Name: Isolement des artérioles rétiniennes Ex Vivo études de physiologie cellulaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Apprenez à isoler des artérioles rétiniennes de rat pour étudier la physiologie cellulaire vasculaire. Cette méthode permet d'analyser la contractilité du muscle lisse et la régulation du flux sanguin rétinien.

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Développement des protocoles décrits dans le présent document a été soutenu par les subventions accordées par les organismes de financement suivantes : BBSRC (BB/I026359/1), Fight for Sight (1429 et 1822), The Juvenile Diabetes Research Foundation (2003-2-525), Wellcome Trust (074648/Z/04), British Heart Foundation (PG/11/94/29169), HSC R & D Division (4748/STL/13) et CRM (MC_PC_15026).

<ol><li>Kohner, E. M., Patel, V., Rassam, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+blood+flow+and+impaired+autoregulation+in+the+pathogenesis+of+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Role of blood flow and impaired autoregulation in the pathogenesis of diabetic retinopathy.</a> Diabetes. 44, 603-607 (1995).</li>
<li>Hafez, A. S., Bizzarro, R. L., Lesk, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+optic+nerve+head+and+peripapillary+retinal+blood+flow+in+glaucoma+patients%2C+ocular+hypertensives%2C+and+normal+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of optic nerve head and peripapillary retinal blood flow in glaucoma patients, ocular hypertensives, and normal subjects.</a> American Journal of Ophthalmology. 136, 1022-1031 (2003).</li>
<li>Curtis, T. M., Gardiner, T. A., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+lesions+of+diabetic+retinopathy%3A+clues+towards+understanding+pathogenesis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+%28London%29%22%5BJournal%5D)">Microvascular lesions of diabetic retinopathy: clues towards understanding pathogenesis?</a> Eye (London). 23, 1496-1508 (2009).</li>
<li>Pournaras, C. J., Rungger-Brändle, E., Riva, C. E., Hardarson, S. H., Stefansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+retinal+blood+flow+in+health+and+disease%29%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of retinal blood flow in health and disease).</a> Progress in Retinal and Eye Research. 27, 284-330 (2008).</li>
<li>Kuwabara, T., Cogan, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+retinal+vascular+patterns.+I.+Normal+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Studies of retinal vascular patterns. I. Normal architecture.</a> Archives of Ophthalmology. 64, 904-911 (1960).</li>
<li>Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+physiology+of+retinal+and+choroidal+arteriolar+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Cellular physiology of retinal and choroidal arteriolar smooth muscle cells.</a> Microcirculation. 14 (1), 11-24 (2007).</li>
<li>Puro, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinovascular+physiology+and+pathophysiology%3A+new+experimental+approach%2Fnew+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (3), 258-270 (2012).</li>
<li>Kur, J., Newman, E. A., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+physiological+mechanisms+underlying+blood+flow+regulation+in+the+retina+and+choroid+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Cellular and physiological mechanisms underlying blood flow regulation in the retina and choroid in health and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (5), 377-406 (2012).</li>
<li>Delaey, C., Van de Voorde, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+Mechanisms+in+the+Retinal+and+Choroidal+Circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Regulatory Mechanisms in the Retinal and Choroidal Circulation.</a> Ophthalmic Research. 32 (6), 249-256 (2000).</li>
<li>Metea, M. R., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cells+dilate+and+constrict+blood+vessels%3A+a+mechanism+of+neurovascular+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glial cells dilate and constrict blood vessels: a mechanism of neurovascular coupling.</a> Journal of Neuroscience. 26, 2862-2870 (2006).</li>
<li>Pournaras, C. J., Rungger-Brändle, E., Riva, C. E., Hardarson, S. H., Stefansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+retinal+blood+flow+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of retinal blood flow in health and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 27 (3), 284-330 (2008).</li>
<li>Hughes, S., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+smooth+muscle+cell+and+pericyte+differentiation+in+the+rat+retina+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (8), 2795-2806 (2004).</li>
<li>Shepro, D., Morel, N. M. <a target="_blank" href="https://www.fasebj.org/doi/abs/10.1096/fasebj.7.11.8370472">Pericyte physiology.</a> The FASEB Journal. 7 (11), 1031-1038 (1993).</li>
<li>Kornfield, T. E., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Blood+Flow+in+the+Retinal+Trilaminar+Vascular+Network%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regulation of Blood Flow in the Retinal Trilaminar Vascular Network.</a> Journal of Neuroscience. 34 (34), 11504-11513 (2014).</li>
<li>Matsushita, K., Puro, D. G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1779733/">Topographical heterogeneity of KIR currents in pericyte-containing microvessels of the rat retina: effect of diabetes.</a> Journal of Physiology. 573, 483-495 (2006).</li>
<li>Needham, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+K%2B+and+Cl-+channels+in+the+regulation+of+retinal+arteriolar+tone+and+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The role of K+ and Cl- channels in the regulation of retinal arteriolar tone and blood flow.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (4), 2157-2165 (2014).</li>
<li>Hessellund, A., Jeppesen, P., Aalkjaer, C., Bek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+vasomotion+in+porcine+retinal+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologicaogica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Characterization of vasomotion in porcine retinal arterioles.</a> Acta Ophthalmologicaogica Scandinavica. 81, 278-282 (2003).</li>
<li>Delaey, C., Van de Voord, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure-induced+myogenic+responses+in+isolated+bovine+retinal+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Pressure-induced myogenic responses in isolated bovine retinal arteries.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, 1871-1875 (2000).</li>
<li>Kur, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+ion+channels+and+subcellular+Ca2%2B+signaling+in+arachidonic+acid-induced+dilation+of+pressurized+retinal+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Role of ion channels and subcellular Ca2+ signaling in arachidonic acid-induced dilation of pressurized retinal arterioles.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (5), 2893-2902 (2014).</li>
<li>Kur, J., Bankhead, P., Scholfield, C. N., Curtis, T. M., McGeown, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%282%2B%29+sparks+promote+myogenic+tone+in+retinal+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Ca(2+) sparks promote myogenic tone in retinal arterioles.</a> British Journal of Pharmacology. 168 (7), 1675-1686 (2013).</li>
<li>Fernández, J. A., McGahon, M. K., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaV3.1+T-Type+Ca2%2B+Channels+Contribute+to+Myogenic+Signaling+in+Rat+Retinal+Arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">CaV3.1 T-Type Ca2+ Channels Contribute to Myogenic Signaling in Rat Retinal Arterioles.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (9), 5125-5132 (2015).</li>
<li>McGahon, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV2+Channels+Contribute+to+Stretch-Activated+Cation+Currents+and+Myogenic+Constriction+in+Retinal+Arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">TRPV2 Channels Contribute to Stretch-Activated Cation Currents and Myogenic Constriction in Retinal Arterioles.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (13), 5637-5647 (2016).</li>
<li>Guidoboni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraocular+Pressure%2C+Blood+Pressure%2C+and+Retinal+Blood+Flow+Autoregulation%3A+A+Mathematical+Model+to+Clarify+Their+Relationship+and+Clinical+Relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Intraocular Pressure, Blood Pressure, and Retinal Blood Flow Autoregulation: A Mathematical Model to Clarify Their Relationship and Clinical Relevance.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (7), 4105-4118 (2014).</li>
<li>Scholfield, C. N., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+cytosolic+calcium+regulation+among+different+microvascular+smooth+muscle+cells+of+the+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in cytosolic calcium regulation among different microvascular smooth muscle cells of the rat retina.</a> Microvascular Research. 59 (2), 233-242 (2000).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+Ca2%2B+indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> Journal of Biological Chemistry. 260, 3440-3450 (1985).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSakmann%2C+B+%22Single+Channel+Recording%2C+Second+Edition%22">Single Channel Recording, Second Edition</a>. , Plenum Press. New York. 53-90 (1995).</li>
<li>Fernández, J. A., Bankhead, P., Zhou, H., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+detection+and+measurement+of+isolated+retinal+arterioles+by+a+combination+of+edge+enhancement+and+cost+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Automated detection and measurement of isolated retinal arterioles by a combination of edge enhancement and cost analysis.</a> PLoS One. 9, e91791(2014).</li>
<li>McGahon, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+downregulates+large-conductance+Ca2%2B-activated+potassium+beta+1+channel+subunit+in+retinal+arteriolar+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Diabetes downregulates large-conductance Ca2+-activated potassium beta 1 channel subunit in retinal arteriolar smooth muscle.</a> Circulation Research. 100 (5), 703-711 (2007).</li>
<li>Curtis, T. M., Scholfield, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nifedipine+blocks+Ca2%2B+store+refilling+through+a+pathway+not+involving+L-type+Ca2%2B+channels+in+rabbit+arteriolar+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Nifedipine blocks Ca2+ store refilling through a pathway not involving L-type Ca2+ channels in rabbit arteriolar smooth muscle.</a> Journal of Physiology. 532 (3), 609-623 (2001).</li>
<li>Tumelty, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelin+1+stimulates+Ca2%2B-sparks+and+oscillations+in+retinal+arteriolar+myocytes+via+IP3R+and+RyR-dependent+Ca2%2B+release%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Endothelin 1 stimulates Ca2+-sparks and oscillations in retinal arteriolar myocytes via IP3R and RyR-dependent Ca2+ release.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3874-3879 (2011).</li>
<li>Huynh, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insight+into+the+assembly+of+TRPV+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural insight into the assembly of TRPV channels.</a> Structure. 22 (2), 260-268 (2014).</li>
<li>McGahon, M. K., Dawicki, J. M., Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A-type+potassium+current+in+retinal+arteriolar+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">A-type potassium current in retinal arteriolar smooth muscle cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (9), 3281-3287 (2005).</li>
<li>McGahon, M. K., Zhang, X., Scholfield, C. N., Curtis, T. M., McGeown, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+downregulation+of+the+BKbeta1+subunit+in+diabetic+arteriolar+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Channels+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">Selective downregulation of the BKbeta1 subunit in diabetic arteriolar myocytes.</a> Channels (Austin). 1 (3), 141-143 (2007).</li>
<li>Ljubimov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane+abnormalities+in+human+eyes+with+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Basement membrane abnormalities in human eyes with diabetic retinopathy.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44, 1469-1479 (1996).</li>
<li>Roy, S., Maiello, M., Lorenzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+basement+membrane+collagen+in+human+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Increased expression of basement membrane collagen in human diabetic retinopathy.</a> Journal of Clinical Investigation. 93, 438-442 (1994).</li>
<li>Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+physiology+of+retinal+and+choroidal+arteriolar+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Cellular physiology of retinal and choroidal arteriolar smooth muscle cells.</a> Microcirculation. 14 (1), 11-24 (2007).</li>
<li>Hinds, K., Monaghan, K. P., Frølund, B., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+control+of+arteriolar+diameter+in+the+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">GABAergic control of arteriolar diameter in the rat retina.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6798-6805 (2013).</li>
<li>Torring, M. S., Aalkjaer, C., Bek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constriction+of+porcine+retinal+arterioles+induced+by+endothelin-1+and+the+thromboxane+analogue+U46619+in+vitro+decreases+with+increasing+vascular+branching+level%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">Constriction of porcine retinal arterioles induced by endothelin-1 and the thromboxane analogue U46619 in vitro decreases with increasing vascular branching level.</a> Acta Ophthalmologica. 92 (3), 232-237 (2014).</li>
<li>P, S. kov J. ensen, S, M. etz M. ariendal P. edersen, Aalkjaer, C., Bek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vasodilating+effects+of+insulin+and+lactate+are+increased+in+precapillary+arterioles+in+the+porcine+retina+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">The vasodilating effects of insulin and lactate are increased in precapillary arterioles in the porcine retina ex vivo.</a> Acta Ophthalmologica. 94 (5), 454-462 (2016).</li>
</ol>

Le Dr Joanna Kur est maintenant employé de Medtronic (Twin-Cities, Minnesota, USA), son travail actuel n’est pas incompatible avec celle présentée ici.

Les protocoles décrits ci-dessus nécessitent la pratique mais doivent être réalisables avec un minimum de dépannage. Sur une journée moyenne nous obtenir des artérioles utilisables de 6 à 8 de l’isolement et de réaliser des expériences réussies de 3-4. Si des problèmes surviennent, cependant, il y a quelques mesures qui peuvent être prises pour aider à améliorer le taux de réussite. Parfois nous avons trouvé, en particulier lors de l’utilisation de jeunes rats (< 8 semaines), que le rendement des artérioles peut être faible. Pour contourner ce problème, nous suggérons de centrifugation le tissu rétinien (10-30 s à 500 x g) entre chacun d’eux de la trituration étapes par étapes 1.12-1.14. Souvent, cela permet d’améliorer le rendement des navires mais permettra également d’augmenter la quantité de débris de cellules dans le cadre de la préparation.
Lorsque canulant navires pour études myographie pression, qu'il est important de vérifier les artérioles avec soin pour n’importe quel côté-branches qui peuvent avoir été clivés à proximité du site de bifurcation. Cela représente une cause fréquente de fuite et de perte de pression au cours de l’expérimentation. Le principal problème pouvant survenir avec les [Ca2 +]j’ai protocoles est le niveau de chargement de colorant. Chargement de colorant pauvre mène à faibles rapports signal-bruit, tout en surchargeant les résultats dans la perturbation de l’homéostasie2 + Ca normal. Pour réduire la probabilité d’une de ces questions, une petite aliquote d’homogénat rétinienne peut être enlevée, et vaisseaux isolés vérifié périodiquement pendant le protocole de chargement. Lorsque l’entreprise patch clamp expériences, le taux de réussite de la formation de gigaseal est fortement tributaire de comment bien la lame basale a été digérée. Quand ce protocole d’essai au départ ou à l’aide de nouveaux lots d’enzymes, il peut être nécessaire d’ajuster la concentration/durée de la digestion enzymatique. Attentivement suivi la séparation des couches endothéliales et muscle lisse assurera la digestion suffisante pour enlever assez basale (laminal) pour obtenir l’accès. Un suivi attentif est également nécessaire pour éviter la digestion excessive, qui peut se manifester comme le bateau commence à se contracter. Dans ce cas, les cellules musculaires lisses sont souvent trop fragiles pour enregistrement de patch clamp. Lorsque vous appliquez des enzymes, il est important d’inclure la DNAse I à garantir l’élimination des brins d’ADN libérée de cellules endommagées au cours du processus d’isolement. Fragments d’ADN sont collantes et causer la pince d’adhérer à l’artériole pendant les étapes finales du processus de nettoyage (étape 4.4), ce qui entraîne souvent la perte de navire. Nettoyage des vaisseaux est techniquement difficile et est mieux réalisé à fort grossissement (X 20) avec douces mouvements de balayage de pinces fermées de la plus belle possible diamètre. Entre les balayages, nettoyer la pince avec rouleau de laboratoire.
Comme l’a souligné plus tôt, une clé était motivée par le développement des protocoles décrits dans ce manuscrit afin de mieux comprendre pourquoi la circulation sanguine est perturbée au cours des maladies vasculaires rétiniennes. La plupart de nos travaux à ce jour ont porté sur l’oeil diabétique maladie28,33. Artérioles peuvent être isolées de la rétine des modèles expérimentaux de rongeurs du diabète à l’aide des méthodes décrites à l’article 1. Lors de l’expérimentation sur les artérioles rétiniennes isolées des animaux diabétiques, il est important d’essayer de reproduire étroitement les conditions hyperglycémiques vécues par les navires en vivo. Pour cette raison, nous soulèverions normalement les niveaux de D-glucose dans notre isolement et de la solutions expérimentales à 25 mM. Épaississement des membranes de sous-sol vasculaires est un phénomène bien connu dans les vaisseaux rétiniens au cours du diabète34,35. Lors de l’utilisation des animaux diabétiques prolongée (durée de la maladie > 1 mois), les concentrations de l’enzyme accrue ou digestion fois sont souvent nécessaire pour permettre l’application des méthodes d’enregistrement patch clamp.
Une limitation importante de l’utilisation ex vivo isolé des artérioles rétiniennes pour étudier la physiologie vasculaire rétinienne et la physiopathologie est la perte du neuropile rétinienne environnante. Bien que les cellules neuronales et gliales rétinienne permet un accès facile aux cellules le muscle lisse vasculaire rétinienne pour les études de physiologie cellulaire, la réponse des vaisseaux aux médiateurs vasoactifs peut changer de façon spectaculaire en absence et en présence de la rétine tissus. Les actions de l’adénosine triphosphate (ATP), par exemple, fournissent une bonne illustration de ce point. En isolé rat artérioles rétiniennes, addition d’ATP déclenche une robuste constriction des vaisseaux36, tandis que dans la présence d’un neuropile intact, les vaisseaux dilatent37. Par conséquent, dans la mesure du possible, nous essayons généralement de valider les résultats principaux de nos préparatifs arteriole isolés à l’aide de ex vivo rétinienne ensemble-montages et in vivo des mesures du bateau diamètre et sang écoulement16,37 . À noter, les nouvelles méthodes ont émergé récemment pour l’étude des petites artérioles et capillaires en entier perfusé rétines porcine ex vivo38,,39. Ces préparations sont susceptibles d’améliorer considérablement notre compréhension de comment la rétine neuropile régule la rétine tonus artériolaire et capillaire et comment les changements dans la rétine hémodynamique modulent l’activité neuronale dans la rétine.
Bien que les procédures décrites dans cet article sont axées sur l’utilisation des artérioles rétiniennes isolé du rat pour la physiologie des cellules des muscles lisses des artérioles compréhension, nous développons actuellement des protocoles pour permettre également à l’étude de la fonction des cellules endothéliales ces navires. Dans les travaux préliminaires, nous avons réussi à modifier la digestion enzymatique des segments d’artériolaires rétiniens pour produire des tubes de cellules endothéliales viables qui sont prêtent au Ca2 + imagerie et patchclamp études d’enregistrement. Canulation des artérioles isolés aux deux extrémités, permettant intraluminal fourniture de médicaments, pourrait à l’avenir également activer endothélium-dépendante réponses vasodilatatrice à étudier dans ces vaisseaux.

Comprendre comment contrôle-t-on l’irrigation sanguine de la rétine est un objectif important, étant donné que le débit sanguin anormal a été impliqué dans la pathogénie d’une variété de vue en danger maladies de la rétine1,2,3, 4. La circulation rétinienne, qui approvisionne les neurones de la rétine internes et les cellules gliales, conventionnè fin artère, avec tout le sang des artères rétiniennes et des artérioles en passant par les capillaires aux veinules rétiniennes et enfin les veines5. La circulation sanguine de la rétine est réglementée par le ton des artères rétiniennes et des artérioles ainsi que l’activité contractile de la péricytes situés sur les parois des capillaires rétiniens et veinules post capillaire6,7, 8. le contrôle du tonus vasculaire rétinienne est complex et est modulé par une série d’apports provenant du système circulatoire et le tissu rétinien environnant, y compris les gaz du sang circulant les molécules et les hormones, et substances vasoactives libéré de la rétinienne vasculaire endothélium et macroglia9,10,11. Les artérioles rétiniennes sont les petites branches artérielles de la rétine et sont composées d’une seule couche de cellules musculaires lisses vasculaires et une doublure intérieure de disposés longitudinalement les cellules endothéliales12,13, 14. ces vaisseaux forment le principal site de la résistance vasculaire dans la circulation rétinienne et jouent donc un rôle important dans le contrôle local de débit sanguin rétinien. Artérioles rétiniennes régulent le flux sanguin capillaire dans la rétine en dilatant ou en resserrant leur diamètre luminal, médiée par des changements dans le muscle lisse vasculaire contractilité10,15,16. La compréhension des mécanismes moléculaires par le biais de laquelle rétinienne réglementent les artérioles rétinienne perfusion nécessite donc préparations où les cellules des muscles lisses des artérioles peuvent être consultés et étudiés dans des conditions aussi près de physiologiques que possible.
Ex vivo des préparations des vaisseaux rétiniens isolés permettent d’accéder aux cellules musculaires lisses vasculaires, tout en conservant leur fonctionnalité et leur interconnectivité avec l’endothélium sous-jacent. La plupart des études à ce jour à l’aide de vaisseaux isolés ont mis l’accent sur les gros vaisseaux artériels bovin ou porcin (60 à 150 µm). Ceux-ci peuvent être montés en fil disponible dans le commerce ou systèmes myographe pression pour permettre l’interrogatoire pharmacologique du muscle lisse vasculaire cellule contractile mécanismes17,18. Ces préparations ont grandement contribué à notre connaissance de la physiologie vasculaire rétinienne dans des conditions normales. Peu d’études ont utilisé des artérioles rétiniennes isolés de petits animaux de laboratoire comme leur plus petit diamètre (~ 8-45 µm) empêche leur utilisation dans les systèmes conventionnels de myographie19,20,21,22. Un avantage important, toutefois, de l’utilisation de navires de petits animaux de laboratoire est la grande disponibilité de modèles de maladies génétiquement modifiées, transgéniques et rétiniennes. Petits animaux de laboratoire sont également plus propices pour des études in vivo intervention.
Nous décrivons ici les protocoles simples pour isoler et canulant artérioles rétiniennes rat pour expériences myographie de pression. Ca2 + imagerie et électrophysiologie protocoles à l’aide de ces navires sont également détaillés. Ces peuvent encore donner un aperçu de la réglementation de la contractilité du muscle lisse vasculaire et la circulation sanguine de la rétine.

<table><tbody><tr><td>Béchers</td><td>Fisherbrand</td><td>15409083</td><td>Ou tout autre produit équivalent</td></tr><tr><td>Ciseaux incurvés</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-109-3542</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>Pipette/transfert en plastique jetable</td><td>Sarstedt</td><td>86.1174</td><td>6mL est le meilleur mais d’autres tailles sont acceptables ; retirer la pointe pour élargir l’ouverture</td></tr><tr><td>Microscope de dissection</td><td>Brunel Microscopes LTD</td><td></td><td>Ou n’importe quel produit équivalent</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>Dumont #5 14095</td><td>Toute pince fine équivalente</td></tr><tr><td>Pipette Pasteur</td><td>Fisherbrand</td><td>11546963</td><td>Polie au feu pour réduire les frottements mais pas assez pour rétrécir l’embout</td></tr><tr>Boîte de<td>Pétri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7741</td><td>Ou tout produit équivalent 10cm</td></tr><tr><td>Pipette tétine</td><td>Fisherbrand</td><td>12426180</td><td>Ou tout Produit équivalent</td></tr><tr><td>Alimentation en eau purifiée</td><td>Système</td><td>intégral de purification d’eau Merek Milli-Q</td><td>Ou tout système équivalent</td></tr><tr><td>Tube à essai à fond rond</td><td>Fisherbrand</td><td>14-958-10 B</td><td>5 mL ; tout produit équivalent</td></tr><tr><td>Pince à sertage</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-467-230</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>Lames à un seul tranchant</td><td>Agar Scientific</td><td>T585</td><td>Ou tout produit équivalent produit équivalent</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Dow Corning</td><td>184</td><td>Ou toute surface souple&nbsp ;</td></tr><tr><td>Rack pour éprouvettes</td><td>Fisherbrand Derlin</td><td>10257963</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>Manipulateur</td> mécanique 3 axes myographie <td></td><td></td><td></td>de pression</tr><tr><td>Scientifica</td><td></td><td>LBM-7&nbsp ;</td><td>x2 (ou tout produit équivalent)</td></tr><tr><td>Tarauds à 3 voies</td><td>Cole-Parmer</td><td>UY-30600-02</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>Table à air</td><td>Technical Manufacturing Corporation&nbsp ;</td><td>Banc propre</td><td>ou tout logiciel</td></tr><tr><td>d’analyse de produit équivalent&nbsp ;</td><td>Image J</td><td>https://downloads.imagej.net/fiji/</td> <td>Logiciel d’imagerie gratuit</td></tr><tr><td>Plugin d’analyse</td><td>Myotraker&nbsp ;</td><td>https://doi.org/10.1371/journal.pone.0091791.s002</td><td>Plug-in personnalisé pour imageJ Disponible gratuitement en téléchargement</td></tr><tr><td>Pipette de canulation en verre</td><td>Instruments de perception mondiale</td><td>TW150F-4</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>Ordinateur</td><td>Dell</td><td>Optiplex 7010</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>Thermomètre numérique</td><td>RS</td><td>206-3722</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>Fluo-4-AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F14201</td><td>Faire 1 mM de stock dans DMSO</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>Dumont #7 14097</td><td>Toute pince fine équivalente</td></tr><tr><td>Fura-2-AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F1221</td><td>Faire 1 mM de stock dans DMSO</td></tr><tr><td>Chambre d’enregistrement à fond de verre</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0759</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>Aide pipette en verre</td><td>Instruments World Percision</td><td>IB150F-3</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>Chauffage en ligne</td><td>Équivalent commercial sur mesure SH-27B Solution Chauffage en ligne de l’appareil Harvard</td><td></td> Microscope inversé Nikon Eclypse TE 300 Ou tout produit équivalent Manomètre Riester LF1459 Ou tout produit équivalent Extracteur de microélectrodes <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Instruments de mesure</td><td>P97</td><td>ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>Microforge +&nbsp ; Microscope Olympus CX 31</td><td>Verrerie</td><td>Pointe fine F-550</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td>Instruments de mesure</td><td>MP-285</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>Collecteur de distribution multicanaux&nbsp ;</td><td>Automate Scientific</td><td>Perfusion Pencil</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>Pipette filler&nbsp ;</td><td>BD Plastipak</td><td>1mL</td><td>Seringue chauffée et tirée au diamètre interne de la pipette</td></tr><tr><td>Porte-pipette</td><td>Dispositifs moléculaires</td><td>1-HL-U</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>Pompe d’aspiration</td><td>Interpet</td><td>AP1</td><td>Pompe d’aération convertie par soufflet inversé</td></tr><tr><td>Seringue</td><td>BD Plastipak</td><td>20mL Luer-lok</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>Fil de tungstène</td><td>Advent</td><td>W558818</td><td>75&mu ; m de diamètre</td></tr><tr><td>Tygon Tubing</td><td>VWR</td> tailles <td>diverses</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>Caméra USB</td><td>&nbsp ; Logitech&nbsp ;</td><td>HD Pro Webcam C920</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>Logiciel de capture vidéo</td><td>Hypercam</td><td>version 2.28.01</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>Bain d’eau</td><td>Grant</td><td>Sub Aqua 12 Plus</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>x20 objectif</td><td>Nikon</td><td>20x/0.40 WD 3.8, &infin ;/0.17</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>objectif x4</td><td>Nikon</td><td>4x/0.10, WD 30, &infin ;/-</td><td>Or tout Produit équivalent</td></tr><tr><td>Y-connecteurs</td><td>World Percision Instruments</td><td>14012</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>Taraudage</td><td></td><td></td><td></td></tr> patch <tr><td>3 voies</td><td>Cole-Parmer</td><td>UY-30600-02</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>manipulateur mécanique 3 axes</td><td>Scientifica</td><td>LBM-7&nbsp ;</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>Table d’air</td><td>Technical Manufacturing Corporation&nbsp ;</td><td>Banc propre</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>Amphotéricine B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2411</td><td>3 mg dissous quotidiennement en 50 &mu ; L de DMSO (sonicate à dissoudre)</td></tr><tr><td>Amplificateur</td><td>Molecular Devices</td><td>Axopatch 200a</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>Convertisseur analogique numérique</td><td>Axon</td><td>Digidata 1440A</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>Colgénase Type 1A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9891&nbsp ;</td><td>0,1 mg/mL dans LCH</td></tr><tr><td>Ordinateur</td><td>Dell</td><td>Optiplex 7010</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>Thermomètre numérique</td><td>RS</td><td>206-3722</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Millipore</td><td>260913</td><td>Stock de travail 1 MU mL-1 (10 MU dilués dans 10 mL LCH)&nbsp ;</td></tr><tr><td>Cage de Faraday</td><td>Fabriquée sur</td><td></td> mesure <td>Tout produit commercial équivalent</td></tr><tr><td>Pince fine</td><td>Dumont</td><td>n° 7</td><td>Toute pince superfine</td></tr><tr><td>Chambre d’enregistrement à fond de verre</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0759</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>Headstage</td><td>Molecular Devices</td><td>CV203BU</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>Chauffage en ligne</td><td>Fabriqué sur mesure</td><td></td><td>Solution équivalente commerciale SH-27B Chauffage en ligne de l’appareil Harvard</td></tr><tr><td>Microscope inversé</td><td>Nikon</td><td>Eclypse TE 300</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>Extracteur de microélectrodes</td><td>Instruments de sutter</td><td>P97</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>Microforge +&nbsp ; Microscope Olympus CX 31</td><td>Verrerie</td><td>Pointe fine F-550</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td>Instruments de mesure</td><td>MP-285</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>Collecteur de distribution multicanaux&nbsp ;</td><td>Automate Scientific</td><td>Perfusion Pencil</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>Logiciel de patching</td><td>Dispositifs moléculaires</td><td>Pclamp v10.2</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>Remplisseuse de pipette&nbsp ;</td><td>BD Plastipak</td><td>1mL</td><td>Seringue chauffée et tirée jusqu’au diamètre interne de la pipette</td></tr><tr><td>Porte-pipette</td><td>Dispositifs moléculaires</td><td>1-HL-U</td><td>ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>Protéase Type XIV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147&nbsp ;</td><td>0,01 mg/mL dans LCH</td></tr><tr><td>Pipette monocanal en verre</td><td>World Percision</td><td>instruments IB150F-3</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>Pompe d’aspiration</td><td>Interpet</td><td>AP1</td><td>Pompe d’aération convertie par soufflet inverseur</td></tr><tr><td>Seringue</td><td>BD Plastipak</td><td>20mL Luer-lok</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>Fil de tungstène</td><td>Advent</td><td>W557418</td><td>50&mu ; m diamètre</td></tr><tr><td>Tygon Tubing</td><td>VWR</td><td>tailles diverses</td><td>Tout produit équivalent pour s’adapter à</td></tr><tr><td>une caméra USB</td><td>&nbsp ; Logitech&nbsp ;</td><td>HD Pro Webcam C920</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>Bain-marie</td><td>Grant</td><td>Sub Aqua 12 Plus</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>Pipette à cellules entières en verre</td><td>Warner Instruments</td><td>GC150TF-7.5</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>x20 objectif</td><td>Nikon</td><td>20x/0.40 WD 3.8, &infin ;/0.17</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>x4 objectif</td><td>Nikon</td><td>4x/0.10, WD 30, &infin ;/-</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>objectif x40</td><td>Nikon</td><td>40x/0.55, WD 2.1, &infin ;/1.2</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>connecteurs en Y</td><td>World Percision Instruments</td><td>14012</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>Ca2+ imagerie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tarauds 3 voies</td><td>Cole-Parmer</td><td>UY-30600-02</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>3 axes manipulateur mécanique</td><td>Scientifica</td><td>LBM-7&nbsp ;</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>Logiciel d’acquisition&nbsp ;</td><td>Cairn Research Ltd.</td><td>Moteur d’acquisition V1.1.5</td><td>Ou tout produit équivalent ; microfluorimétrie</td></tr><tr><td>Table d’air</td><td>Technical Manufacturing Corporation&nbsp ;</td><td>Clean Bench</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse pour l’imagerie confocale</td><td>Image J</td><td>https://downloads.imagej.net/fiji/</td> <td>Logiciel d’imagerie gratuit</td></tr><tr><td>Ordinateur</td><td>Dell</td><td>Optiplex 7010</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Leica Geosystems</td><td>SP5&nbsp ;</td><td>Ou tout produit équivalent ; confocal</td></tr><tr><td>Thermomètre numérique</td><td>RS</td><td>206-3722</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>Pince fine</td><td>Dumont</td><td>n° 7</td><td>Toute pince superfine</td></tr><tr><td>Chambre d’enregistrement à fond de verre</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0759</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>Chauffage en ligne</td><td>Équivalent commercial sur mesure SH-27B Solution Chauffage en ligne de Harvard Appareil</td><td></td> Inversé <td></td></tr><tr><td> microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TE2000</td><td>Ou tout produit équivalent ; microfluorimétrie</td></tr><tr><td>Monochromateur&nbsp ;</td><td>Cairn Research Ltd.</td><td>Optoscan</td><td>Ou tout produit équivalent ; microfluorimétrie</td></tr><tr><td>Collecteur d’administration multicanaux&nbsp ;</td><td>Automate Scientific</td><td>Perfusion Pencil</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>Pipette filler&nbsp ;</td><td>BD Plastipak</td><td>1mL</td><td>Seringue chauffée et tirée au diamètre interne de la pipette</td></tr><tr><td>Logiciel pour microscope confocal</td><td>Leica Geosystems</td><td>LAS-AF version 3.3.</td><td>Ou tout produit équivalent ; confocal</td></tr><tr><td>Pompe d’aspiration</td><td>Interpet</td><td>AP1</td><td>Pompe d’aération convertie par soufflet inverseur</td></tr><tr><td>Seringue</td><td>BD Plastipak</td><td>20mL Luer-lok</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>Fil de tungstène</td><td>Advent</td><td>W557418</td><td>50&mu ; m de diamètre</td></tr><tr><td>Tygon Tubing</td><td>VWR</td><td>tailles diverses</td><td>Tout produit équivalent pour s’adapter</td></tr><tr><td>Bain-marie</td><td>Grant</td><td>Sub Aqua 12 Plus</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td>lentille x100</td><td>Nikon</td><td>x100 N.A. 1.3 huile</td><td>Ou tout produit équivalent ; microfluorimétrie</td></tr><tr><td>lentille x20</td><td>Nikon</td><td>20x/0.40 WD 3.8, &infin ;/0.17</td><td>Ou tout produit équivalent ; microfluorimétrie</td></tr><tr><td>Objectif x20</td><td>Leica Geosystems</td><td>HCX PL FLUOTAR, 20x/0.50, &infin ;/0.17/D</td><td>Ou tout produit équivalent ; objectif confocal</td></tr><tr><td>x4</td><td>Nikon</td><td>4x/0.10, WD 30, &infin ;/-</td><td>Ou tout produit équivalent ; objectif microfluorimétrie</td></tr><tr><td>x63</td><td>Leica Geosystems</td><td>HCX PL APO, 63x/1.40 - 0.60 HUILE CS &infin ;/0.17/E</td><td>Ou tout produit équivalent ; connecteurs en Y confocaux</td></tr><tr><td></td><td>World Percision Instruments</td><td>14012</td><td>Ou tout produit équivalent</td></tr><tr><td><Pipettes fortes></fortes></td><td></td><td></td><td><fortes>Spécifications et réglages pour la fabrication de pipettes pour l’expérimentation</td></tr><tr><td>Helper Pipette</td><td>World Percision</td><td>instruments IB150F-3</td><td>Diamètre intérieur : 0.86 mm Rampe : 261 Pression : 300 Chaleur : 280 Tirage : 0 Vélocité : 56 Temps : 250 Nombre de cycles : 4 Diamètre de la pointe : 0,5-2 &mu ; m Polissage : yes Résistance finale : >10 M&Omega ;</td></tr><tr><td>Pipette à canulation</td><td>World Percision instruments</td><td>TW150F-4</td><td>Diamètre intérieur : 1,17 mm Rampe : 290 Pression : 300 Chaleur : 280 Traction : 0 Vélocité : 58 Temps : 150 Nombre de cycles : 4 Diamètre de l’embout : 3-10 &mu ; m Polissage : no Résistance finale : < 1 M&Omega ;</td></tr><tr><td>Instruments</td><td>World Percision</td><td>IB150F-3</td><td>Diamètre intérieur : 0,86 mm Rampe : 261 Pression : 300 Chaleur : 280 Traction : 0 Vélocité : 56 Temps : 250 Nombre de cycles : 4 Diamètre de l’embout : 0,5-2 &mu ; m Polissage : yes Résistance finale : >5 M&Omega ;</td></tr><tr><td>Patching à cellules entières</td><td>Warner Instruments</td><td>GC150TF-7.5</td><td>Diamètre intérieur : 1.17 mm Rampe : 296 Pression : 200 Chaleur : 287 Traction : 0 Vélocité : 50 Temps : 250 Nombre de cycles : 4 Diamètre de l’embout : 2-3 &mu ; m Polissage : utile mais pas nécessaire Résistance finale : 1-2 m&Omega ;</td></tr></tbody></table>

isolement des artérioles rétiniennes ex vivo études de physiologie cellulaire

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

La rétine est un tissu hautement métaboliquement actif nécessitant une irrigation sanguine importante. La circulation rétinienne soutient la rétine interne, tandis que les navires choroïdienne fournissent les photorécepteurs. Altérations rétinienne perfusion contribuer aux nombreux troubles vue en danger, y compris la rétinopathie diabétique, occlusion de la veine glaucome et la direction générale de la rétine. Comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans le contrôle de la circulation sanguine à travers la rétine, et comment elles sont modifiées au cours de la maladie oculaire pourrait conduire à l’identification de nouvelles cibles pour le traitement de ces conditions. Artérioles rétiniennes sont les vaisseaux de résistance principaux de la rétine et par conséquent, jouent un rôle clé dans la régulation de rétine hémodynamique à travers des changements de diamètre luminal. Ces dernières années, nous avons développé des méthodes pour isoler les artérioles de la rétine de rat qui conviennent à un large éventail d’applications, y compris les études de physiologie cellulaire. Cette préparation a déjà commencé à produire de nouvelles connaissances sur comment le débit sanguin est contrôlé dans la rétine et nous a permis d’identifier certaines des principaux changements qui se produisent au cours de la maladie oculaire. Dans cet article, nous décrit les méthodes pour l’isolement des artérioles rétiniennes rat et comprennent des protocoles pour leur utilisation en électrophysiologie patch clamp, imagerie calcique et études myographie de pression. Ces bateaux se prêtent également destiné à la PCR-, western blot et immunohistochimie dotés d’études.

Ce manuscrit décrit un protocole simple pour l’isolement des artérioles de la rétine de rat qui peut être utilisé dans, calcium imagerie et pression myographie des études électrophysiologiques.

Isolement des artérioles rétiniennes Ex Vivo études de physiologie cellulaire

The retina is a highly metabolically active tissue that requires a substantial blood supply. The retinal circulation supports the inner retina, while the ...

Comprendre comment le flux sanguin est contrôlé dans la rétine est un objectif important, car un flux sanguin anormal a été impliqué dans le développement d’une variété de maladies rétiniennes menaçant la vue, telles que la rétinopathie diabétique, le glaucome et les occlusions veineuses ramifiées. Les artérioles rétiniennes jouent un rôle clé dans la régulation du flux sanguin dans la rétine en dilatant et en resserrant leur diamètre luminal, médié par des modifications de la contractilité des cellules musculaires lisses qui entourent ces vaisseaux. Comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents à la régulation de la perfusion rétinienne nécessite donc des préparations permettant d’accéder aux cellules musculaires lisses artériolaires rétiniennes et de les étudier dans des conditions aussi proches que possible de la physiologie.Dans cette vidéo, nous démontrons un protocole simple pour l’isolement des artérioles de la rétine du rat qui peut être utilisé dans les études de patch clamp, d’imagerie calcique et de myographie de pression. Au cours des dernières années, cette préparation a été utilisée pour fournir des informations supplémentaires sur la régulation de la contractilité des muscles lisses vasculaires et du flux sanguin dans la rétine, tant en bonne santé qu’en maladie. Préparez une solution d’un litre à faible teneur en calcium contenant du Hanks’or LCH, comme indiqué dans le tableau des matériaux.Assemblez l’équipement d’isolement avant le prélèvement des tissus. La pipette Pasteur en verre doit être polie au feu pour lisser, mais pas rétrécir la pointe. Coupez une pipette en plastique à une ouverture d’environ cinq à sept millimètres.Placez les yeux sur la boîte de dissection, immergés dans la solution LCH. Utilisez une paire de pinces pour ancrer l’œil à la parabole en tenant les attaches des muscles orbitaires ou le nerf optique. Assurez-vous que le point d’ancrage est le plus près possible de la sclérotique pour stabiliser l’œil.À l’aide de la lame, coupez la cornée le long de l’ora serrata et retirez le cristallin en appuyant doucement sur la sclérotique à l’aide d’une pince. La petite région circulaire que nous voyons à l’arrière de l’œil sur cette image est le nerf optique. À l’aide de la lame, coupez l’œilleton en deux symétriquement à travers le disque optique.À l’aide d’une pince fermée, brossez doucement les rétines des deux moitiés de l’œilleton, en prenant soin d’enlever toutes les attaches restantes au niveau du disque optique. Répétez le processus avec le deuxième œil et transférez les rétines disséquées dans le tube à essai à l’aide de la pipette en plastique et d’une petite goutte de milieu LCH. À l’aide de la pipette en plastique, remplissez le tube à essai de LCH à environ cinq millilitres et laissez les rétines se déposer au fond du tube.Lavez le mouchoir environ trois fois en retirant environ quatre millilitres de solution du tube et en ajoutant du LCH frais à l’aide de la pipette en plastique. Si nécessaire, les tissus étrangers doivent être enlevés. Lavez l’intérieur de la pipette Pasteur en verre avec l’embout poli avec du LCH pour éviter que le tissu ne colle à la pipette.À l’aide de la même pipette, prélevez environ quatre millilitres de solution du tube à essai et ajoutez environ deux millilitres de LCH frais. Dissociez doucement les rétines en aspirant lentement le tissu à travers la pointe de la pipette en verre, et expulsez le contenu dans le tube à essai. Essayez de ne pas introduire de bulles à ce stade et répétez le processus jusqu’à ce que les rétines soient brisées à la taille d’environ deux à trois millimètres carrés.Lavez l’intérieur de la pipette avec environ deux millilitres de LCH et expulsez-le dans le tube à essai. Laissez le contenu se déposer au fond pendant cinq à 10 minutes. Répétez le processus de trituration comme décrit précédemment avec un peu plus de force jusqu’à ce que les morceaux de tissu aient une taille d’environ un millimètre carré.Laissez le tissu se déposer et répétez une fois de plus avec encore plus de force jusqu’à ce que le contenu soit complètement homogénéisé et qu’il ne reste plus aucun morceau de rétine. La solution à ce stade devrait apparaître laiteuse. Cette technique permettra d’obtenir jusqu’à huit segments d’artériole par isolement, mesurant de 200 à 2 500 micromètres de longueur.La canulation d’une extrémité de l’artériole avec occlusion de l’extrémité opposée permet de mesurer la vasoconstriction induite par la pression, également connue sous le nom de réponse myogénique. La myographie de pression artériolaire s’effectue comme suit. Une aliquote d’homogénat rétinien est transférée dans une chambre d’enregistrement physiologique montée sur la platine d’un microscope inversé.Laissez l’homogénat se déposer au fond de la chambre pendant au moins cinq minutes. Balayez visuellement la chambre d’enregistrement pour identifier les artérioles de plus de 200 micromètres de longueur et possédant une extrémité ouverte à travers laquelle le récipient peut être canulé. Ancrez à une extrémité du récipient à l’aide d’une pince fine et d’un petit fil de tungstène placé sur le récipient.À l’aide des extrémités qui se chevauchent du fil de tungstène, manœuvrez le récipient pour qu’il traverse horizontalement le bain, de sorte que l’extrémité ouverte soit alignée avec la canule de pressurisation. Perfuser la chambre avec zéro calcium Hanks' à 37 degrés Celsius. Les canulations sont effectuées à l’aide de pipettes en verre.La canule est positionnée à l’extrémité ouverte du vaisseau à l’aide d’un micromanipulateur fin. L’extrémité est positionnée immédiatement à côté de l’ouverture, comme évalué en ajustant le plan de mise au point sur le microscope, de sorte que l’extrémité du vaisseau et l’extrémité de la canule soient nettes en même temps et que la canule de pressurisation avance dans l’ouverture du récipient. Une pipette auxiliaire est nécessaire pour faciliter le processus de canulation et est utilisée pour retenir doucement l’artériole et guider la paroi artériolaire sur la canule de pressurisation en même temps que la canule est avancée dans la lumière du vaisseau.Cette procédure nécessite un mouvement simultané et contrôlé des deux manipulateurs et une pratique approfondie pour obtenir un taux de réussite élevé. Après une minute d’enregistrement à zéro millimètre de mercure, la pression intraluminale est augmentée à 40 millimètres de mercure, et le récipient devrait se dilater rapidement, confirmant la réussite de la canulation. La vasoconstriction induite par la pression, c’est-à-dire la réponse myogénique, se développera par la suite sur une période d’environ 15 minutes.L’enregistrement par patch clamp à partir de cellules musculaires lisses vasculaires rétiniennes permet d’étudier les courants ioniques de la membrane plasmique qui régulent le calcium intracellulaire et donc la contractilité cellulaire. L’enregistrement à cellules entières et à canal unique est possible à partir de cellules musculaires lisses individuelles encore intégrées dans leurs artérioles parentales, comme suit. Les artérioles rétiniennes sont isolées et ancrées dans la chambre d’enregistrement à l’aide de fils de tungstène.La lame basale doit être digérée pour permettre la formation d’un joint à haute résistance entre la pipette patch et la membrane des cellules musculaires lisses artériolaires. Les artérioles sont superfusionnées avec une série séquentielle de solutions enzymatiques à 37 degrés Celsius, ce qui entraîne également un découplage électrique des cellules adjacentes, comme l’indiquent les flèches sur l’image. Le niveau de digestion est initialement évalué sur la séparation visuelle des couches musculaires endothéliales et lisses pendant l’étape de collagénase.L’élimination de tous les brins restants de la lame basale et/ou de la neuropile périphérique est réalisée en balayant soigneusement les pointes fermées de fines pinces le long de la surface du vaisseau. Pour le serrage par patch, l’extrémité de la pipette patch est positionnée verticalement au-dessus de la cellule d’intérêt et abaissée progressivement à l’aide du mouvement fin et lent du micromanipulateur pour entrer en contact avec la membrane musculaire lisse artériolaire. Ceci est jugé par le mouvement de la cellule et une variation de la résistance de la pipette, mesurée à l’aide d’un protocole de test d’étanchéité cellulaire dans le logiciel d’acquisition.Au fur et à mesure que la pipette est abaissée sur la cellule, la résistance de l’étanchéité augmente d’environ cinq fois. Une pression négative est appliquée transitoirement à l’arrière de la pipette et un gigaseal se forme progressivement. Cela nécessite des applications répétées de pression négative pendant une à cinq minutes.Pour l’enregistrement de cellules entières, la méthode du patch-clamp perforé est principalement utilisée. Un gigaseal est formé, comme décrit précédemment, avec une pipette contenant une solution de type intracellulaire et de l’amphotéricine B. La résistance d’accès est surveillée à l’aide du protocole de test membranaire dans le logiciel d’acquisition. Une fois que la résistance d’accès tombe à moins de 15 mégaohms, une compensation de résistance série est effectuée.En règle générale, il est possible de compenser la résistance en série d’environ 75 % en mode patch perforé. Des pas de tension ou des protocoles de rampe peuvent ensuite être utilisés pour mesurer les courants de cellules entières. Après dissociation de la rétine, les artérioles primaires, secondaires et précapillaires peuvent être identifiées en fonction de leur calibre et de la disposition des cellules musculaires lisses vasculaires.Les artérioles du premier et du deuxième ordre semblent visuellement similaires en microscopie à fond clair, mais peuvent être distinguées sur la base de leur taille. Les artérioles précapillaires sont les plus petits vaisseaux artériels de la préparation et sont facilement reconnaissables en raison de l’arrangement intermittent des cellules musculaires lisses vasculaires. Les artérioles isolées peuvent être clairement différenciées des capillaires et des veinules au sein de l’isolement.Les capillaires sont apparents sous la forme d’un réseau de vaisseaux de petit calibre d’environ quatre à 10 micromètres de diamètre, tandis que les veinules sont à paroi mince et ne couvrent pas de cellules musculaires lisses. Les artérioles primaires, secondaires et précapillaires conviennent à la myographie de pression, à l’imagerie calcique et aux études par patch-clamp. À l’aide d’artérioles sous pression, nous avons étudié les mécanismes moléculaires impliqués dans la génération de la réponse myogénique.Les photomicrographies de cette image montrent une artériole rétinienne de rat à différents moments au cours d’une expérience de myographie de pression. Le graphique ci-dessous montre les changements de diamètre du récipient pendant toute la durée de l’expérience. Immédiatement après la pressurisation, le vaisseau se dilate, ce qui est ensuite suivi d’une constriction myogénique active qui atteint un niveau d’équilibre après 15 minutes.L’ajout de wortmannine dans une solution de Hanks à zéro calcium à la fin de l’expérience dilate le récipient à son diamètre passif à des fins de normalisation. Cette diapositive montre un exemple d’enregistrement à un canal à partir d’une cellule musculaire lisse de l’artériole rétinienne avant et après l’étirement de la membrane. Ce patch sur cellule contient deux canaux TRPV2 activés par étirement, dont l’activité augmente avec l’application d’une pression négative sur la pipette patch.Les protocoles décrits ici nécessitent de la pratique, mais doivent être réalisables avec un minimum de dépannage. Nous recommandons d’utiliser les artérioles isolées le même jour que l’isolement. La méthode est optimisée pour les artérioles rétiniennes de rat, mais peut être utilisée sur les rétines de souris.Nous avons largement utilisé cette préparation, mais dans la mesure du possible, nous essayons également de valider nos principaux résultats en utilisant des montages rétiniens entiers ex vivo et des mesures in vivo du diamètre des vaisseaux sanguins et du débit sanguin.

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