Isolement des artérioles rétiniennes Ex Vivo études de physiologie cellulaire

Ce manuscrit décrit un protocole simple pour l’isolement des artérioles de la rétine de rat qui peut être utilisé dans, calcium imagerie et pression myographie des études électrophysiologiques.

Comprendre comment le flux sanguin est contrôlé dans la rétine est un objectif important, car un flux sanguin anormal a été impliqué dans le développement d’une variété de maladies rétiniennes menaçant la vue, telles que la rétinopathie diabétique, le glaucome et les occlusions veineuses ramifiées. Les artérioles rétiniennes jouent un rôle clé dans la régulation du flux sanguin dans la rétine en dilatant et en resserrant leur diamètre luminal, médié par des modifications de la contractilité des cellules musculaires lisses qui entourent ces vaisseaux. Comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents à la régulation de la perfusion rétinienne nécessite donc des préparations permettant d’accéder aux cellules musculaires lisses artériolaires rétiniennes et de les étudier dans des conditions aussi proches que possible de la physiologie.

Dans cette vidéo, nous démontrons un protocole simple pour l’isolement des artérioles de la rétine du rat qui peut être utilisé dans les études de patch clamp, d’imagerie calcique et de myographie de pression. Au cours des dernières années, cette préparation a été utilisée pour fournir des informations supplémentaires sur la régulation de la contractilité des muscles lisses vasculaires et du flux sanguin dans la rétine, tant en bonne santé qu’en maladie. Préparez une solution d’un litre à faible teneur en calcium contenant du Hanks’or LCH, comme indiqué dans le tableau des matériaux.

Assemblez l’équipement d’isolement avant le prélèvement des tissus. La pipette Pasteur en verre doit être polie au feu pour lisser, mais pas rétrécir la pointe. Coupez une pipette en plastique à une ouverture d’environ cinq à sept millimètres.

Placez les yeux sur la boîte de dissection, immergés dans la solution LCH. Utilisez une paire de pinces pour ancrer l’œil à la parabole en tenant les attaches des muscles orbitaires ou le nerf optique. Assurez-vous que le point d’ancrage est le plus près possible de la sclérotique pour stabiliser l’œil.

À l’aide de la lame, coupez la cornée le long de l’ora serrata et retirez le cristallin en appuyant doucement sur la sclérotique à l’aide d’une pince. La petite région circulaire que nous voyons à l’arrière de l’œil sur cette image est le nerf optique. À l’aide de la lame, coupez l’œilleton en deux symétriquement à travers le disque optique.

À l’aide d’une pince fermée, brossez doucement les rétines des deux moitiés de l’œilleton, en prenant soin d’enlever toutes les attaches restantes au niveau du disque optique. Répétez le processus avec le deuxième œil et transférez les rétines disséquées dans le tube à essai à l’aide de la pipette en plastique et d’une petite goutte de milieu LCH. À l’aide de la pipette en plastique, remplissez le tube à essai de LCH à environ cinq millilitres et laissez les rétines se déposer au fond du tube.

Lavez le mouchoir environ trois fois en retirant environ quatre millilitres de solution du tube et en ajoutant du LCH frais à l’aide de la pipette en plastique. Si nécessaire, les tissus étrangers doivent être enlevés. Lavez l’intérieur de la pipette Pasteur en verre avec l’embout poli avec du LCH pour éviter que le tissu ne colle à la pipette.

À l’aide de la même pipette, prélevez environ quatre millilitres de solution du tube à essai et ajoutez environ deux millilitres de LCH frais. Dissociez doucement les rétines en aspirant lentement le tissu à travers la pointe de la pipette en verre, et expulsez le contenu dans le tube à essai. Essayez de ne pas introduire de bulles à ce stade et répétez le processus jusqu’à ce que les rétines soient brisées à la taille d’environ deux à trois millimètres carrés.

Lavez l’intérieur de la pipette avec environ deux millilitres de LCH et expulsez-le dans le tube à essai. Laissez le contenu se déposer au fond pendant cinq à 10 minutes. Répétez le processus de trituration comme décrit précédemment avec un peu plus de force jusqu’à ce que les morceaux de tissu aient une taille d’environ un millimètre carré.

Laissez le tissu se déposer et répétez une fois de plus avec encore plus de force jusqu’à ce que le contenu soit complètement homogénéisé et qu’il ne reste plus aucun morceau de rétine. La solution à ce stade devrait apparaître laiteuse. Cette technique permettra d’obtenir jusqu’à huit segments d’artériole par isolement, mesurant de 200 à 2 500 micromètres de longueur.

La canulation d’une extrémité de l’artériole avec occlusion de l’extrémité opposée permet de mesurer la vasoconstriction induite par la pression, également connue sous le nom de réponse myogénique. La myographie de pression artériolaire s’effectue comme suit. Une aliquote d’homogénat rétinien est transférée dans une chambre d’enregistrement physiologique montée sur la platine d’un microscope inversé.

Laissez l’homogénat se déposer au fond de la chambre pendant au moins cinq minutes. Balayez visuellement la chambre d’enregistrement pour identifier les artérioles de plus de 200 micromètres de longueur et possédant une extrémité ouverte à travers laquelle le récipient peut être canulé. Ancrez à une extrémité du récipient à l’aide d’une pince fine et d’un petit fil de tungstène placé sur le récipient.

À l’aide des extrémités qui se chevauchent du fil de tungstène, manœuvrez le récipient pour qu’il traverse horizontalement le bain, de sorte que l’extrémité ouverte soit alignée avec la canule de pressurisation. Perfuser la chambre avec zéro calcium Hanks' à 37 degrés Celsius. Les canulations sont effectuées à l’aide de pipettes en verre.

La canule est positionnée à l’extrémité ouverte du vaisseau à l’aide d’un micromanipulateur fin. L’extrémité est positionnée immédiatement à côté de l’ouverture, comme évalué en ajustant le plan de mise au point sur le microscope, de sorte que l’extrémité du vaisseau et l’extrémité de la canule soient nettes en même temps et que la canule de pressurisation avance dans l’ouverture du récipient. Une pipette auxiliaire est nécessaire pour faciliter le processus de canulation et est utilisée pour retenir doucement l’artériole et guider la paroi artériolaire sur la canule de pressurisation en même temps que la canule est avancée dans la lumière du vaisseau.

Cette procédure nécessite un mouvement simultané et contrôlé des deux manipulateurs et une pratique approfondie pour obtenir un taux de réussite élevé. Après une minute d’enregistrement à zéro millimètre de mercure, la pression intraluminale est augmentée à 40 millimètres de mercure, et le récipient devrait se dilater rapidement, confirmant la réussite de la canulation. La vasoconstriction induite par la pression, c’est-à-dire la réponse myogénique, se développera par la suite sur une période d’environ 15 minutes.

L’enregistrement par patch clamp à partir de cellules musculaires lisses vasculaires rétiniennes permet d’étudier les courants ioniques de la membrane plasmique qui régulent le calcium intracellulaire et donc la contractilité cellulaire. L’enregistrement à cellules entières et à canal unique est possible à partir de cellules musculaires lisses individuelles encore intégrées dans leurs artérioles parentales, comme suit. Les artérioles rétiniennes sont isolées et ancrées dans la chambre d’enregistrement à l’aide de fils de tungstène.

La lame basale doit être digérée pour permettre la formation d’un joint à haute résistance entre la pipette patch et la membrane des cellules musculaires lisses artériolaires. Les artérioles sont superfusionnées avec une série séquentielle de solutions enzymatiques à 37 degrés Celsius, ce qui entraîne également un découplage électrique des cellules adjacentes, comme l’indiquent les flèches sur l’image. Le niveau de digestion est initialement évalué sur la séparation visuelle des couches musculaires endothéliales et lisses pendant l’étape de collagénase.

L’élimination de tous les brins restants de la lame basale et/ou de la neuropile périphérique est réalisée en balayant soigneusement les pointes fermées de fines pinces le long de la surface du vaisseau. Pour le serrage par patch, l’extrémité de la pipette patch est positionnée verticalement au-dessus de la cellule d’intérêt et abaissée progressivement à l’aide du mouvement fin et lent du micromanipulateur pour entrer en contact avec la membrane musculaire lisse artériolaire. Ceci est jugé par le mouvement de la cellule et une variation de la résistance de la pipette, mesurée à l’aide d’un protocole de test d’étanchéité cellulaire dans le logiciel d’acquisition.

Au fur et à mesure que la pipette est abaissée sur la cellule, la résistance de l’étanchéité augmente d’environ cinq fois. Une pression négative est appliquée transitoirement à l’arrière de la pipette et un gigaseal se forme progressivement. Cela nécessite des applications répétées de pression négative pendant une à cinq minutes.

Pour l’enregistrement de cellules entières, la méthode du patch-clamp perforé est principalement utilisée. Un gigaseal est formé, comme décrit précédemment, avec une pipette contenant une solution de type intracellulaire et de l’amphotéricine B. La résistance d’accès est surveillée à l’aide du protocole de test membranaire dans le logiciel d’acquisition. Une fois que la résistance d’accès tombe à moins de 15 mégaohms, une compensation de résistance série est effectuée.

En règle générale, il est possible de compenser la résistance en série d’environ 75 % en mode patch perforé. Des pas de tension ou des protocoles de rampe peuvent ensuite être utilisés pour mesurer les courants de cellules entières. Après dissociation de la rétine, les artérioles primaires, secondaires et précapillaires peuvent être identifiées en fonction de leur calibre et de la disposition des cellules musculaires lisses vasculaires.

Les artérioles du premier et du deuxième ordre semblent visuellement similaires en microscopie à fond clair, mais peuvent être distinguées sur la base de leur taille. Les artérioles précapillaires sont les plus petits vaisseaux artériels de la préparation et sont facilement reconnaissables en raison de l’arrangement intermittent des cellules musculaires lisses vasculaires. Les artérioles isolées peuvent être clairement différenciées des capillaires et des veinules au sein de l’isolement.

Les capillaires sont apparents sous la forme d’un réseau de vaisseaux de petit calibre d’environ quatre à 10 micromètres de diamètre, tandis que les veinules sont à paroi mince et ne couvrent pas de cellules musculaires lisses. Les artérioles primaires, secondaires et précapillaires conviennent à la myographie de pression, à l’imagerie calcique et aux études par patch-clamp. À l’aide d’artérioles sous pression, nous avons étudié les mécanismes moléculaires impliqués dans la génération de la réponse myogénique.

Les photomicrographies de cette image montrent une artériole rétinienne de rat à différents moments au cours d’une expérience de myographie de pression. Le graphique ci-dessous montre les changements de diamètre du récipient pendant toute la durée de l’expérience. Immédiatement après la pressurisation, le vaisseau se dilate, ce qui est ensuite suivi d’une constriction myogénique active qui atteint un niveau d’équilibre après 15 minutes.

L’ajout de wortmannine dans une solution de Hanks à zéro calcium à la fin de l’expérience dilate le récipient à son diamètre passif à des fins de normalisation. Cette diapositive montre un exemple d’enregistrement à un canal à partir d’une cellule musculaire lisse de l’artériole rétinienne avant et après l’étirement de la membrane. Ce patch sur cellule contient deux canaux TRPV2 activés par étirement, dont l’activité augmente avec l’application d’une pression négative sur la pipette patch.

Les protocoles décrits ici nécessitent de la pratique, mais doivent être réalisables avec un minimum de dépannage. Nous recommandons d’utiliser les artérioles isolées le même jour que l’isolement. La méthode est optimisée pour les artérioles rétiniennes de rat, mais peut être utilisée sur les rétines de souris.

Nous avons largement utilisé cette préparation, mais dans la mesure du possible, nous essayons également de valider nos principaux résultats en utilisant des montages rétiniens entiers ex vivo et des mesures in vivo du diamètre des vaisseaux sanguins et du débit sanguin