Name: Un dosage de Gradient de température pour déterminer les préférences thermiques de larves de drosophile (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Découvrez un dosage de gradient thermique continu pour déterminer les préférences de température des larves de Drosophila melanogaster. Cette méthode robuste permet d'évaluer la somesthésie et les comportements thermiques en neurosciences.

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<ol><li>Fowler, M. A., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+TRP+channels+and+animal+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Drosophila TRP channels and animal behavior.</a> Life Sci. 92, 394-403 (2013).</li>
<li>Palkar, R., Lippoldt, E. K., McKemy, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+and+cellular+basis+of+thermosensation+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The molecular and cellular basis of thermosensation in mammals.</a> Curr Opin Neurobiol. 34, 14-19 (2015).</li>
<li>Vriens, J., Nilius, B., Voets, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+thermosensation+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Peripheral thermosensation in mammals.</a> Nat Rev Neurosci. 15 (9), 573-589 (2014).</li>
<li>Rosenzweig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+ortholog+of+vertebrate+TRPA1+regulates+thermotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The Drosophila ortholog of vertebrate TRPA1 regulates thermotaxis.</a> Genes Dev. 19, 419-424 (2005).</li>
<li>Kwon, Y., Shim, H. S., Wang, X., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+thermotactic+behavior+via+coupling+of+a+TRP+channel+to+a+phospholipase+C+signaling+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Control of thermotactic behavior via coupling of a TRP channel to a phospholipase C signaling cascade.</a> Nat Neurosci. 11, 871-873 (2008).</li>
<li>Kwon, Y., Shen, W. L., Shim, H. S., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+thermotactic+discrimination+between+the+optimal+and+slightly+cooler+temperatures+via+a+TRPV+channel+in+chordotonal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fine thermotactic discrimination between the optimal and slightly cooler temperatures via a TRPV channel in chordotonal neurons.</a> J Neurosci. 30 (31), 10465-10471 (2010).</li>
<li>Shen, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+rhodopsin+in+temperature+discrimination+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Function of rhodopsin in temperature discrimination in Drosophila.</a> Science. 331 (6022), 1333-1336 (2011).</li>
<li>Sokabe, T., Chen, H. S., Luo, J., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+switch+in+thermal+preference+in+Drosophila+larvae+depends+on+multiple+rhodopsins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A switch in thermal preference in Drosophila larvae depends on multiple rhodopsins.</a> Cell Rep. 17, 336-344 (2016).</li>
<li>Ni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ionotropic+Receptors+IR21a+and+IR25a+mediate+cool+sensing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">The Ionotropic Receptors IR21a and IR25a mediate cool sensing in Drosophila.</a> Elife. 5, 13254(2016).</li>
<li>Luo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Navigational+decision+making+in+Drosophila+thermotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Navigational decision making in Drosophila thermotaxis.</a> J Neurosci. 30 (12), 4261-4272 (2010).</li>
<li>Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Drosophila%3A+a+laboratory+handbook%22">Drosophila: a laboratory handbook</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Pour assurer le succès de ce protocole, il est important de prendre des mesures pour obtenir un nombre suffisant de larves à réaliser les expériences. Il s’agit d’alimentation avant les mouches en flacons pâte contenant de la levure pendant 2-3 jours afin d’améliorer la ponte. Les flacons doivent être placés dans un bac contenant des flacons d’eau et enfermé dans un sac en plastique transparent, qui maintient l’humidité de l’aliment et favorise les efficaces les larves tout en permettant une exposition à des cycles norma...

Thermotactisme est employé par des animaux mobiles pour sélectionner un environnement le plus favorable des conditions1,2,3. Si le climat est trop chaud ou froid, ce comportement est vital pour la survie. En outre, beaucoup d’animaux est sensibles aux très petites différences de température dans la gamme confortable et cherche un cadre avec une température idéale. Ceci est particulièrement important pour les organismes poïkilothermes tels que les mouches des fruits, qui équilibrer la température de leur corps avec l’environnement. Dosages pour surveiller les larve thermotactisme ont contribué à identifier et à clarifier les rôles de capteurs moléculaires comme Drosophila transitoire récepteurs potentiels (TRP) canaux4,5,6, rhodopsines7,8et ionotropiques récepteurs récepteurs (IRs)9, qui empreignent ces animaux avec des sensibilités de température sur différentes plages de températures.
Un test bilatéral choix fournit une approche pour étudier les préférences thermiques en larves6,7. Le test implique l’établissement de deux zones de températures distinctes et permet les animaux sélectionner un côté sur l’autre. Les résultats de tests à choix bidirectionnelle peuvent être robustes, surtout si les différences de température entre les deux options sont grandes. En outre, puisque chaque essai implique tabulating seulement deux groupes, les données peuvent être exprimées comme un indice simple de préférence. La facilité et la simplicité des tests de choix bidirectionnelle se prêtent également aux écrans de génétiques. Toutefois, une limitation majeure est que beaucoup d’expériences est tenus d’établir la température préférée des animaux sauvage ou mutants.
Un test de gradient offre la possibilité d’établir la température préférée en un seul essai8. De plus, contrairement à l’épreuve de choix bidirectionnelle, il permet l’évaluation de la distribution d’un groupe d’animaux, lorsqu’ils sont confrontés avec une gamme continue de températures. Un dosage dégradé utilise une boîte de Pétri et animaux et est bien adapté pour caractériser le comportement détaillé de chaque animal10. Toutefois, étant donné que les boîtes de Pétri sont ronds, les tailles des zones thermiques varient et sont progressivement plus petites selon la distance du centre. Par conséquent, cette configuration n’est pas idéale pour surveiller les sélections de température des populations d’animaux.
Un appareil de gradient thermique continu bien adaptée pour évaluer les préférences de température des groupes de larves emploie une arène rectangulaire et est décrite ici. L’appareil est simple à construire et à assembler. En outre, le gradient est linéaire et est flexible, car il peut être utilisé pour évaluer la thermotactisme plus grande température varie de 10 ° C à 42 ° C. Le test est rapide et simple à réaliser et donne des données reproductibles. En plus de signaler la température favorable des larves, il révèle les préférences de la population d’animaux sur un ensemble linéaire dans une expérience simple. En raison de ces avantages, c’est un excellent choix pour l’identification des gènes nécessaires à thermotactisme.

<table><tbody><tr><td>Appareil de dosage à gradient</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PolyScience 9106, Bain de circulation réfrigéré/chauffé 6L</td><td>Thomas Scientific</td><td>9106</td><td>Ce modèle n’est plus fabriqué. Les modèles de remplacement mis à jour incluent : 1186R00 et 1197U04 pour 120 V, 60 Hz, ou 1184L08 et 1197U04 pour 240 V, 50 Hz.</td></tr><tr><td>Plaque de dosage en aluminium (pour gradient unidirectionnel)</td><td></td><td></td><td>Taille extérieure : 14 x 10,1 x 0,9 cm, taille intérieure : 12,9 x 8,7 x 0,8 cm, anodisée noire.</td></tr><tr><td>Plaque en aluminium (pour gradient bidirectionnel)</td><td></td><td></td><td>25 x 22 x 0,2 cm, anodisée noire.</td></tr><tr>Bloc <td></td><td></td><td>d’aluminium Dimensions extérieures : 25,5 x 5 x 1,4 cm, les paramètres des canaux intérieurs sont illustrés à la figure 1D.</td><td></td></tr><tr><td>Connecteur pour blocs et tubes en aluminium</td><td>McMaster-Carr</td><td>91355K82</td><td></td></tr><tr><td>Tubes sanitaires en silicone Tygon</td><td>Tygon</td><td>57296</td><td>1/4 » ID x 3/8 » OD x 1/16 » mur</td></tr><tr><td>Nom</strong</td><td>>Entreprise<</td><td>>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Items et réactifs pour </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pestle</td><td>USA Scientific</td><td>17361</td><td>Pilon pour tubes de microcentrifugation de 1,5 mL</td></tr><tr><td>Thermomètre</td><td>Fluke</td><td>51II</td><td></td></tr><tr><td>Thermocouple</td><td>Fluke</td><td>K type</td><td></td></tr><tr><td>Couvercle universel pour microplaques</td><td>Corning</td><td>6980A77</td><td></td></tr><tr><td>Plat de 35 mm</td><td>Corning</td><td>9380D40</td><td></td></tr><tr><td>Ruban d’étiquetage (pour gradient bidirectionnel)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-951</td><td>Ruban d’étiquetage Fisherbrand 2 po x 14 yds</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td>Préparer une solution à 1 %</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma</td><td>S0389-5KG</td><td>Préparer une solution à 18 % juste avant de commencer le test</td></tr><tr><td>Pinceau Fisher</td><td>Scientific</td><td>11860</td><td></td></tr><tr><td>Tubes</td> <td>à centrifuger de 50 mLDenville</td><td>C1062-P</td><td></td></tr><tr><td>Scoopula</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-357Q</td><td></td></tr><tr><td>500 mL Flacon rond à col large</td><td>Pyrex</td><td>1395-500</td><td></td></tr><tr><td>Passoire à cellules (pore de 300 mm)</td><td>PluriSelect</td><td>43-50300</td><td>Optionnel pour le lavage des larves</td></tr><tr><td>Boîte en carton (plateau de flacons)</td><td>Genesee Scientific</td><td>FS32-124</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Drosophila food</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eau</td><td></td><td></td> distillée <td>22 400 mL</td></tr><tr><td>Semoule de maïs, jaune (à mailles extra fines, floquée) 20 kg</td><td>LabScientific Inc.</td><td>NC0535320</td><td>1 609 g</td></tr><tr><td>de levure de bière 100 lb</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN90331280</td><td>379 g</td></tr><tr><td>NutriSoy® ; Farine de soja (10 kg/unité)</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-115</td><td>221 g</td></tr><tr><td>Drosophila Agar, type II (5 kg)</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-103</td><td>190 g</td></tr><tr><td>Karo sirop de maïs léger</td><td>Karo</td><td></td><td>1 700 mL</td></tr><tr><td>4-hydroxybenzoate de méthyle (en suspension dans de l’éthanol à 200 degrés)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H5501-5KG</td><td>72 g/240 mL</td></tr><tr><td>Purée d’acide propionique. p.a.,>99,5 % (GC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81910-1 L</td><td>108 mL</td></tr><tr><td>Acide phosphorique&nbsp ; réactif ACS, &ge ; 85 % en poids dans H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>438081-500 mL</td><td>8,5 mL</td></tr></tbody></table>

un dosage de gradient de température pour déterminer les préférences thermiques de larves de drosophile

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

Beaucoup d’animaux, y compris la drosophile, Drosophila melanogaster, est capables de discriminant les plus infimes différences dans la température ambiante, ce qui leur permet de tenter de découvrir leur paysage thermique préféré. Pour définir les préférences de température des larves sur une plage linéaire définie, nous avons développé une méthode utilisant un gradient de température. Pour établir un gradient directionnel unique, deux blocs d’aluminium sont connectés à des bains d’eau indépendants, dont chacun contrôle la température des blocs individuels. Les deux blocs défini les limites inférieures et supérieures du dégradé. Le gradient de température est établi en plaçant une plaque en aluminium enduit de gel d’agarose sur les deux blocs d’eau contrôlé afin que la plaque couvre la distance entre eux. Les extrémités de la plaque d’aluminium qui est définie sur le dessus des blocs d’eau définit les températures minimales et maximales, et les régions entre les deux blocs forment un dégradé linéaire de la température. Le test de gradient peut être appliqué à des larves de différents âges et peut être utilisé pour identifier des mutants qui présentent des phénotypes, comme ceux présentant des mutations affectant les gènes codant pour des canaux TRP et opsines, qui sont nécessaires pour la discrimination de température.

Afin d’établir une unique bidirectionnel de 18 ° C à 28 ° C dégradé, nous avons mis les températures des deux bains d’eau de 16,8 ° C et 31 ° C. On obtient les températures à 13 points en mesurant la température à 26 postes dans les parties supérieures et inférieures de 6 toutes les zones, les lignes de frontière entre les zones et les extrémités de la surface du gel d’agarose (Figure 2, 2E). La distribution de la température le long du gradi...

Nous présentons ici un protocole pour déterminer la température environnementale préférée des larves de drosophile à l’aide d’un gradient thermique continu.

Un dosage de Gradient de température pour déterminer les préférences thermiques de larves de drosophile

Many animals, including the fruit fly, Drosophila melanogaster, are capable of discriminating minute differences in&#160;environmental temperature, which ...

Cette méthode peut être utilisée pour répondre à une question clé dans le domaine de la somatosensation, le mécanisme par lequel un animal, comme la drosophila melanogaster, sélectionne sa température environnementale préférée. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’établir la température préférée du groupe de larves en un seul essai lorsqu’elle est confrontée à une gamme continue de températures. En plus de donner un aperçu des préférences de température des larves de drosophile, la plaque impress peut également être adaptée pour être utilisée avec d’autres organismes modèles tels que le ver C elegans.Tout d’abord, faites de la pâte de levure pour préparer des flacons pour un croisement. Mélangez des granulés de levure dans de l’eau distillée et broyez-les en une pâte avec un pilon. Ensuite, ajoutez une noisette de pâte de levure près des parois internes des flacons de drosophile standard juste au-dessus de la surface de l’aliment.Pour produire les larves, prélevez 12 à 35 femelles et jusqu’à la moitié du nombre de mâles, mais pas plus de 10 mâles. Combinez ces groupes dans le flacon contenant de la pâte de levure. Chargez les flacons préparés dans un plateau de 100 flacons.Incluez 20 flacons ouverts remplis d’eau dans le bac pour fournir de l’humidité. Ensuite, scellez le plateau dans un sac en plastique transparent et incubez-le à 25 degrés Celsius pendant 48 heures. Après 48 heures d’alimentation et d’accouplement, transférez les mouches dans de nouveaux flacons de nourriture pour recueillir les œufs.Appuyez dessus. N’utilisez pas de dioxyde de carbone. Ensuite, laissez les mouches pondre des œufs pendant trois heures à 25 degrés Celsius.Plus tard, retirez les adultes et remettez les flacons contenant les œufs dans le bac avec des flacons d’eau et fermez le sac. Ensuite, développez les œufs à 25 degrés Celsius jusqu’au stade larvaire souhaité. Pour préparer un gradient directionnel unique, créez d’abord un environnement ambiant humain pour le test.Placez deux blocs d’aluminium reliés à des bains-marie séparés sur des serviettes en papier humides, à 10 centimètres de distance. Les bains-marie doivent être réchauffés à l’avance. Ensuite, préparez 100 millilitres d’agarose à 1 % et ajoutez 25 millilitres à chaque plaque de dosage sur une surface plane.Une fois que l’agarose s’est solidifiée, frottez doucement la surface avec une éponge de mélamine pour rendre la surface légèrement grossière. Ensuite, pour favoriser un transfert de température efficace, remplissez tous les espaces entre les blocs d’aluminium dans les plaques de dosage avec de l’eau fournie par un flacon pulvérisateur. Maintenant, placez les plaques de test sur les blocs d’aluminium et assurez-vous que les démarcations sont à deux centimètres de chaque bord pour correspondre exactement aux bords des blocs d’aluminium.Ensuite, vaporisez un film d’eau sur la surface des plaques afin que les gels ne se dessèchent pas. Ensuite, couvrez le système avec une boîte en carton pour réduire l’évaporation et aider à stabiliser la température de la surface du gel. Attendez cinq à 10 minutes pour permettre à la température de s’équilibrer.Ensuite, vérifiez la température de surface sur la plaque à au moins 12 endroits pour vous assurer qu’il y a une température uniforme partout, à deux degrés Celsius près. Replacez ensuite le couvercle de la boîte jusqu’à ce que le test soit effectué. Pour isoler les larves propres, ajoutez d’abord environ 40 millilitres de solution de saccharose à 18 % dans un tube à essai de 50 millilitres.Transférez ensuite les larves des tas de nourriture dans la solution, à l’aide d’une cuillère. Ensuite, mélangez soigneusement les larves dans la solution, à l’aide de la cuillère. Maintenant, attendez 30 à 60 secondes pour que les larves flottent vers la couche supérieure du tube.Versez ensuite la solution avec les larves dans un autre tube de 50 millilitres et complétez-le avec du saccharose frais à 18 %. Encore une fois, attendez que les larves flottent. La présence de nourriture peut influencer les résultats.Par conséquent, afin d’obtenir des résultats reproductibles, il est important de bien nettoyer les larves afin de minimiser la contamination par la nourriture. Faites-le doucement, pour éviter d’endommager les larves. Ensuite, placez une passoire à cellules de 300 microns sur un tube de 50 millilitres, puis retirez tous les corps adultes morts et les débris flottants de la surface de la solution de saccharose.Maintenant, versez les larves à travers la passoire pour les recueillir sur le tamis à mailles. Ensuite, faites passer environ 50 millilitres d’eau dans la passoire deux fois pour nettoyer davantage les larves. Ensuite, dans un plat vide de 35 millimètres, rincez la plupart des larves de la passoire à l’eau.À l’aide d’un pinceau, transférez les larves restantes sur le grillage. Ensuite, siphonnez la majeure partie de l’eau du plat à l’aide d’une micro-pipette. Placez ensuite le couvercle sur le plat à l’envers pour que les larves ne puissent pas s’échapper.Maintenant, laissez les larves récupérer pendant 10 à 20 minutes avant de commencer le test. Tout d’abord, retirez la boîte en carton sur le gel et vérifiez rapidement la température de surface du gel. Si la surface est sèche, vaporisez une petite quantité d’eau sur la surface.Si le gel est bon, chargez 100 à 200 larves au centre de chaque plaque, à l’aide d’un petit pinceau. Ensuite, placez un couvercle sur chaque plaque de test pour piéger les larves et couvrez l’installation avec une boîte en carton pour éviter l’exposition à la lumière. Le test est maintenant en cours.Au bout de 10 à 30 minutes, retirez la boîte en carton et le couvercle de la microplaque. Ensuite, photographiez les plaques d’en haut pour enregistrer la position des larves. Placez la boîte au-dessus de l’appareil photo pour éviter les reflets sur la surface du gel.Pour nettoyer la plaque, aspirez toutes les larves là où elles se sont dispersées. Maintenant, calculez la distribution en pourcentage des larves dans chaque zone, à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images. Faites des lignes tous les deux centimètres, en fonction des démarcations sur la plaque d’essai, et comptez le nombre de larves dans chaque zone.Lors du comptage, ignorez les larves réparties en crêtes à 0,5 centimètre de chaque bord, car l’épaisseur du gel et les conditions de température ne sont pas uniformes près du bord. Entre 18 et 28 degrés Celsius, une pente unidirectionnelle a été réalisée à l’aide de bains-marie réglés à 16,8 degrés Celsius et 31 degrés Celsius. La distribution de la température le long du gradient s’est avérée presque linéaire.Les larves témoins ont été analysées à différents âges. Les larves du premier, du deuxième et du début du troisième stade ont montré des préférences maximales pour la zone de 24 degrés Celsius. Au milieu du troisième stade, la plupart des larves se sont accumulées dans la zone de 18 degrés Celsius.Les larves non errantes de la fin du troisième stade étaient étroitement regroupées dans la zone de 18 degrés Celsius. La propension à s’accumuler dans la zone de 18 degrés Celsius dans la souche témoin, qui était White 1118, n’était pas due à un effet de bord, puisque les larves du troisième stade s’accumulaient encore dans la zone de 18 degrés Celsius, en utilisant un gradient bidirectionnel. Lorsque nous avons analysé les mutations des larves du tiers dernier stade requises pour discriminer la température, les résultats ont changé.Les larves avec une mutation nulle dans trpA1 sont réparties uniformément sur l’ensemble du gradient de 18 degrés Celsius à 28 degrés Celsius. Les larves auxquelles il ne manquait que les isoformes A et B ou les isoformes C et D de trpA1 présentaient également de graves déficiences. Des larves présentant une mutation dans l’un des deux gènes codant pour la phospholipase c bêta, norpA, ont également été perturbées.Cependant, les larves présentant une mutation dans un gène codant pour l’autre phospholipase c bêta, plc21c, se sont comportées normalement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une compréhension claire de la façon d’obtenir des résultats reproductibles à l’aide d’un gradient thermique continu, ce qui vous permettra de comparer les préférences de température des larves de drosophile de type sauvage et mutantes. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 30 minutes pour un seul dosage.Lors de cette procédure, il est important de faire attention à l’état des flacons de mouches et de ne pas utiliser les larves si elles sont desséchées. Cette technique simplifie la découverte de nouveaux gènes nécessaires aux larves de drosophile pour sélectionner leur température préférée dans la plage confortable.

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