CCR2) ou de sulfo-6 LacNAc (SLAN) pour obtenir l’énumération réussie de monocytes et de révéler leur signification clinique32,33 , dans nos mains le niveau d’expression de nombreux repères fonctionnels de monocyte varie considérablement entre les individus,14. Une telle variation peut limiter l’utilité de ces marqueurs pour définir des sous-ensembles en fonction de leur expression. Des approches informatiques automatisés ont également servis à visualiser et sous-ensembles de monocyte notamment visuel interactif stochastique voisin embedding (viSNE), t-distribué stochastique voisin embedding (tSNE) ou Spanning tree Progression de cluster Analyse de densité normalisé événements (bêche)34,35, qui peut fournir une représentation visuelle des cellules basées sur le jeu de multiples marqueurs utilisés. Tandis que ceci a été montré pour augmenter la précision de la stratégie de blocage dans la classification de sous-ensemble de monocytes, il est reconnu qu’un inconvénient est le nombre d’anticorps (et les canaux correspondants de fluorophore) requis. Son utilité dépend de questions posées ; la complexité supplémentaire ne peut pas être justifiée, par exemple, dans les études de l’énumération.
Monocytes gated avec notre technique montrent des proportions conforme à la littérature et l’expression des marqueurs de surface par les trois sous-ensembles peut être facilement déterminée. Globalement, la technique et la méthode expliquée ici fournit une méthode normalisée et simple énumération des proportions de sous-ensemble de monocytes et évaluer l’expression de marqueurs de surface, qui peut être étendue pour inclure les autres marqueurs ainsi, ce qui valider leurs rôles fonctionnels dans d’autres conditions.

Les monocytes sont un type de globules blancs qui jouent un rôle majeur dans la promotion et la résolution de l’inflammation. Il y a trois principaux sous-ensembles de monocytes reconnues, classiques (~ 85 %), intermédiaire (~ 5 %) et non classique (~ 10 %) monocytes, qui sont caractérisées par leur niveau de cluster de différenciation (CD) 14 et CD16 expression1. Les proportions des sous-ensembles de monocytes peuvent varier avec la présence de la maladie, comme une proportion accrue des intermédiaires dans les divers états inflammatoires2,3 , y compris les maladies cardiovasculaires, où le niveau des intermédiaires est associé à des événements cliniques4,5. En outre, dans des conditions de maladie, monocytes peuvent aussi subir des changements fonctionnels, avec de nombreux changements détectables par une différence de surface marqueur expression6,7. Un tel exemple est monocyte M1-inclinaison, une augmentation de marqueurs associés à macrophages M1, qui a été observée dans les maladies cardiovasculaires, le diabète, l’obésité et syndrome métabolique7,8,9 , 10.
Malgré la popularité de cytométrie de flux pour évaluer la fonction et la proportion de sous-ensemble de monocytes, il y a une variabilité considérable dans la préparation des échantillons et sous-ensemble Gate entre les études, ce qui rend difficile de comparer les résultats entre ces études. Ce qui est important, il n’y a pas de consensus dans la délimitation des sous-ensembles de monocytes, mais une approche normalisée est essentielle compte tenu de l’importance clinique des changements dans les proportions de sous-ensemble dans plusieurs maladies. Une partie de la difficulté à blocage procède du fait que les monocytes différencient du classique à travers l’intermédiaire avec le sous-ensemble non-classique11 et à ce titre, les monocytes existent comme un spectre continu plutôt que des populations distinctes12 . Fait intéressant, Zawada et coll. ont montré qu’en utilisant soit un rectangulaire ou trapézoïdale blocage du sous-ensemble intermédiaire, tous deux entraîné dans un sous-groupe intermédiaire supérieur qui prédit une des manifestations cardiovasculaires13. Cela met en évidence que, au moins pour le calcul des proportions, la question clé est appliquant une stratégie cohérente de blocage entre les différents échantillons (et études), plutôt que d’essayer de distinguer définitivement les sous-ensembles. Blocage définitif peut être plus important lors de l’évaluation de fonction, le changement dans l’expression du marqueur entre sous-ensembles est incrémentielle de12,14, et donc encore une fois, cohérence dans le processus de blocage est peut-être clé. Par conséquent, un objectif gating méthode reproductible répartit les sous-ensembles de monocyte entre différents échantillons est nécessaire. Le but de la méthode présentée ici est à la porte des sous-ensembles de monocytes avec une explication claire et justification de la technique de blocage emploient et évaluer les sous-ensembles pour l’expression du marqueur de surface, offrant ainsi une méthode qui permet aux chercheurs d’avoir confiance dans l’utilisation de cette technique lors de l’évaluation des échantillons différents.

<table><tbody><tr><td>Kit de prélèvement sanguin BD vacutainer</td><td>Becton Dickinson</td><td>367286</td><td></td></tr><tr><td>BD vacuitainer K2E 5,5 mg plus tubes de prélèvement sanguin -3,0 mL</td><td>Becton Dickinson</td><td>7128959</td><td></td></tr><tr><td>Phospahate Buffered Saline (PBS)</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>5ml polystyrène tube FACS à fond rond (style 12 mm x 75 mm)</td><td>Technologies Invitro</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-CD14 de souris V450 [M&phi ; P9]</td><td>BD Biosciences</td><td>560349</td><td></td></tr><tr><td>APC Souris monoclonal Anticorps anti-CD16 [3G8]</td><td>Abcam Australia</td><td>ab140477</td><td></td></tr><tr><td>Per CP Anticorps anti-HLA-DR humain [L243]</td><td>BioLegend</td><td>307628</td><td></td></tr><tr><td>PE Souris IgG1 &kappa ; Contrôle des isotypes [MOPC-21]</td><td>BD Biosciences</td><td>555749</td><td>Lot # 4283901</td></tr><tr><td>Anticorps anti-humain CD163 de souris PE [GHI/61]</td><td>BD Biosciences</td><td>556018</td><td>Lot # 2335626</td></tr><tr><td>Anticorps anti-humain CD64 de souris PE [10.1]</td><td>BD Biosciences</td><td>558592</td><td>Lot # 36768</td></tr><tr><td>Anticorps anti-CD86 de souris PE [2331 (FUN-1)]</td><td>BD Biosciences</td><td>555658</td><td>Lot # 3109766</td></tr><tr><td>Anticorps anti-humain CD11b/Mac-1 de souris PE [ ICRF44]</td><td>BD Biosciences</td><td>561001</td><td>Lot # 3228959</td></tr><tr>Contrôle de<td>l’isotype IgG2A de souris PE [20102]</td><td>R& D Systems</td><td>IC003P</td><td>Lot # 1212031</td></tr><tr><td>PE Anticorps anti-TNF humain RII/TNFRSF1B [22235]</td><td>R& D Systems</td><td>FAB226P</td><td>lot # 612051</td></tr><tr><td>PE souris IgG1, &kappa ; Contrôle des isotypes [MOPC-21]</td><td>BioLegend</td><td>400112</td><td>Lot # B220359</td></tr><tr><td>Anticorps anti-CD93 humain PE [VIMD2]</td><td>BioLegend</td><td>336107</td><td>Lot # B143544</td></tr><tr><td>Anticorps CD3 anti-humain de souris PE [SK7]</td><td>BD Biosciences</td><td>347347</td><td>Lot # 3010929</td></tr><tr><td>Anticorps anti-CD19 humain de souris PE [HIB19]</td><td>BD Biosciences</td><td>561741</td><td>Lot # 2307721</td></tr><tr><td>Anticorps anti-CD56 humain de souris PE [B159]</td><td>BD Biosciences</td><td>561903</td><td>Lot # 3011796</td></tr><tr><td>PE Anticorps anti-humain CD66b [G10F5]</td><td>BioLegend</td><td>305105</td><td>Lot # B154037</td></tr><tr><td>OptiLyse C</td><td>Beckman Coulter</td><td>A11895</td><td></td></tr><tr><td>Solution de formaldéhyde 37 %</td><td>Sigma</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto II Cytomètre en flux</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analyseur automatique d’hématologie, XT-1800i</td><td>Sysmex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse GS-6R</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flowjo logiciel v10.0.7</td><td>Tree Star Inc</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

caractérisation des sous-ensembles de monocyte humain de sang flow cytometry analyse

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Les monocytes sont les principaux contributeurs dans divers troubles inflammatoires et altérations de ces cellules, y compris leurs proportions de sous-ensemble et fonctions, peuvent avoir de signification pathologique. Une méthode idéale pour l’examen des modifications des monocytes est cytométrie en flux de sang comme la manipulation minimale des échantillons par cette méthode limite d’activation des cellules artéfactuelle. Cependant, différentes approches sont prises pour les sous-ensembles de monocyte menant à l’identification incompatible des sous-ensembles entre les études de la porte. Nous démontrons une méthode à l’aide de cytométrie en flux de sang pour identifier et caractériser les sous-ensembles de monocyte humain (classiques, intermédiaires et non classique). Nous exposons comment préparer les échantillons de sang pour la cytométrie en flux, porte les sous-ensembles (Assurez-vous que les cellules contaminantes ont été supprimées) et déterminer l’expression de sous-ensemble de monocyte des marqueurs de surface — dans le présent exemple M1 et M2 marqueurs. Ce protocole peut être étendu à d’autres études qui nécessitent une méthode de blocage standard pour évaluer les proportions de sous-ensemble de monocytes et expression de sous-ensemble de monocyte des autres marqueurs fonctionnels.

La stratégie de blocage de monocytes et analyse en cytométrie en flux utilisé ici (Figure 1) correctement contrôlé les sous-ensembles de monocytes et révèlent leurs proportions relatives. Les proportions (pour cet exemple) ont été calculées comme des classiques de 88,1 %, 4,33 % intermédiaires et 7,49 % non-classiques. Ces portes de sous-ensemble n’étaient pas contaminés par les lymphocytes B, les lymphocytes T, neutrophiles ou cellules NK, qui a été confirmé avec les marqueurs CD19, CD3, CD56 et CD66b, respectivement. En évaluant la position relative des autres populations, il est clair que les lymphocytes T et les neutrophiles tombent bien en dehors de la forme de monocytes » ┐ » sur un terrain de CD16/CD14 (Figure 2 a et 2D). Cependant, les cellules NK et les populations de lymphocytes B se chevauchent avec la population de monocyte non classique (Figure 2 b et 2C). Les étapes de la stratégie de blocage (Figure 1 et 1E) ont été confirmés d’exclure les cellules NK (Figure 3 a) et les lymphocytes B (Figure 3 b). Bien que la population de lymphocytes B comprenait une petite partie des monocytes non classique, la quantité est négligeable.
Après avoir contrôlé les sous-ensembles, le degré auquel ils ont exprimé différents marqueurs de surface, M1 (CD64, CD86 et CD120b) et M2 (CD163, CD11b et CD93) a été évaluée. Les marqueurs ont montré expression positive par rapport à leurs contrôles correspondants de l’isotype, comme en témoigne le passage des histogrammes (Figure 4). La médiane des marqueurs était supérieure à celle des témoins isotype.
Application de cette stratégie de blocage à un échantillon de sang, qui a été divisée en quatre tubes, colorées et analysés séparément, les rendements des résultats comparables entre les tubes (tableau 4).
<img alt="Nuages de points de cytométrie en flux ; classification des cellules immunitaires ; diagramme; Marqueurs de CD ; Analyse de sous-populations." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57941/57941fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figure 1 : monocyte représentant gating stratégie dans le sang humain total. (A) FSC(A) vs FSC(H) terrain : bloquant les cellules qui ont une superficie égale et une hauteur, éliminant ainsi les touffes (plus FSC(A) par rapport à des FSC(H)) et des débris (très faible FSC) K = 1000. (B) FSC(A) vs SSC(A) terrain : large choix de monocytes selon leurs propriétés SSC/FSC. (C) CD16 vs CD14 intrigue : Gating pour sélectionner les monocytes basé sur leur forme caractéristique « ┐ ». (D) CD16 vs HLA-DR intrigue : mécanisme de sélection pour sélectionner les cellules positives de HLA-DR et éliminer les cellules NK. (E) CD14 vs HLA-DR : blocage d’exclure les cellules B (HLA-DR haute/CD14 faible) les monocytes. (F) sélectionné monocytes réaffichées sur CD16 vs CD14 complot pour porte les sous-ensembles de monocytes. Pour A-F couleur représente la densité cellulaire bleu et vert indiquant la densité faible, rouge et orange indiquant haute densité et orange indiquant la densité du milieu de gamme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57941/57941fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Diagrammes de cytométrie en flux de la différenciation des cellules immunitaires : cellules T, B, NK, neutrophiles ; Marqueurs CD." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57941/57941fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figure 2 : Validation de gating stratégie par l’identification de cellules pourraient les contaminer. Les cellules potentiellement contaminantes sont identifiés par des marqueurs cellules (A) T (CD3), (B), B (CD19) des cellules, les cellules NK (C) (CD56) et neutrophiles (D) (CD66b). Les panneaux de gauche montrent d’identification de chaque population après déclenchement selon Figure 1bis et 1 b, avec la couleur qui représente la densité cellulaire de haute (rouge) à faible (bleu). Les panneaux de droite montrent chaque population cellulaire (bleu) superposée à l’intrigue de CD16/CD14 monocyte final de révéler à proximité de ces populations aux monocytes (rouges). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57941/57941fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Analyse par cytométrie en flux ; nuages de points de monocytes, de cellules NK et B par marqueurs CD, distribution de données." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57941/57941fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figure 3 : Confirmation que les étapes gating supprimer cellules contaminantes. Chaleur des cartes montrant le niveau d’expression du haut (rouge) en bas pour (bleu) du CD56 (A) et (B) CD19. Gating d’étapes excluent avec succès les cellules avec haute CD56 (cellules NK) et haute CD19 (cellules B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57941/57941fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Graphiques de cytométrie en flux ; Marqueurs M1, M2 ; Phénotypes des macrophages : classique, intermédiaire, non classique." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57941/57941fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figure 4 : expression de Monocyte de M1 (CD120b) et M2 (CD93) marqueurs. Lissé les histogrammes des monocytes M1 et M2 marqueur expression montrant un changement manifeste de l’isotype (rouge) pour (A) classiques, des intermédiaires (B) et (C) non-classiques (bleue). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57941/57941fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Anticorps</td>
			<td>Volume (sang de 50 µL)</td>
			<td>Sang de 800 µL volume (x 16)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD14 - V450</td>
			<td>0.75 ΜL</td>
			<td>12 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD16 - APC</td>
			<td>0,5 ΜL</td>
			<td>8 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DR-PerCP</td>
			<td>0,625 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Anticorps pour l’écoulement de sang total et mélange principal.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tube</td>
			<td>Anticorps de PE</td>
			<td>Code</td>
			<td>Isotype Match</td>
			<td>Concentration de stock</td>
			<td>Volume de travail</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>IgG1</td>
			<td>BD (555749)</td>
			<td>NA</td>
			<td>1,0 µg/20 µL</td>
			<td>0,625 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>CD163</td>
			<td>BD (556018)</td>
			<td>IgG1 de BD</td>
			<td>0,125 µg/20 µL</td>
			<td>5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>CD64</td>
			<td>BD (558592)</td>
			<td>IgG1 de BD</td>
			<td>0,06 µg/20 µL</td>
			<td>10 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>IgG1</td>
			<td>BD (555749)</td>
			<td>NA</td>
			<td>1,0 µg/20 µL</td>
			<td>1,25 ML</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>CD86</td>
			<td>BD (555658)</td>
			<td>IgG1 de BD</td>
			<td>1,0 µg/20 µL</td>
			<td>1,25 ML</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>CD11b</td>
			<td>BD (561001)</td>
			<td>IgG1 de BD</td>
			<td>1,0 µg/20 µL</td>
			<td>1,25 ML</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>IgG2a</td>
			<td>R &amp; D (IC003P)</td>
			<td>NA</td>
			<td>25 µg/mL</td>
			<td>5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>CD120b (TNFRII)</td>
			<td>R &amp; D (FAB226P)</td>
			<td>R &amp; D IgG2a</td>
			<td>25 µg/mL</td>
			<td>5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>IgG1</td>
			<td>BL (400112)</td>
			<td>NA</td>
			<td>0,2 mg/mL</td>
			<td>2,5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>CD93</td>
			<td>BL (336108)</td>
			<td>IgG1 BL</td>
			<td>50 µg/mL</td>
			<td>1,25 ML</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2 : M1/M2-PE Fluorochrome étiquetés anticorps monoclonaux pour l’écoulement de sang.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tube</td>
			<td>Anticorps</td>
			<td>Volume de travail</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>CD3</td>
			<td>5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>CD19</td>
			<td>5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>13</td>
			<td>CD66b</td>
			<td>1,25 ML</td>
		</tr>
<tr>
<td>14</td>
			<td>CD56</td>
			<td>5 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 3 : PE Fluorochrome étiquetés anticorps monoclonaux pour les lymphocytes (cellules T, lymphocytes B), les neutrophiles et les cellules NK.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tube</td>
			<td>% De musique classique</td>
			<td>% Intermédiaire</td>
			<td>% Non classique</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>84,3</td>
			<td>5.11</td>
			<td>10.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>84,2</td>
			<td>5.05</td>
			<td>10.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>84,3</td>
			<td>5.03</td>
			<td>10.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>81,6</td>
			<td>5.03</td>
			<td>12.1</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 4 : Des proportions de sous-ensemble de monocytes du un sang échantillon souillé et analysé séparément.

Nous présentons ici un protocole pour caractériser les sous-ensembles de monocyte par cytométrie en flux de sang. Cela inclut décrivant comment les sous-ensembles de la porte et évaluer leur expression de marqueurs de surface et donne un exemple de l’évaluation de l’expression des marqueurs de M2 (anti-inflammatoire) et de M1 (inflammatoire).

Caractérisation des sous-ensembles de Monocyte humain de sang Flow Cytometry analyse

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Cette technique peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie. Par exemple, déterminer comment les proportions du sous-ensemble des monocytes, ou l’expression de différents marqueurs, sont modifiées dans les états de la maladie. Le principal avantage de cette technique, c’est que les cellules sont proches de leur état d’origine, et que des instructions claires et la justification sont utilisées, pour fournir une méthode de gating normalisée.Généralement, les individus nouveaux à cette méthode peuvent lutter, parce que beaucoup d’articles ne donnent pas des instructions claires sur la façon dont le gating des cellules a été exécuté. Commencez ce protocole par la collecte d’échantillons de sang et la détermination du nombre de globules blancs, tel que détaillé dans le protocole de texte. Diluer le sang avec de la solution saline tamponnée de phosphate, pour ajuster la concentration à environ 5 millions de globules blancs par millilitre.Préparez un mélange maître suffisant pour le nombre de tubes en combinant le sang, anti CD14-V450, anti CD16-APC et anti HLA-DR-PerCP. Vortex et pipette 51,9 microlitres de mélange dans chaque tube. Ajoutez des anticorps marqueurs M1 et M2 étiquetés PE, ainsi que des marqueurs pour les cellules T, les cellules B, les neutrophiles et les cellules tueuses naturelles à leurs tubes correspondants.Vortex et incuber pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius dans l’obscurité. Maintenant, ajouter 250 microlitres de lyse combinée globule rouge et solution de fixation des globules blancs, et vortex immédiatement le mélange, doucement. Incuber le mélange vortexé pendant 10 minutes dans l’obscurité, à quatre degrés Celsius.Après 10 minutes, ajouter 250 microlitres de PBS et faire tourner les cellules à 260g, pendant 10 minutes à température ambiante. Enlevez le supernatant, et resuspendez les cellules dans 300 microlitres de 1% de formaldéhyde. Stockez les cellules à quatre degrés Celsius, à l’abri de la lumière jusqu’à ce que l’analyse soit effectuée.La cytométrie du débit doit être effectuée dans les 48 heures suivant la préparation de l’échantillon. Pour commencer, vérifiez le journal du cytomètre d’écoulement pour vous assurer que le personnel de l’établissement a effectué des vérifications de contrôle de la qualité. Pour configurer l’expérience de cytométrie de flux, cliquez sur une nouvelle expérience, suivie d’un nouveau spécimen et d’un nouveau tube, pour ajouter des tubes.Sélectionnez les parcelles bivariées, en cliquant sur l’icône, et utilisez les menus dropdown, pour sélectionner les paramètres d’accès. Assurer l’inclusion d’une parcelle CD16/CD14 et d’une parcelle affichant un détecteur à côté du temps, afin de surveiller l’acquisition. Insérez le tube et cliquez, acquérir.Vérifiez les paramètres de tension de l’instrument, en vous assurant que les signaux du détecteur ne sont pas hors échelle. Observez les cellules tombant dans la porte des monocytes de la parcelle CD14/CD16. Fixez le seuil d’enregistrement à 5000 événements pour la porte monocyte classique, et cliquez sur l’enregistrement.Continuez d’enregistrer les données pour les tubes restants. Une fois que les données de tous les tubes ont été enregistrées, exportez les données de flux sous forme de fichiers fcs pour analyse. Pour effectuer le gating monocyte, ouvrez les fichiers dans le logiciel d’analyse, cliquez deux fois sur le nom du tube et sélectionnez les paramètres des menus de dropdown pour visualiser les cellules sur une zone de dispersion avant par rapport à une parcelle de hauteur de dispersion vers l’avant.Créez une porte d’exclusion doublet, en cliquant sur l’icône de l’outil de porte polygone, et en enfermant les cellules. Sélectionnez les cellules fermées en cliquant en double sur la région fermée. Dans la nouvelle boîte d’affichage, ajustez les paramètres du menu dropdown pour afficher les cellules sur une zone de dispersion avant par rapport à une parcelle de zone de dispersion latérale.Cliquez sur l’icône de la porte rectangulaire et sélectionnez généreusement la population de monocytes, en fonction des propriétés de dispersion avant et latérale, pour exclure la majorité des lymphocytes, des cellules tueuses naturelles et des granulocytes. Sélectionnez les cellules gated et redisplay sur une parcelle CD14/CD16, en sélectionnant les paramètres en utilisant les menus dropdown. Cliquez sur la porte polygone, pour sélectionner les monocytes en fonction de leur forme l caractéristique et inversée.Si la population non classique n’est pas distincte des cellules à sa gauche, alors la contamination est probable et devrait être étudiée. Sélectionnez les cellules fermées et affichez les monocytes sur une parcelle CD/16 HLA-DR, en utilisant les menus décrocheurs pour sélectionner les paramètres. Cliquez sur la porte polygone pour sélectionner les cellules positives HLA-DR, et exclure les cellules tueuses naturelles restantes et les neutrophiles.Sélectionnez les cellules fermées et affichez les cellules positives HLA-DR sur une parcelle CD14/HLA-DR à l’aide de menus de dropdown pour sélectionner les paramètres. Cliquez sur la porte polygone, et dessinez une porte pour exclure les cellules HLA-DR high/CD14 low B. Sélectionnez les cellules gated et utilisez les menus dropdown pour les afficher sur une parcelle CD16/CD14.À partir d’options de parcelle, sélectionnez la parcelle zébrée, qui permettra de tirer les portes du sous-ensemble des monocytes, afin de déterminer les proportions sous-ensembleées. Maintenant, cliquez sur l’icône de la porte rectangulaire, et sélectionnez les monocytes classiques en dessinant une porte rectangulaire approximative autour de la faible population de monocytes classiques CD14/CD16. Sous l’affichage, sélectionnez, montrez des médianes, pour afficher l’intensité médiane de fluorescence pour les monocytes classiques.Ajustez la porte de telle sorte que la population ait une répartition égale de la médiane à gauche et à droite, et englobe toutes les cellules vers la gauche. Sélectionnez la population intermédiaire en dessinant une porte rectangulaire qui englobe les cellules à droite de la porte classique. Ajustez le bas de la porte pour exclure les cellules non classiques, en alignant la porte avec le fond des cercles concentriques, qui sont complètement à l’intérieur de la porte classique des monocytes.Portez le sous-ensemble non classique, en tirant une boîte rectangulaire vers le bas à partir du bord inférieur du sous-ensemble intermédiaire, en sélectionnant toutes les cellules au bas de la population. Sous affichage, sélectionnez, affichez les fréquences de la porte, afin de déterminer le pourcentage de chaque sous-ensemble de monocytes. Enfin, sélectionnez les cellules de chaque sous-ensemble de monocytes.Modifiez les paramètres de dropdown pour créer un histogramme pour chaque sous-ensemble de monocytes, affichant chaque marqueur. Ensuite, calculez le degré d’expression, en utilisant la moyenne médiane ou géométrique, tel que décrit dans le protocole de texte. Des populations de monocytes fermées avec succès sont montrées ici.Et les proportions sont en ligne avec celles de la littérature. Les proportions de cet échantillon ont été calculées comme étant 88,1 % classiques, 4,33 % intermédiaires et 7,49 % non classiques. En évaluant la position relative d’autres populations, il est clair que les lymphocytes T et les neutrophiles montrés ici en bleu, suivent bien en dehors du monocyte, forme inversée l, sur une parcelle CD16/CD14.Cependant, les cellules tueuses naturelles et les populations de cellules B, montrées ici en bleu, se chevauchaient avec la population non classique de monocytes. Les cartes thermiques confirmant que les types de cellules contaminantes ont été supprimées, sont affichées ici. Les cellules tueuses naturelles ont été fermées par l’étape CD16 HLA-DR, tandis que les cellules B ont été fermées par l’étape CD/14 HLA-DR.L’expression des marqueurs M1 et M2 en bleu, par rapport à leurs commandes d’isotype en rouge, sont affichées ici. CD120b un marqueur M1, montre un changement clair au-dessus de son contrôle isotype, pour tous les sous-ensembles de monocytes. C’est également le cas du CD93, un marqueur M2, l’expression étant plus élevée en classique, modérée sur les intermédiaires et faible sur non classique.Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de s’assurer que les cellules contaminantes sont fermées, car elles peuvent autrement contribuer à l’expression quantifiée. Après cette procédure, d’autres marqueurs peuvent être examinés. Afin de répondre à d’autres questions, telles que, comment l’expression des marqueurs monocytes change dans la maladie.N’oubliez pas que le travail avec le sang humain et le formaldéhyde peut être dangereux, et donc des précautions telles que, l’équipement de protection individuelle, et l’utilisation d’une hotte de danger biologique, devraient toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

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