Name: Évaluation de la santé axée sur l’autopsie de poissons sauvages (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Découvrez l'évaluation de la santé des poissons sauvages par nécropsie pour surveiller les écosystèmes aquatiques. Cette méthode standardisée permet de documenter les lésions visibles et de collecter des tissus pour analyses histopathologiques.

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Ce travail a été financé par les écosystèmes du US Geological Survey (environnements de la baie de Chesapeake et de la pêche) et des programmes de santé de l’environnement (biologie de Contaminants) et le West Virginia Department of Natural Resources. Utilisation de noms commerciaux est uniquement à des fins d’identification et n’implique pas l’approbation par le gouvernement américain.

Méthodes décrites ici ont été approuvés par le Midpark Science Centre animalier institutionnel et Comité d’urbanisme.
1. Collection de poissons
<ol><li>Recueillir des poissons vivants avec un minimum de stress. Utiliser la pêche électrique en bateau ou en sac à dos, de crochet et de ligne ou de filets.</li>
	<li>Expirera d’échantillonnage de poissons dans des puits direct ou récipients aérés. Remarque : L’American Fisheries Society a publié un certain nombre de guides pour les poissons, leur manipulation et anesthésie/euthanasie26,27,28. Portez des gants lorsque vous manipulez des poissons.</li>
</ol>2. poisson nécropsie
<ol><li>
Euthanasier un poisson.
	<ol>
<li>Placer le poisson dans l’anesthésie jusqu'à ce que le mouvement operculaire cesse et le poisson perd équilibre. Après un autre 2 – 10 min le poisson va être euthanasié ; Toutefois, cela peut varier aussi en espèces. NOTE : Le poisson peut être euthanasiés avec un certain nombre d’anesthésiques (voir Table des matières pour le plus couramment utilisé). Les mesures de laboratoire qui seront réalisés sur des tissus prélevés29dépendra de la méthode d’euthanasie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mesurer les caractéristiques biométriques.
	<ol>
<li>Peser le poisson au gramme près.</li>
		<li>Mesurer la longueur du poisson au millimètre.<ol>
<li>Mesurer la longueur totale du bout du museau avec la bouche fermée jusqu'à la fin de la queue quand elle est pincée ensemble.</li>
			<li>Mesurer la longueur à la fourche de la fourche de la queue jusqu'à la pointe du museau et la longueur standard du bout du museau à l’extrémité du corps (à partir de la queue).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Calculer le coefficient de condition à l’aide de la formule suivante : Le coefficient de condition = (poids total - poids des gonades) / total longueur3. Remarque : Poids des gonades est soustraite de la masse corporelle totale puisque les gonades peuvent contribuer significativement au poids total du corps, en particulier chez les poissons femelles pré-fraye.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Obtenir un échantillon de sang. NOTE : Sang provient plus souvent la veine caudale, mais peut également être retiré par l’aorte dorsale ou par cardiaque perforations30.<ol>
<li>Prélever un échantillon de sang périphérique de la veine caudale avec une aiguille de 22 ou 23 G sur une seringue de 1 à 5 mL, selon la taille du poisson. Insérer l’aiguille avant la région caudale sous la ligne latérale (Figure 1 a et 1 b). Il, incliner vers le haut jusqu'à frapper la colonne vertébrale et puis retirer un peu. La veine est ventrale au rachis sus-jacent. Remarque : Si les frottis sanguins seront faites ou sérum est requis, aucun anticoagulant n’est utilisé. Dans la plupart des cas, plasma est recueillie et, par conséquent, un anticoagulant comme l’héparine de sodium, EDTA ou au lithium est utilisé pour recouvrir l’aiguille et la seringue et est aussi dans le tube de prélèvement de sang (p. ex., vacutainer).</li>
		<li>Retirer l’aiguille et le placer dans un contenant de récupération d’objets pointus ou tranchants avant de mettre le sang dans le tube de prélèvement. NOTE : Sang peut être maintenue sur la glace, mais en fonction des analyses subséquentes doit être centrifugé dès que possible30.</li>
		<li>Si des anomalies nucléaires ou différentielle numération globulaire sera évaluée, placer immédiatement une goutte de sang sur lames de microscope en double verre propre. Nouveau une deuxième lame à un angle de 45° dans la goutte, qui est ensuite dessinée sur toute la surface par capillarité. Laisser pour sécher à l’air31.</li>
		<li>Centrifuger de sang à 1 500 à 2 500 g pendant 15 min à sédiments les cellules. Retirer le plasma/sérum avec une pipette de transfert stérile, aliquote dans deux flacons cryogéniques et conserver à-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57946/57946fig1.jpg"> Figure 1 : Obtention d’un échantillon de sang provenant d’un poisson. (A) A récemment euthanasié poisson est posé sur son côté et la ligne latérale située. (B), une aiguille est insérée ventrale au latéral ligne (flèche), inclinée vers le haut jusqu'à ce que l’aiguille touche la colonne vertébrale. Il est alors légèrement retiré et aspiration amorcé à prélever du sang. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57946/57946fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<ol start="4"><li>
Procéder à une évaluation de santé axée sur l’autopsie sur chaque poisson. Remarque : Un certain nombre de publications illustrant et décrivant les lésions et les anomalies est disponibles32,33,34,35.<ol>
<li>Anomalies externes, y compris des lésions sur la surface du corps et des nageoires (Figure 2), des yeux et des branchies (Figure 3), parasites externes tels que les sangsues (Figure 2D), des larves ou des kystes trématode métacercaire (Figure 2D, le document 3 b) et (Figure 3D) les parasites des branchies. Document type, emplacement et taille des anomalies observées sur les feuilles de données, aussi bien que photographiquement, si possible.</li>
		<li>Ouvrir la cavité abdominale (Figure 4 a) en utilisant une paire de ciseaux de coupe de la région anale à l’opercule et puis en supprimant le lambeau du muscle pour exposer les organes internes. Remarque : Si le rein antérieur est recueillie pour immunitaire fonctionne (Voir l’étape 5 ci-dessous) ou échantillons prélevés pour bactériologie ou virologie, la surface du corps externe doit être désinfectée avec de l’alcool 70 % et ceux d’échantillons doit être obtenue avant l’autopsie effectuée. Si les tissus sont uniquement utilisés pour les observations visuelles, des analyses de plasma et histopathologie technique stérile n’est pas nécessaire.</li>
		<li>Document des anomalies internes (Figure 4) y compris la décoloration de la concentration ou générales des divers organes (Figure 4 b-4D), présence de soulevé zones (Figure 4E), les kystes, les parasites et taille (anomalies agrandi, atrophie).</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57946/57946fig2.jpg"> Figure 2 : Exemples de lésions visibles observés sur la surface du corps et les nageoires du poisson. (A) A petite, légèrement érodée lésion (flèche) sur la surface latérale. (B) une grande rougie surface (flèche) impliquant la surface caudale. (C) surélevé, des lésions noires (flèches) sur la surface du corps et les nageoires. (D), sangsues (flèche blanche) et petites taches noires (flèches noires) sur la nageoire. Echelle = 3 mm. (E) A soulevé, lésion multilobée, pâle (flèche) sur la surface du corps. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57946/57946fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57946/57946fig3.jpg"> Figure 3 : Exemples de lésions visibles des branchies et des yeux de poisson. (A) A pale zone (flèche) au sein de la lentille de œil. Echelle = 5 mm. (B) blancs kystes (flèches blanches) et petites taches noires (flèches noires) causées par les trématodes parasites sur l’opercule couvrant les branchies (un). Echelle = 1 cm. (C) une pâle, érodée zone (flèche) sur les branchies (un). Echelle = 5 mm. (D) une branchie qui a été supprimée en montrant des parasites (flèches) attachée aux filaments branchiaux. Echelle = 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57946/57946fig3large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57946/57946fig4.jpg"> Figure 4 : Exemples d’une autopsie et des anomalies internes du poisson. (A) au cours d’une autopsie, le poisson est découpé (le long de la flèche blanche) et un lambeau du muscle (flèche noire) retiré pour exposer la gonade (a) et la rate, étant détenu par pinces et ciseaux. (B) marbré foie (a), testicules (b), l’intestin entouré d’un tissu adipeux graisse (c) et l’estomac (d). Echelle = 5 mm. (C) du foie (a) avec une zone rouge sombre (flèche), des ovaires et des intestins (c) (b). Echelle = 5 mm. (D) du foie avec des zones décolorées verdâtres (flèches). Echelle = 1 cm. (E) exemple d’une vie normale (a) et anormales (b) testicules avec soulevé des nodules. Echelle = 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57946/57946fig4large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<ol start="5"><li>
Obtenir l’indice hépatosomatique (HSI).
	<ol>
<li>Retirez le foie en sectionnant l’artère hépatique et le tissu conjonctif de l’extrémité antérieure. Soulevez doucement tout en les adhérences de parage et autres connexions intestin et graisse adipeuse. Prenez soin de ne pas perforation de la vésicule biliaire. Peser le foie. Remarque : Certains poissons, comme les cyprinidés, n’ont pas un foie discrète mais plutôt hépatique tissu enroulé autour des intestins et autres organes. Pour ces espèces, ce n'est pas possible d’obtenir du poids du foie.</li>
		<li>Calculer l’indice hépatosomatique (HSI) selon la formule suivante : HSI = poids poids du foie/total</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Calculer l’indice gonadosomatique.
	<ol>
<li>Retirez les gonades et pesez-le.</li>
		<li>Calculer l’indice gonadosomatique (GSI) à l’aide de la formule : GSI = gonade poids/corps poids total</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. préserver les tissus pour la pathologie microscopique
Remarque : Un certain nombre de fixatifs dont 10 % de formol tamponné neutre et Z-fix, fixateur avec zinc, axée sur le formol peut être utilisé pour la préservation du tissu dans le domaine. Ce dernier est préférable si les méthodes telles que l’hybridation in situ ou immunofluorescence peuvent être utilisés.
<ol><li>Soigneusement coupé mais ne tirez pas sur des échantillons de tissus. Garder les morceaux de tissus individuels &lt; 2 cm de taille et &lt; 5 mm d’épaisseur pour une bonne fixation. En règle générale, utilisez environ 10 x plus fixateur en volume que le tissu pour une bonne conservation. Placez tous les échantillons de tissu d’un poisson dans le même conteneur étanche de taille appropriée, selon la taille des poissons échantillonnés.</li>
	<li>Placer les morceaux de toute anomalie externe dans le bac fixateur. En outre, inclure une pièce adjacente de tissu normal. Remarque : Une mauvaise manipulation tels que compression ou autres dommages mécaniques, longue exposition à l’air ou la lumière du soleil et la congélation peuvent causer des artefacts.</li>
	<li>Coupez au moins cinq morceaux épais de 3 à 4 mm de foie provenant de diverses régions et placez-les dans le récipient de fixateur. Parmi les zones normales et anormales, si observée.</li>
	<li>Selon la taille, placez une gonade entière ou plusieurs pièces le long d’une gonade dans le récipient de fixateur.</li>
	<li>Placer des organes entiers, si petits, ou des morceaux de tous les autres organes (rate, rein antérieur et postérieur, branchies, cœur, intestin et l’estomac) dans le bac fixateur. Si on observe les tissus anormaux, préserver une pièce adjacente de tissu normal aussi bien.</li>
</ol>4. Retirez les otolithes pour les Analyses de l’âge
NOTE : Âge peut être une variable importante dans les études de santé/les maladies des poissons poissons. Alors qu’un certain nombre de structures, y compris les échelles et les épines, ont été utilisé pour la détermination de l’âge, la plupart des études comparant les structures ont trouvé les otolithes de donner les meilleurs résultats36,37. Poissons téléostéens possèdent trois paires des otolithes - lapillus, sagitta et asteriscus. Généralement, les otolithes sagittales ou lapillus sont collectés pour le vieillissement mais qui peuvent varier selon l’espèce. Techniques d’enlèvement et de vieillissement ont été décrites précédemment38.
<ol><li>Couper à travers l’isthme de gill et penchez la tête en arrière. Strip loin conjonctif et musculaire tissu autour les parties inférieures du neurocrâne pour localiser prootique bulles, une bosses osseuses.</li>
	<li>Marquer ou coupés avec coupe osseuse et le crack pour exposer les otolithes. Ils peuvent être vus à le œil nu.</li>
	<li>Placer les otolithes dans un flacon étiqueté ou une enveloppe de pièce de monnaie et les conserver à température ambiante jusqu'à ce qu’analysés pour l’âge en comptant les anneaux ou incréments38. Si placé dans un flacon, ouvrir le bouchon une fois retourné au laboratoire et laisser bien sécher avant stockage.</li>
</ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57946/57946fig5.jpg"> Figure 5 : Élimination des otolithes. (A) l’isthme est coupé et le tissu conjonctif et les muscles tiré loin d’exposer la base de la colonne vertébrale et de neurospinal. (B), l’OS est fissuré pour exposer les otolithes. (C) lapillus otolithes sont supprimés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57946/57946fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
5. obtenir des tissus pour des analyses de la fonction immunitaire
Remarque : Le rein antérieur est le principaux organes hématopoïétiques, la source des lymphocytes et des macrophages pour les tests fonctionnels et doit être enlevé aseptiquement si cellules vont être cultivées pour les tests fonctionnels, tels que mitogenèse, phagocytaire et la capacité de tuer des macrophages39,40.
<ol><li>Vaporiser sur la surface externe du poisson avec l’éthanol à 70 %. Utiliser des ciseaux stériles, un scalpel et une pince pour ouvrir la cavité abdominale et retirer le tissu rénal antérieur, qui est un organe rouge foncé situé devant la vessie natatoire.</li>
	<li>Placer l’échantillon de rein antérieur dans les médias (dep. ex., Leibovitz L-15) de garder les cellules vivantes. Homogénéiser les échantillons de rein avec un broyeur de tissu à main stérile (par exemple, Moulin de Tenbroeck tissu) dans des suspensions de cellules du même. Tenir sur la glace humide jusqu’au retour au laboratoire.</li>
</ol>6. préserver le tissu pour l’analyse des acides nucléiques
Remarque : Si l’analyse moléculaire en aval se déroulera, comme l’expression des gènes à l’aide de transcription abondance41 ou quantitative PCR42 (réaction en chaîne par polymérase), placer les morceaux de tissu à évaluer dans une conservation appropriée ( par exemple, RNAlater solution de stabilisation) dès que possible.
<ol><li>Pour la préservation du RNA, placer deux ou trois morceaux de petites (2 à 3 mm) dans le produit de préservation appropriée à un ratio de 10:1 de conservateur volume aux tissus. Remarque : Échantillons devraient être protégés de la lumière du soleil ou de chaleur excessive et transportés sur la glace humide.</li>
	<li>Pour la conservation de l’ADN, placer deux ou trois petits morceaux de tissu dans l’éthanol à 95 % (10:1 éthanol au tissu en volume). Puis maintenez les échantillons sur glace mouillée et ensuite conserver à-20 ° C.</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L’évaluation axée sur l’autopsie de la santé du poisson peut être utilisée sur n’importe quel espèce de poisson dont l’enquêteur a une compréhension de l’aspect normal des structures externes et internes. À l’aide d’une approche normalisée permet des comparaisons entre les sites et espèces ainsi que les modifications saisonnières et temporelles dans une population. Les conclusions peuvent servir à identifier les effets associés à des sources ponctuelles et non ponctuelles de contaminants et d’informer des mesures de gestion. Il peut également être utilisé pour suivre les améliorations dès que les mesures de gestion sont initiées. La méthodologie peut être modifiée afin d’augmenter la documentation des anomalies externes visuelles dans une variété de façons. Quotes-parts, basées uniquement sur des observations visuelles, peuvent être non létales, relativement peu coûteux et données peuvent être générées rapidement pour un grand nombre d’individus. Par conséquent, ils peuvent être utiles pour l’évaluation exploratoire ou initiale, pour surveiller le changement au fil du temps, ou en combinaison avec d’autres indicateurs. Si la longueur et le poids du poisson sont mesurées au cours des observations visuelles, le coefficient de condition peut aussi être calculé. Bien que les évaluations basées uniquement sur l’observation visuelle ne fournissent pas d’informations sur la cause ou des facteurs de risque associés, les tendances à long terme de certaines anomalies de peau45 et paramètres biométriques46 ont indiqué une amélioration dans certains domaines associé à améliorer la qualité de l’eau.
L’évaluation axée sur l’autopsie fournit davantage d’informations que les organes internes sont également examinés et autres facteurs de condition comme l’indice hépatosomatique et l’indice gonadosomatique peuvent être calculées. Goede et Barton22 mis au point une méthode de l’autopsie de champ comprenant les paramètres sanguins, facteurs biométriques, le pourcentage d’anomalies et les valeurs d’index d’anomalies spécifiques. Un affinement de la méthode inclus un indice de gravité pour certaines variables qui ont permis le calcul d’un indice d’évaluation de santé qui pourrait être comparé statistiquement23. Cet indice d’évaluation de la santé a été utilisé dans le site régional des comparaisons23,47,48 et en combinaison avec d’autres indicateurs biologiques y compris plasma et analyses histopathologiques dans le U.S. Geological Biosurveillance de l’état écologique et Trends Program, évaluer les effets éventuels de l’exposition aux contaminants dans les grands cours d’eau à l’échelle nationale49,50,51de l’enquête. Un indice de maladie poisson issu des maladies visibles de l’extérieur et parasites, les néoplasmes hépatiques visibles et autres examen histopathologique décelé des lésions du foie a été mis au point et largement utilisé dans la mer du Nord, mer Baltique et au large de l’Islande. Cet indice s’est avéré pour être un outil important comme un écosystème santé indicateur52.
Il y a certains facteurs essentiels dans la conduite de l’évaluation axée sur l’autopsie sur les poissons. Tout d’abord, les évaluations doivent être effectuées sur les poissons immédiatement après la mort. Changements dans la couleur de l’orgue et la cohérence peuvent se produire assez rapidement après la mort. En outre, certains parasites peuvent quitter l’hôte peu après la mort. Deuxièmement, il est important de savoir ce qui est normal pour les espèces d’intérêt. Par exemple, certains poissons ont normalement gras et par conséquent, pâle foies, tandis que pour la plupart des espèces, un foie pâle serait anormal. Il est également important de reconnaître les changements saisonniers qui se produisent naturellement. Certains poissons aura des changements de couleur ou développer des tubercules de reproduction pendant la saison du frai.
Les limites de l’évaluation axée sur l’autopsie comme méthode d’évaluation de la santé des poissons comprennent l’impossibilité d’identifier 1) systématiquement la « cause » des lésions spécifiques et 2) identifier les effets qui ne peuvent pas être visibles à le œil nu. Ces inconvénients peuvent être surmontés avec l’ajout de l’histopathologie, identification moléculaire ou culturelle des agents pathogènes et parasites et l’expression génique. Par exemple, une « tumeur » ou une lésion surélevée (gonflement) peut être réelle néoplasie ou il peut être un parasite, l’inflammation, l’oedème ou l’hyperplasie (augmentation de nombre des cellules normales), causée par l’exposition aux produits chimique, des agents infectieux ou autres irritants. Comme le montre les résultats représentatifs, tumeur définitif ou le diagnostic de néoplasie nécessite pathologie microscopique pour identifier le type de lésion et de la gravité (c.-à-d., bénignes ou malignes). Évaluation des meuniers externe « tumeurs » par observation visuelle surestimé la prévalence, en particulier sur le site de référence. Bon nombre des lésions surélevées n’étaient pas néoplasmes mais lésions hyperplasiques plutôt. On ne sait pas actuellement si ces lésions hyperplasiques sont prénéoplasique. L’observation du relief nodules dans le foie sous-estimées à l’inverse, la prévalence de tumeurs du foie. Collection de tissus destinés à la pathologie microscopique était donc nécessaire de traiter convenablement le potentiel pour la radiation.

Les activités humaines ont de nombreux effets négatifs sur les milieux aquatiques. Poissons peuplent les différents plans d’eau qui recrée dans et utilise souvent comme une source d’eau potable de la population humaine et sont donc importants indicateurs de la santé du milieu aquatique. Des poissons sauvages qui vivent et se reproduisent dans un habitat particulier sont exposées tout au long de leur vie à divers agents stressants, y compris les agents pathogènes, parasites, qualité médiocre de l’eau et des contaminants chimiques. Des milliers de produits chimiques entrer dans nos cours d’eau par des eaux usées industrielles et humaines, des eaux de ruissellement urbain/suburbain et lessivage des terres agricoles. Ces mélanges complexes de substances chimiques peuvent avoir des additifs, synergiques ou effets antagonistes sur les exposés des organismes1,2,3. En outre, les autres agresseurs environnementaux élevés tels que les éléments nutritifs, température élevée, faible teneur en oxygène dissous ou fluctuations de pH peut aggraver les effets des contaminants chimiques4,5. Facteurs de stress environnementaux peuvent également influencer les issues des maladies infectieuses directement par la multiplication des agents infectieux6, accroître la virulence des pathogènes opportunistes7 ou supprimant la réponse immunitaire et la maladie résistance de l’hôte8,9,10. Pour ces raisons, il est un intérêt croissant pour surveillance11,12,13,14, utilisant des poissons et autres organismes aquatiques pour identifier des effets biologiques ou indésirables populations et des écosystèmes en péril.
Surveillance des effets indésirables utilise des biomarqueurs à différents niveaux d’organisation, de l’organismique au subcellulaire ou moléculaires, d’identifier les effets sublétaux qui peuvent influencer les populations et indiquer d’exposition à divers facteurs de stress. Indicateurs au niveau de l’organisme comprennent des conditions et des anomalies visibles. Les indices de condition basées sur la longueur et le poids sont calculées afin d’évaluer le bien-être ou l’aptitude des populations de poissons. Le plus commun est des facteurs de condition de Fulton (K) = (poids/longueur3) 15. Un autre indicateur est la présence d’anomalies visibles. Diverses méthodes ont été utilisés dans les études individuelles et de programmes de surveillance pour évaluer, document et d’évaluer les anomalies visibles. Évaluation fondée uniquement sur des anomalies externes, c'est-à-dire la proportion de personnes atteintes de la maladie, les dommages aux nageoires, les tumeurs et les anomalies du squelette, est une des mesures de l’indice d’intégrité biotique (IIB) qui évalue la santé communautaire16. Une évaluation similaire appelée deltoïdes (érosions, lésions, malformations, tumeurs) a également été utilisée pour évaluer la santé des communautés de poissons17. Cependant, ces méthodes n’évaluent que les anomalies visuelles externes et des lésions pas internes ou des indicateurs précoces de sublétales.
Axée sur l’autopsie des quotes-parts comprennent les observations externes et internes et permettant de mesurer l’indices de condition supplémentaire. L’indice hépatosomatique (poids corporel de poids du foie/total) a également été utilisé comme un indicateur de remise en forme ou réserves d’énergie15 pour lequel une valeur d’index supérieure indique des poissons sains. Cependant, un certain nombre d’études ont montré que l’hypertrophie ou l’augmentation de taille du foie se produit en raison de l’exposition à divers contaminants métabolisé par le foie18,19,20. Dans ce cas, un indice plus élevé serait indicatif d’exposition à certaines classes chimiques. L’indice gonadosomatique (poids des gonades de poids/total) est un autre indice de condition orientée vers la santé génésique,21. Observations faites lors de l’évaluation axée sur l’autopsie permet de comparer la prévalence des types de lésion individuels ou pourcentage des individus normaux. Cependant, ils permet également à un plus quantitative santé évaluation22,23.
L’évaluation axée sur l’autopsie standardisée décrite ici peut servir à compléter l’évaluation exagérément visible de plusieurs façons selon l’ou les questions à trancher, expertise et autres ressources disponibles. Notre approche systématique consiste à collecter des données biométriques (poids, longueur, poids des gonades, le poids du foie), de sang pour les analyses de plasma/sérum, anomalies visibles externes et internes document, préserver les morceaux d’organes pour les analyses microscopiques et collecter des otolithes pour analyses de l’âge. L’évaluation axée sur l’autopsie plus l’analyse de l’âge et l’histopathologie des divers organes, permet le calcul et la comparaison des indices de condition, de la prévalence des anomalies visibles, ainsi que les modifications tissulaires microscopiques, selon le sexe, l’âge, du site et période d’échantillonnage. Collections de tissus supplémentaires sont possibles pour nombreuses autres analyses y compris la microscopie électronique, bactériologie, virologie, parasitologie et concentrations de produits chimiques. Ces méthodes peuvent aussi faire partie des analyses plus approfondies permettant de diagnostiquer la cause de poissons tue24 ou de mortalité en captivité Kalat25. Méthodes pour la collecte des tissus pour deux analyses supplémentaires, l’expression des gènes et des analyses fonctionnelles immunitaires sont illustrées.

<table><tbody><tr><td>Tables pliantes</td><td>Tous</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chaises pliantes</td><td>Tous Planches</td><td></td><td></td></tr><tr><td>de dissection</td><td>N’importe quelle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>planche de mesure (mm)</td><td>N’importe quelle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>balance à piles (g) pour le poids des poissons</td><td>Toute</td><td></td><td></td></tr><tr><td>balance à piles (mg) pour les poids des organes</td><td>N’importe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pince à dissection</td><td>Tous les</td><td></td><td></td></tr><tr><td>coupe-os</td><td>Tous les</td><td></td><td></td></tr><tr><td>scalpels et lames</td><td>Tous les</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gants jetables</td><td>Tous</td><td></td><td></td></tr><tr><td>les seaux Tous</td><td></td><td></td><td></td>les</tr><tr><td>flacons Nalgene étanches (250 ml)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>02-924-5C</td><td></td></tr><tr><td>Tubes Vacutainer avec héparine de sodium</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>02-689-6</td><td>Pour prélèvement sanguin</td></tr><tr><td>Seringues jetables de 3 mL avec aiguille de 23 g</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>14-826-11</td><td></td></tr><tr><td>Cryoflacons de 1 à 2 mL</td><td>N’importe quel</td><td></td><td>Utilisé pour les échantillons de plasma et d’ARN ultérieur</td></tr><tr><td>Solution de stabilisation Invitrogen RNAlater</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>AM7021</td><td></td></tr><tr><td>Z-Fix Formaldéhyde Fixateur de zinc</td><td>Anatech LTD</td><td>SKU-174</td><td></td></tr><tr><td>Tricaïne-S (MS-222)</td><td>Syndel USA</td><td></td><td>anesthésique pour poissons</td></tr><tr><td>Enveloppes de pièces de monnaie</td><td>N’importe Quelle</td><td></td><td>pour otolithes</td></tr><tr><td>Crayons et stylos</td><td>N’importe Quel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 % d’alcool</td><td>N’importe Quoi Fiches</td><td></td><td></td></tr><tr><td>techniques</td><td>N’importe</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Évaluation de la santé axée sur l’autopsie de poissons sauvages

Necropsy-based Wild Fish Health Assessment

Influences anthropogènes de nutriments accrues et des contaminants chimiques, aux modifications de l’habitat et du changement climatique peuvent avoir des effets significatifs sur les populations de poissons. Les effets indésirables, surveillance, utilisant des marqueurs biologiques de l’organisme à l’échelle moléculaire, peuvent servir à évaluer les effets cumulatifs sur les poissons et autres organismes. Santé du poisson a été utilisée dans le monde entier comme un indicateur de la santé de l’écosystème aquatique. L’évaluation de santé axée sur l’autopsie poisson fournit des données sur les indices de condition et organosomatiques des anomalies et lésions, parasites, visibles. Ceux-ci peuvent être comparées par site, saison et le sexe, ainsi que dans le temps, au document changement au fil du temps. Indices de gravité peuvent être assignés à différentes observations pour calculer un indice de santé du poisson pour une évaluation plus quantitative. L’inconvénient de l’évaluation axée sur l’autopsie, c’est qu’il repose sur des observations visuelles et facteurs de condition, qui ne sont pas aussi sensibles que le tissu et subcellulaires biomarqueurs pour des effets sublétaux. En outre, il est rarement possible d’identifier les causes ou les facteurs de risque associés à des anomalies observées. Ainsi, par exemple une lésion surélevée ou « tumeur » sur les nageoires, les lèvres ou les surface du corps peut être un néoplasme. Toutefois, ça pourrait aussi être une réponse à un parasite, une inflammation chronique ou d’hyperplasie des cellules normales en réponse à un irritant. À l’inverse, tumeurs, certains parasites, autres agents infectieux et nombreux changements tissulaires ne sont pas visibles et donc peuvent être sous-estimée. Cependant, au cours de l’évaluation axée sur l’examen nécropsique, sang (plasma), tissus pour l’histopathologie (pathologie microscopique), génomique et autres analyses moléculaires et les otolithes de vieillissement peuvent être collectées. Ces analyses en aval, ainsi que des analyses géospatiales, évaluations de l’habitat, les analyses de qualité et contaminant l’eau peuvent être importantes dans les évaluations de l’écosystème global.

Grands lacs secteurs préoccupants (SP) sont des zones géographiques qui ont été désignés en raison de déficiences des diverses utilisations bénéfiques. Parmi les utilisations bénéfiques altérées (UBA) à nombreux AOC est les poisson des tumeurs ou autres déformations. Des millions de dollars ont été dépensées pour la réhabilitation et la restauration de chacun de ces domaines afin de radier les BUIs diverses et, finalement, l' AOC43. Les critères pour la radiation de la tumeur de poisson que Bui diffère d’un État à l’autre (voir epa.ohio.gov/portals/35/lakeerie/ohio_AOC_delisting_guidance.pdf et dnr.wi.gov/topic/GreatLakes/documents/SheboyganRiverFinalReport2008.pdf) ; Toutefois, comme indiqué dans les documents de la radiation de la liste, on a besoin pour déterminer la prévalence des tumeurs du foie et dans certains cas des tumeurs cutanées. Dans de nombreux cas, la prévalence est comparée à un site de référence non-AOC.
La tumeur de poisson BUI a été évaluée à trois SP (rivières de St. Louis, Milwaukee et rivière Sheboygan) et un site de référence non-AOC (rivière de Kewaunee) sur les lacs supérieur et Michigan, utilisant une évaluation axée sur l’autopsie du meunier (Catostomus commersonii ), suivie de la pathologie microscopique de la peau et le tissu hépatique. Poissons ont été capturés dans les rivières de Milwaukee, Sheboygan et Kewaunee en 2012 et 201344 et du fleuve St. Louis en 2015 (données non publiées). Deux cents meuniers ont été évalués de Milwaukee, Kewaunee et Saint-Louis et 193 de Sheboygan.
Par définition, une tumeur peut être toutes surfaces surélevées ou un gonflement, mais on considère généralement qu’un gonflement causé par une croissance anormale des tissus avec des cellules anormales est soit une néoplasie bénigne ou maligne. Le meunier noir, provenant de tous les sites présentait une variété de lésions surélevées externes, y compris les petites taches blanches discrètes, grands cercles blancs, lésions mucoïdes légèrement surélevées et multilobés zones surélevées sur la surface du corps et les lèvres (Figure 6). Poissons ont été pesés et mesurés afin d’obtenir un coefficient de condition, des anomalies externes et internes ont été documentés et tissus cutanés et du foie ont été recueillies pour l’histopathologie.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57946/57946fig6.jpg"> Figure 6 : Lésions cutanées surélevé observée sur les meuniers des grands lacs. (A) une discrète tache blanche sur la surface du corps. Echelle = 5 mm. (B) A légèrement relevé mucoïde (flèches) et des lésions multilobées (a) sur la surface postérieure. Echelle = 1 cm. (C) A grand multilobée lésion sur la surface du corps. Echelle = 1 cm. (D) de nombreuses lésions polylobées sur les lèvres. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57946/57946fig6large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Le pourcentage des poissons présentant des tumeurs externes ou surélevé décolorées varie de 15,5 % dans le SP de Saint-Louis à 58,0 % dans le SP de Milwaukee. En règle générale, les taches blanches discrètes étaient la lésion visuelle moins commune tandis que la lèvre multilobée et les lésions de surface corps étaient les plus fréquentes. Le nombre de poissons avec des nodules hépatiques observables était faible, variant de 1,5 % à Kewaunee et Saint-Louis à 2,5 % à Milwaukee (tableau 1).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="4">Rivières et an échantillonnés</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lésions visibles</td>
			<td>Kewaunee 2013</td>
			<td>Saint-Louis 2015</td>
			<td>Sheboygan 2012</td>
			<td>Milwaukee 2013</td>
		</tr>
<tr>
<td>Taches blanches discrètes</td>
			<td>16</td>
			<td>3</td>
			<td>3.1</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mucoïde</td>
			<td>20</td>
			<td>9.5</td>
			<td>9.8</td>
			<td>30,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Multilobés</td>
			<td>22,5</td>
			<td>3</td>
			<td>29,5</td>
			<td>40</td>
		</tr>
<tr>
<td>La somme recueillie peau anomaliesun
</td>
			<td>46</td>
			<td>15.5</td>
			<td>38,3</td>
			<td>58</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nodules hépatiques visibles</td>
			<td>1.5</td>
			<td>1.5</td>
			<td>1.6</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">
un Nombre total de poissons présentant des lésions surélevées. Certains poissons ont plusieurs types d’anomalies.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Autopsie observatoires des meuniers noirs recueillis sur des grands lacs de préoccupation et un Site de référence (rivière de Kewaunee), présenté sous forme de pourcentage. Examen visuel peut être utilisé pour documenter les pour cent des poissons présentant des anomalies diverses. Cependant, en diagnostiquer définitivement la présence et le type de néoplasie, tissus doivent être examinés au microscope (histopathologie). Suite à l’examen microscopique, on a constaté que les lésions surélevées n’étaient pas tous néoplasiques. Beaucoup des taches blanches discrètes et les lésions mucoïdes, particulièrement à Kewaunee, étaient des lésions hyperplasiques plutôt que d’une néoplasie (tableau 2). En outre, à Kewaunee et Saint-Louis, toutes les tumeurs cutanées observées étaient papillomes bénins. À Sheboygan et Milwaukee, les papillomes et les carcinomes épidermoïdes, tumeurs malignes de la peau, ont été observés (tableau 2).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="4">Cours d’eau échantillonnés</td>
		</tr>
<tr>
<td>Type de néoplasme</td>
			<td>Kewaunee 2013</td>
			<td>Saint-Louis 2015</td>
			<td>Sheboygan 2012</td>
			<td>Milwaukee 2013</td>
		</tr>
<tr>
<td>Papillome</td>
			<td>21</td>
			<td>5.2</td>
			<td>30,5</td>
			<td>37,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Carcinome épidermoïde</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>2.1</td>
			<td>10.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tumeurs de la peau totale</td>
			<td>21</td>
			<td>5.2</td>
			<td>32,6</td>
			<td>48</td>
		</tr>
<tr>
<td>Canal cholédoque néoplasmesun
</td>
			<td>2.5</td>
			<td>4</td>
			<td>6.2</td>
			<td>9.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tumeurs de cellules hépatiquesb
</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>2.1</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tumeurs de foie entier</td>
			<td>3.5</td>
			<td>4</td>
			<td>8.3</td>
			<td>15.0c
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">
un Comprend cholangioma et cholangiocarcinome</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">
b Comprend des adénomes des cellules hépatiques et carcinome hépatique</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">
c Certains poissons ont tant Néoplasmes hépatiques et biliaires</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2 : Vérifiée au microscope des lésions néoplasiques des meuniers noirs recueillis sur des grands lacs de préoccupation et un Site de référence (rivière de Kewaunee), présenté sous forme de pourcentage. L’analyse histopathologique a également identifié des tumeurs du foie qui n’étaient pas identifiés par observation visuelle. Alors que seulement 1,5 % des poissons prélevés de Kewaunee et Saint-Louis avait des nodules hépatiques visibles (tableau 1), 3,5 % et 4,0 %, respectivement, au microscope indiquait néoplasmes (tableau 2). Une plus grande différence est représentée à Sheboygan (1,6 % visible contre 8,3 % microscopique) et Milwaukee (visible et microscopiques de 15,0 % à 2,5 %). L’examen microscopique permet également une différenciation des tumeurs de la voie biliaire principale contre l’origine de cellules hépatiques (tableau 2) et bénignes et tumeurs malignes.

La santé des poissons sauvages peut être utilisée comme un indicateur de la santé de l’écosystème aquatique. Des évaluations de santé axée sur l’autopsie poisson fournissent une documentation des lésions visibles ou des anomalies, des données utilisées pour calculer les indices de condition ainsi que la possibilité de recueillir des tissus pour évaluation microscopique, l’expression des gènes et autres plus approfondie analyses.

Anthropogenic influences from increased nutrients and chemical contaminants, to habitat alterations and climate change, can have significant effects on ...

L’évaluation de la santé des poissons basée sur l’autopsie est utilisée pour évaluer la santé des poissons sauvages pour la surveillance de routine, des études spécifiques comparant les sites et comme base pour la collecte de tissus pour une analyse plus approfondie. Les poissons sont constamment exposés à une combinaison de facteurs de stress tels que des mélanges complexes de produits chimiques, d’agents pathogènes et de parasites. Ces combinaisons de facteurs de stress peuvent entraîner des effets néfastes tels qu’une résistance réduite aux maladies, le cancer et l’échec de la reproduction.Les techniques démontrées permettent une évaluation standardisée des anomalies visibles et le prélèvement de sang et de tissus pour l’histopathologie, d’otolithes pour l’âge et de tissus pour d’autres analyses en aval. Tout d’abord, nous ferons la démonstration de l’évaluation de routine basée sur la nécropsie avec prélèvement de sang, d’otolithes et de tissus pour l’histopathologie à l’aide d’un poisson. La collecte du rein antérieur pour les tests de la fonction immunitaire et du foie ou d’autres tissus pour l’expression génique sont des ajouts à cette méthode que nous allons également démontrer.Il est important de prélever les tissus le plus rapidement possible pour éviter tout changement post-mortem. Nous avons donc généralement un processus de chaîne de montage avec deux ou trois personnes qui collectent les tissus et quelqu’un qui enregistre les données. Heather Walsh et Cheyenne Smith, doctorantes à l’Université de Virginie-Occidentale, et Ryan Braham, récemment diplômé d’un doctorat, feront la démonstration des différentes étapes du processus.Après avoir recueilli et euthanasié le poisson conformément aux directives de l’établissement, pesez et mesurez le poisson et prélevez un échantillon de sang. Ensuite, mesurez la longueur totale du poisson de l’extrémité du museau à l’extrémité de la queue. Insérez une seringue à trois CC avec une aiguille de calibre 22 ou 23, préalablement recouverte d’héparine, en avant de la région caudale sous la ligne latérale.Inclinez le besoin vers le haut jusqu’à ce qu’il atteigne la colonne vertébrale et retirez-le légèrement pour obtenir un échantillon de sang. Avant de transférer l’échantillon de sang dans un tube de prélèvement, retirez l’aiguille et placez-la dans une corbeille pour objets tranchants. Pour les excursions d’une journée, le sang peut être conservé sur de la glace humide jusqu’à son retour au laboratoire.Ensuite, il est centrifugé pour éliminer le plasma qui a été stocké à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit analysé. Si vous ne retournez pas au laboratoire tous les jours, une centrifugeuse et un stockage de glace sèche sont nécessaires. Ensuite, documentez toute anomalie ou lésion externe sur le corps, les nageoires, les yeux et les branchies du poisson.Inspectez le poisson à la recherche de parasites externes tels que des sangsues, des larves, des kystes métacercariens de trématodes et des parasites branchiaux. Ensuite, utilisez des ciseaux pour ouvrir la cavité abdominale de la région anale à l’opercule. Retirez le lambeau de muscle pour exposer les organes internes.Examinez les organes internes et documentez les décolorations générales et focales, la présence de zones surélevées, de kystes, de parasites et d’anomalies de taille. Ensuite, pour enlever le foie, sectionnez l’artère hépatique et le tissu conjonctif de l’extrémité antérieure. Soulevez doucement le foie de la carcasse et coupez toutes les adhérences et connexions aux intestins et à la graisse adipeuse en prenant soin de ne pas percer la vésicule biliaire.Pesez le foie. Obtenez ensuite l’indice hépatosomatique comme indiqué dans le protocole texte. Ensuite, retirez les gonades et pesez-les.Soigneusement, sans tirer, découpez de petits échantillons de tissus. Placez les échantillons de tissus d’un poisson dans le même récipient. Ensuite, coupez des morceaux d’au moins cinq à quatre millimètres d’épaisseur dans diverses régions du foie et placez-les dans le récipient fixateur.Selon la taille, placez une gonade entière ou des morceaux d’une gonade dans le récipient fixateur. Placez ensuite de petits organes entiers et des morceaux d’autres organes plus gros dans le récipient fixateur. Si des tissus anormaux sont observés, conservez un morceau adjacent supplémentaire de tissu normal.De nombreuses structures telles que des écailles, des rayons de nageoires et des otolithes peuvent être utilisées pour déterminer l’âge des poissons. Ici, nous utilisons des otolithes car ils sont les plus précis. Tout d’abord, coupez à travers l’isthme branchial et pliez la tête vers l’arrière.Ensuite, pour localiser la bulle prootique, abliez les tissus conjonctifs et musculaires autour des parties inférieures du neurocrâne. Utilisez un coupe-os pour fissurer la bulle prootique et exposer les otolithes. Les otolithes doivent être visibles à l’œil nu.Placez les otolithes dans un flacon étiqueté et non bouché et conservez-les à température ambiante jusqu’à ce que l’analyse de l’âge puisse être effectuée. L’exposition à de nombreux produits chimiques et autres facteurs de stress environnementaux peut provoquer une immunosuppression. Les lymphocytes, les macrophages et les granulocytes peuvent être isolés de ce tissu et, en laboratoire, leur capacité à tuer les agents pathogènes, à produire des anticorps, à répondre aux cellules tumorales et à d’autres fonctions peut être mesurée.À l’aide de ciseaux stériles, d’un scalpel et d’une pince, on enlève le tissu rénal antérieur. Placez l’échantillon de rein antérieur dans le milieu approprié pour maintenir les cellules en vie. Utilisez un broyeur de tissus stérile à main pour homogénéiser l’échantillon en suspensions unicellulaires.Et conservez les échantillons sur de la glace humide. Pour la préservation de l’ARN, placez deux à trois petits morceaux de foie dans le conservateur approprié dans un rapport de 10 pour un entre le conservateur et le tissu. Dans le cadre de cette étude, des meuniers noirs ont été prélevés dans trois secteurs préoccupants des Grands Lacs et dans le site de référence de la rivière Kewanee.Le pourcentage de poissons atteints de tumeurs externes variait de 15,5 % dans la zone préoccupante de Saint-Louis à 58 % dans la zone préoccupante de Milwaukee. Plusieurs types de lésions externes ont été observés, notamment des taches blanches discrètes, des lésions mucoïdes légèrement surélevées et de grandes lésions papillomateuses. Bon nombre des taches blanches discrètes et des lésions mucoïdes observées dans cette étude, en particulier au site de référence de Kewanee, étaient des lésions hyperplasiques par opposition à la néoplasie.L’analyse histopathologique a également permis d’identifier des tumeurs hépatiques qui n’étaient pas identifiables par l’observation visuelle. Une fois maîtrisée, cette technique peut se faire en 15 à 20 minutes par poisson si elle est bien exécutée. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de savoir ce qui est normal pour votre espèce particulière et d’être aussi cohérent et précis que possible dans la description des anomalies.Incluez la taille, la couleur, la texture et l’emplacement. Une documentation photographique est utile. Cette technique peut être utilisée pour n’importe quelle espèce de poisson et est utile pour documenter la santé des poissons à la fois spatialement et temporellement afin de mieux comprendre les effets néfastes des facteurs de stress environnementaux et d’identifier les maladies envahissantes.

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