Biodétection optique
Biocapteurs optiques utilisent la lumière pour détecter la liaison d’une molécule cible. Ces capteurs peuvent utiliser une molécule de label, qui prod…
Biocapteurs optiques sont des capteurs qui détectent une cible biologique ou cibles d’intérêt à l’aide de la lumière. Ces dispositifs ont trouvé des applications dans les soins de santé, produits pharmaceutiques, surveillance de l’environnement, Homeland Security et même le champ de bataille. Biocapteurs optiques sont largement divisés en capteurs basée sur des étiquettes et sans étiquette. Un exemple de basée sur des étiquettes de détection est Polymerase Chain Reaction ou PCR, qui utilise des étiquettes fluorescentes ou fluorophores, pour quantifier l’ADN amplifié de cible. Un exemple d’une méthode sans étiquette est Surface Plasmon Resonance ou SPR. Ici, l’interaction de biomolécules inchangée avec la surface du capteur est quantifiée par la mesure de la caractéristique fondamentale de la sonde, comme l’angle de réflexion. Cette vidéo examine les bases de ces types de techniques de biocapteurs optiques et ses composants critiques, les principes de fonctionnement et applications courantes des biocapteurs optiques.
Tout d’abord, penchons-nous sur les principes généraux de biodétection optique basée sur les étiquettes. En règle générale, un élément de sonde ou de bioreconnaissance, comme un anticorps gratuit, est fixé sur la surface du capteur à l’aide de chimie d’immobilisation traditionnels. La solution de l’échantillon est ensuite coulée sur la surface de capteurs. La molécule cible, qui est gratuite à l’élément bioreconnaissance immobilisé, est capturée sélective de la solution échantillon complexe. Puis la solution échantillon excès est éliminée avec un tampon ou de l’eau. Ensuite, afin de visualiser et de quantifier la quantité de la cible liée, une molécule secondaire qui est complémentaire à la cible et attaché à un fluorophore, est transmise par le système. Après un certain temps, quand la liaison de la molécule secondaire à la cible s’est produite, le fluorophore indépendant excès est éliminé. Intensité du fluorophore lié peut ensuite être quantifiée à l’aide d’un microscope à fluorescence. Tout d’abord, cette intensité est tracée pour diverses concentrations cibles connus créer une courbe d’étalonnage, ce qui permet ensuite pour la mesure directe d’une quantité indéterminée de cibles capturées. Ainsi, basée sur des étiquettes techniques utilisent l’intensité de la fluorescence des fluorophores extrêmement sensibles pour mesurer la concentration de la biomolécule d’intérêt.
Maintenant que nous avons passé en revue les principes de biocapteurs optiques basée sur des étiquettes, nous allons jeter un oeil à un exemple couramment utilisé, la norme actuelle pour l’amplification d’ADN, PCR Quantitative ou qPCR. Le mélange réactionnel de qPCR comprend une sonde marquée pour la quantification de la réaction en temps réel. La séquence de la sonde est attachée à la fois journaliste fluorescent et molécules de l’extincteur et se lie à une séquence d’ADN spécifique. La molécule de désactiveur étanche d’émission du fluorophore tandis que deux d'entre eux sont attachés à la sonde. Au cours de la réaction PCR, l’enzyme polymérase dégrade la sonde ADN et sépare physiquement le journaliste fluorophore, empêchant ainsi la trempe et résultant en une augmentation de fluorescence. Pour effectuer le qPCR, tout d’abord ajouter tous les composants de la réaction, y compris les sondes marquées, dans un tube PCR ou bien. Ensuite, placer les puits de la PCR dans un thermocycleur spécialisé et entrer les paramètres pour chaque cycle et le nombre de cycles. Le thermocycleur utilisé pour qPCR comprend une source de lumière avec des composants optiques requis pour sélectionner une longueur d’onde et d’un détecteur pour mesurer l’intensité de la fluorescence en temps réel lors de la réaction PCR. À la fin de chaque cycle thermique, l’intensité de fluorescence en raison des Fluorophores libérés est enregistrée et tracée. L’intensité de fluorescence est directement proportionnelle au logarithme de la concentration cible dans le puits de réaction, et ainsi, pour une fluorescence connue, la concentration cible inconnue peut être calculée.
Maintenant regardons comment de détection peut être réalisé sans les journalistes, comme fluorophores, à l’aide d’étiquette optique sans techniques de télédétection. Pour les techniques de label, l’immobilisation de l’élément bioreconnaissance est identique à la technique basée sur les étiquettes. Tout attachement biomolécule à la surface de ces capteurs modifie l’indice de réfraction dans le voisinage immédiat de l’appareil optique. Les molécules cibles se lient à la surface de l’appareil optique fonctionnalisé formant une couche mince et encore modifier l’indice de réfraction. Ces changements dans l’indice de réfraction peuvent être surveillés par le changement de la fréquence propre de vibration ou la fréquence de résonance du système de suivi. La différence dans les fréquences de résonance avant et après la liaison cible, appelé le passage de f, est directement proportionnelle à la concentration de la cible capturée.
Maintenant nous allons jeter un regard sur les principes de base d’un couramment utilisés étiquette optiques sans détection technique, Surface Plasmon Resonance ou SPR. Un instrument typique de la SPR combine une source laser mobile, un détecteur optique pour la mesure intensité Maj et une puce du capteur avec un prisme de verre revêtu sur une face d’or. Le prisme or recouvert est intégré à un système microfluidique permettant une opération intermédiaire. Dans une expérience, la molécule sonde ou élément de bioreconnaissance, est attaché à la surface d’or. L’élément cible, puis coule sur la surface et se lie à la sonde immobilisée. La télédétection utilise le phénomène de la SPR. Cela se produit lorsque la lumière polarisée est montrée sur la surface du métal, comme l’or, à un angle précis, thêta SPR. Cela se traduit par la génération des plasmons de surface qui sont des oscillations électron cohérente qui existent à l’interface des deux matériaux qui ont des permittivités de signes opposés. Lorsque la masse fixée pour les changements de surface de capteur, la condition de résonance des plasmons de surface est altérée. Par conséquent, lorsque seulement l’élément bioreconnaissance est lié à la surface, le faisceau se trouve à un angle, thêta un. Puis, lorsque plus de masse est attaché à la surface, comme la cible capturée, une réduction de l’intensité de la lumière réfléchie à l’angle spécifique, thêta SPR est observée, comme l’angle de réflexion devient thêta deux. Le changement dans l’intensité de la lumière réfléchie à l’angle de résonance, thêta SPR, est alors une fonction de l’angle de la lumière réfléchie et peut être mesuré par la différence dans les angles, thêta un et theta deux.
Maintenant que nous avons couvert les principes et la procédure derrière les biocapteurs optiques, nous allons voir comment les chercheurs appliquent ces techniques aujourd'hui. Le cytomètre de cellule est un système optique de biodétection qui est couramment utilisé pour le comptage des cellules et une variété de propriétés cellulaires et d’autres composants de mesure. Un échantillon composé de plusieurs types de cellules, chacune avec un fluorophore unique, le tag est préparé dans une suspension. Ensuite, l’échantillon est géré par le cytomètre de flux tels que les cellules lancer passé un faisceau laser, un à la fois. Car chaque cellule traverse le faisceau laser, dispersés et émis fluorescent lumière par les différents fluorophores sont séparément quantifiées, qui donne un dénombrement direct des différents types cellulaires dans l’échantillon. Une autre application des biocapteurs optiques est la détection de bactéries dans des échantillons. Une façon de le faire consiste à utiliser des capteurs de résonateur optique annulaire. Ils sont composés d’une boucle fermée couplée légères d’entrée et de sortie des guides d’ondes. Lorsque la lumière de longueur d’onde résonant est appliqué à la guide d’onde d’entrée, il est passé dans la boucle et une intensité s’accumule au fil de plusieurs allers-retours en raison de l’interférence constructive et est sortie sur le guide d’onde de sortie. Les anticorps spécifiques à des protéines de surface bactériennes sont immobilisés sur la surface du résonateur anneau et un spectre d’absorption de base est obtenu. Puis l’échantillon bactérienne est coulé sur la surface du résonateur permettant la fixation bactérienne au corps immobilisé, suite à un deuxième spectre d’absorption obtenu. Si la bactérie des liaisons d’intérêt, un changement visible dans les pics de résonance est observée, qui est directement proportionnelle à la concentration des bactéries cibles.
Vous avez juste regardé les vidéo de JoVE sur biocapteurs optiques. Nous avons discuté les principes fondamentaux de basée sur les étiquettes et optique sans étiquette de détection ainsi que de deux exemples de ces méthodes et de certaines applications des techniques. Merci de regarder.
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Les biocapteurs optiques sont des capteurs qui détectent une ou plusieurs cibles biologiques d’intérêt à l’aide de la lumière. Ces appareils ont trouvé des applications dans les domaines de la santé, des produits pharmaceutiques, de la surveillance de l’environnement, de la sécurité intérieure et même du champ de bataille. Les biocapteurs optiques sont divisés en deux catégories : capteurs avec ou sans marquage. Un exemple de détection basée sur le marquage est la réaction en chaîne par polymérase, ou PCR, qui utilise des marqueurs fluorescents, ou fluorophores, pour quantifier l’ADN cible amplifié. Un exemple de méthode sans marquage est la résonance plasmonique de surface, ou SPR. Ici, l’interaction non altérée des biomolécules avec la surface du capteur est quantifiée en mesurant une caractéristique fondamentale du capteur, comme l’angle de réflexion. Cette vidéo passe en revue les bases de ces deux types de techniques de biodétection optique et leurs composants critiques, les principes de fonctionnement et les applications courantes des biocapteurs optiques.
Tout d’abord, examinons les principes généraux de la biodétection optique basée sur le marquage. En règle générale, une sonde ou un élément de bioreconnaissance, comme un anticorps complémentaire, est fixé à la surface du capteur à l’aide de la chimie d’immobilisation traditionnelle. La solution d’échantillon est ensuite écoulée sur la surface des capteurs. La molécule cible, qui est complémentaire à l’élément de bioreconnaissance immobilisé, est capturée de manière sélective à partir de la solution d’échantillon complexe. Ensuite, l’excès de solution d’échantillon est lavé avec un tampon ou de l’eau. Ensuite, pour aider à visualiser et à quantifier la quantité de cible liée, une molécule secondaire complémentaire à la cible et attachée à un fluorophore circule dans le système. Après un certain temps, lorsque la liaison de la molécule secondaire à la cible s’est produite, l’excès de fluorophore non lié est emporté. L’intensité du fluorophore lié peut ensuite être quantifiée à l’aide d’un microscope fluorescent. Cette intensité est d’abord tracée pour diverses concentrations cibles connues afin de créer une courbe d’étalonnage, qui permet ensuite de mesurer directement une quantité inconnue de cible capturée. Ainsi, les techniques basées sur le marquage utilisent l’intensité de fluorescence de fluorophores extrêmement sensibles pour quantifier la concentration de la biomolécule d’intérêt.
Maintenant que nous avons passé en revue les principes des biocapteurs optiques basés sur des marquages, jetons un coup d’œil à un exemple couramment utilisé, la norme actuelle pour l’amplification de l’ADN, la PCR quantitative ou qPCR. Le mélange réactionnel qPCR comprend une sonde marquée pour la quantification de la réaction en temps réel. La séquence de la sonde est attachée à la fois aux molécules rapporteures fluorescentes et aux molécules d’extinction, et se lie à une séquence d’ADN spécifique. La molécule d’extinction éteint l’émission du fluorophore pendant que les deux sont attachés à la sonde. Au cours de la réaction PCR, l’enzyme polymérase dégrade l’ADN de la sonde et sépare physiquement le rapporteur fluorophore, empêchant ainsi l’extinction et entraînant une augmentation de la fluorescence. Pour effectuer une qPCR, ajoutez d’abord tous les composants de la réaction, y compris les sondes marquées, dans un tube ou un puits de PCR. Ensuite, placez les puits PCR dans un thermocycleur spécialisé et entrez les paramètres de chaque cycle et le nombre de cycles. Le thermocycleur utilisé pour la qPCR comprend une source lumineuse avec les composants optiques nécessaires pour sélectionner une longueur d’onde et un détecteur pour mesurer l’intensité de la fluorescence en temps réel pendant la réaction PCR. À la fin de chaque cycle thermique, l’intensité fluorescente due aux fluorophores libérés est enregistrée et tracée. L’intensité de la fluorescence est directement proportionnelle au logarithme de la concentration cible dans le puits de réaction, et donc, pour une fluorescence connue, la concentration cible inconnue peut être calculée.
Voyons maintenant comment la détection peut être réalisée sans aucun rapporteur, comme les fluorophores, en utilisant des techniques de détection optique sans marquage. Pour les techniques sans marquage, l’immobilisation de l’élément de bioreconnaissance est la même que la technique basée sur le marquage. Toute fixation de biomolécule à la surface de ces capteurs modifie l’indice de réfraction à proximité immédiate du dispositif optique. Les molécules cibles se lient à la surface du dispositif optique fonctionnalisé, formant une fine couche et modifiant davantage l’indice de réfraction. Ces changements d’indice de réfraction peuvent être surveillés en suivant le changement de la fréquence propre des vibrations ou de la fréquence de résonance du système. La différence entre les fréquences de résonance avant et après la liaison de la cible, appelée décalage f, est directement proportionnelle à la concentration de la cible capturée.
Jetons maintenant un coup d’œil aux principes de base d’une technique de détection optique sans marquage couramment utilisée, la résonance plasmonique de surface, ou SPR. Un instrument SPR typique combine une source laser mobile, un détecteur optique pour mesurer le décalage d’intensité et une puce de capteur avec un prisme en verre recouvert d’or sur une face. Le prisme recouvert d’or est intégré à un système fluidique permettant un fonctionnement en flux continu. Dans une expérience, la molécule de sonde, ou élément de bioreconnaissance, est fixée à la surface de l’or. L’élément cible s’écoule alors sur la surface et se lie à la sonde immobilisée. La détection utilise le phénomène SPR. Cela se produit lorsque la lumière polarisée est affichée à la surface du métal, comme l’or, à un angle spécifique, thêta SPR. Cela se traduit par la génération de plasmons de surface qui sont des oscillations électroniques cohérentes qui existent à l’interface de deux matériaux qui ont des permittivités de signes opposés. Lorsque la masse attachée à la surface du capteur change, la condition de résonance des plasmons de surface est modifiée. Par conséquent, lorsque seul l’élément de bioreconnaissance est lié à la surface, le faisceau est réfléchi selon un angle, thêta un. Ensuite, lorsque plus de masse est attachée à la surface, comme la cible capturée, une réduction de l’intensité de la lumière réfléchie à l’angle spécifique, thêta SPR est observée, car l’angle de réflexion passe à thêta deux. La variation de l’intensité de la lumière réfléchie à l’angle de résonance, thêta SPR, est alors fonction de l’angle de la lumière réfléchie, et peut être mesurée comme la différence d’angles, thêta un et thêta deux.
Maintenant que nous avons couvert les principes et la procédure derrière les biocapteurs optiques, voyons comment les chercheurs appliquent ces techniques aujourd’hui. Le cytomètre à cellules en flux est un système de biodétection optique couramment utilisé pour compter les cellules et mesurer une variété d’autres propriétés et composants cellulaires. Un échantillon composé de plusieurs types de cellules, chacun marqué d’un fluorophore unique, est préparé dans une suspension. Ensuite, l’échantillon est passé dans le cytomètre en flux de sorte que les cellules passent devant un faisceau laser une par une. Au fur et à mesure que chaque cellule passe à travers le faisceau laser, la lumière fluorescente diffusée et émise par les différents fluorophores est quantifiée séparément, ce qui donne un comptage direct des différents types de cellules dans l’échantillon. Une autre application des biocapteurs optiques est la détection de bactéries dans les échantillons. Une façon de le faire est d’utiliser des capteurs à résonateur en anneau optique. Ils sont composés d’une boucle fermée couplée à des guides d’ondes d’entrée et de sortie de lumière. Lorsqu’une lumière de longueur d’onde résonnante est appliquée au guide d’ondes d’entrée, elle passe à travers la boucle et accumule une intensité sur plusieurs allers-retours en raison d’interférences constructives et est émise vers le guide d’ondes de sortie. Des anticorps spécifiques aux protéines bactériennes de surface sont immobilisés à la surface du résonateur annulaire et un spectre d’absorption de base est obtenu. Ensuite, l’échantillon bactérien est acheminé sur la surface du résonateur pour permettre la liaison bactérienne au corps immobilisé, après quoi un deuxième spectre d’absorption est obtenu. Si la bactérie d’intérêt se lie, un décalage visible des pics de résonance est observé, qui est directement proportionnel à la concentration de la bactérie cible.
Vous venez de regarder la vidéo de JoVE sur la biodétection optique. Nous avons discuté des principes de base de la détection optique basée sur et sans marquage, ainsi que de deux exemples marquants de ces méthodes et de certaines applications de ces techniques. Merci d’avoir regardé.
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Q1: What is the difference between label-based and label-free optical biosensors?
Label-based biosensors use fluorescent molecules called fluorophores attached to secondary probes to generate measurable signals, such as in quantitative PCR. Label-free biosensors detect binding by monitoring changes in optical properties like refractive index without adding reporter molecules. Both approaches immobilize biorecognition elements on sensor surfaces but differ in how they quantify target binding. Optical and electrochemical biosensors represent complementary detection strategies in modern bioanalysis.
Q2: How does quantitative PCR use fluorescence to measure DNA concentration?
In qPCR, a labeled probe contains both a fluorescent reporter and a quencher molecule that suppresses fluorescence when attached. During PCR amplification, the polymerase degrades the probe, separating the fluorophore from the quencher and releasing fluorescence. The thermocycler measures fluorescent intensity in real time at each cycle, which is directly proportional to the logarithm of target DNA concentration.
Q3: What role does the biorecognition element play in optical biosensing?
The biorecognition element, such as a complementary antibody, is immobilized on the sensor surface using chemical attachment methods. It selectively captures target molecules from complex sample solutions based on molecular specificity. This immobilized probe forms the foundation for both label-based and label-free detection methods by enabling selective binding of targets.
Q4: How does Surface Plasmon Resonance detect target binding without labels?
SPR uses polarized light directed at a gold-coated prism at a specific angle to generate surface plasmons, which are coherent electron oscillations at the metal interface. When target molecules bind to immobilized probes on the gold surface, the mass changes alter the resonance condition. This shifts the angle of reflected light, and the change in reflection intensity at the resonance angle is measured and quantified.
Q5: What is a calibration curve and why is it important in label-based biosensing?
A calibration curve is created by plotting fluorescent intensity measurements against known target concentrations. This curve establishes the relationship between fluorescence signal and target concentration. Once established, the calibration curve allows researchers to determine unknown target concentrations by measuring the fluorescent intensity of unknown samples and referencing the curve.
Q6: How does flow cytometry use optical biosensing to identify cell types?
Flow cytometry prepares cell samples with each cell type tagged with a unique fluorophore. Cells flow past a laser beam one at a time, and scattered and emitted fluorescent light from different fluorophores are separately quantified. This direct measurement provides accurate counts of various cell types in the sample based on their distinct fluorescent signatures.
Q7: How do optical ring resonators detect bacteria in samples?
Optical ring resonators consist of a closed loop coupled to input and output waveguides. Antibodies specific to bacterial surface proteins are immobilized on the resonator surface. When bacterial samples flow over the surface and bind to antibodies, the resonant peaks shift visibly. This shift is directly proportional to bacterial concentration, enabling sensitive detection and quantification.