Génération et sur demande d’Initiation dactivité Ictal aiguë de rongeurs et de tissus humains

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans l’étude des mécanismes de saisie, tels que, quelles sous-populations neurales sont responsables de l’apparition et de l’arrêt électrographiques de saisie. Le principal avantage de cette technique, c’est qu’elle peut reproduire des crises électrographiques, sur demande, et des modèles in vivo et in vitro qui rappellent ceux observés cliniquement. Cette technique peut également être utilisée pour rechercher des thérapies anti-saisie potentielles, en essayant de déclencher des événements électrographiques de saisie pendant l’application de différents candidats de drogue anti-saisie.

Pour préparer les tranches corticales, collez le tissu cérébral préclinique sur le stade vibratome, à l’aide de colle adhésive instantanée. Placez délicatement le support de specimine dans le plateau tampon. Assurez-vous que la partie dorsale du cerveau est face à la lame du Vibratome.

Couper le cerveau en sections de 450 micromètres d’épaisseur, dans la direction dorsale à ventrale. Faire la première coupe dans le cerveau préclinique animal pour enlever l’ampoule olfactive. Ensuite, faites des coupures ultérieures jusqu’à ce que la zone du moteur somatosensory soit observée.

Utilisez une pipette à alésage large. Transférer les tranches coronal ciblées dans une boîte de Pétrie contenant une solution de dissection froide. Pour les tranches coronale, faire une coupe transversale juste en dessous de la commissure néo corticale, puis, couper à la ligne médiane pour séparer les hémisphères.

Ensuite, utilisez une nouvelle lame de rasoir pour couper tout excès de tissu des tranches. Il est essentiel d’effectuer la procédure de découpage du cerveau efficacement. Chaque instant, le tissu cérébral n’est pas immergé dans l’ACSF, est préjudiciable à sa qualité.

Les tissus cérébraux endommagés et de mauvaise qualité sont moins susceptibles de générer des crises électrographiques. Transférer la partie dorsale des tranches coronale, qui contiennent le cortex néo, dans une deuxième boîte de Pétrie remplie de 35 degrés Celsius ACSF, pendant un moment. Ensuite, transférez rapidement les tranches dans une chambre d’incubation, contenant 35 degrés Celsius carbogenated ACSF.

Laissez les tranches de cerveau légèrement immergées dans la chambre d’incubation à 35 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, retirez la chambre d’incubation du bain d’eau et laissez-la revenir à la température ambiante. Attendez une heure que les tranches de cerveau se rétablissent, avant d’effectuer des enregistrements électrophysiologiques.

Dans cette procédure, découpez le papier de lentille qui est légèrement plus grand que la tranche de cerveau. Utilisez une pipette à alésage large ou une brosse détaillante pour transférer une tranche de cerveau sur le papier de lentille découpé qui est maintenu en place à l’aide d’une pince dentaire. Ensuite, transférez le papier de lentille avec une tranche de cerveau à la chambre d’enregistrement, et fixez-le en position avec un écran de harpe.

Par la suite, profuse la tranche de cerveau dans la chambre d’enregistrement avec ACSF carbogenated à 35 degrés Celsius à une vitesse de trois millilitres par minute. Utilisez un thermomètre numérique pour vous assurer que la chambre d’enregistrement est de 33 à 36 degrés Celsius. Ensuite, remplissez les électrodes de verre avec 10 microlitres d’ACSF, à l’aide d’une seringue Hamilton.

Sous le stéréomicroscope 20 fois, guider l’électrode de verre d’enregistrement dans la couche corticale superficielle, deux, trois, à l’aide de manipulateurs manuels. Visualisez l’activité électrique de la tranche cérébrale avec un logiciel standard. Pour induire des activités électrographiques de saisie-comme, profuse la tranche de cerveau avec ACSF contenant 4-AP à 100 micromolar.

Visualisez l’activité électrique de la tranche cérébrale avec un logiciel standard. Pour générer des crises électrographiques, en utilisant une stratégie optogénétique sur les tranches de cerveau à partir de souris optogénétiques, utilisez un manipulateur manuel pour positionner une fibre optique de 1000 microns de diamètre de cordon directement au-dessus de la région d’enregistrement. Appliquez une brève impulsion de lumière bleue pour initier un événement ictal.

Un programme matlab convivial a été spécifiquement développé pour détecter et classer les différents types d’événements épileptiformes qui se produisent dans les modèles de saisie in vitro et in vivo 4-AP. Ce programme de détection est disponible auprès du référentiel Valiante Labs GitHub. L’application de 100 micromolaires 4-AP à la bonne qualité 450 micron-taille tranches de cerveau cortical d’une souris juvénile VGAT channelrhodopsin, de manière fiable induit des événements récurrents ictal-like dans les 15 minutes.

L’application de 100 micromolaires 4-AP à des tranches de mauvaise qualité, a entraîné des événements d’éclatement ou d’activité de spiking. En moyenne, 40 % des tranches de chaque cerveau préclinique disséqué ont généré avec succès des événements similaires à des ticaux. En outre, 83% des souris disséquées ont eu comme conséquence au moins une tranche de cerveau qui a produit avec succès des événements ictal-like.

Dans les tranches de cerveau avec des événements ictaux spontanément se produisant, l’application d’une brève impulsion lumineuse de 30 millisecondes sur la tranche de cerveau, a déclenché de manière fiable un événement ictal-comme qui était identique dans la morphologie. Les mêmes résultats ont été faits dans des tranches de cerveau de Ta channelrhodopsin deux souris. Ainsi, indépendamment de quelle sous-population neuronale a été activée, n’importe quel événement de synchronisation bref dans le réseau neuronal cortical isolé, a mené au début d’un événement ictal-comme.

Ces événements ticaux étaient composés d’un pic sentinelle, de tirs toniques, de tirs cloniques et d’une activité en rafale vers la fin. Ils étaient semblables dans la nature aux signatures électrographiques liées aux saisies cliniques. Après cette procédure, d’autres types de transitions de l’état du cerveau peuvent être effectuées pour répondre à des questions comme, quels sont les mécanismes neuro biologiques sous-jacents transitions de l’état du cerveau?

Et comment pouvons-nous réguler ces transitions pour empêcher l’entrée dans divers états pathologiques du cerveau?