Name: Microscopie spectrale réflectométrique sur les axones myélinisés In Situ (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Découvrez la réflectométrie spectrale pour l'imagerie sans marquage des axones myélinisés dans le tissu nerveux intact. Cette technique quantifie la nanostructure axonale avec une dose lumineuse réduite.

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Ce travail a été soutenu par l’Institut de sciences fondamentales (IBS-R015-D1) et de base programme de recherche scientifique grâce à la Fondation de la recherche nationale de Corée (NRF) financé par le ministère de l’éducation (2017R1A6A1A03015642).

Toutes les interventions chirurgicales ont été approuvées par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université Sungkyunkwan.
1. préparation de l’échantillon
Remarque : Stériliser tous les instruments chirurgicaux avant toute manipulation animale. Effectuer toutes les performances chirurgicales dans une salle dédiée aux interventions chirurgicales. Gants et blouses stériles doivent être portées par tout le personnel dans la salle de chirurgie en permanence.
<ol><li>
Fixation du tissu
	<ol>
<li>Préparer les deux seringues de 10 mL que chacun rempli de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans du PBS.</li>
		<li>Anesthésier une souris âgée de 7-12 semaine, (C57BL/6J ou des lignées de souris ou l’autre sexe) par l’administration d’un mélange de zoletil et de xylazine (1:1, 20 mg/kg chacun) ou d’un régime alternatif anesthésie appropriée (p. ex., mélange de kétamine 80 mg/kg et 10 mg/kg xylazine) avec une injection intrapéritonéale.</li>
		<li>Lorsque la souris atteint un plan chirurgical de l’anesthésie (utilisez la méthode de pincement ou de non-réponse orteil), exposer le cœur en coupant de la peau et la cage thoracique avec des ciseaux.</li>
		<li>Découper l’oreillette droite avec petits ciseaux pour drainer le sang et perfuse la solution PBS et PFA séquentiellement dans le ventricule gauche avec une aiguille (taux de perfusion = 4 mL/min, volume = 10 mL de chaque solution). Remarque : La souris se raide si la procédure est menée à bien. L’utilisation de pommade ophtalmique ou de stérilisation n’est pas nécessaire car la procédure est en phase terminale. La procédure de fixation peut-être être ignorée. Toutefois, cette étape est recommandée afin de minimiser les déformations structurelles, y compris les dommages de tissu mécanique et un gonflement axonal ischémique. Pour plus de détails sur la fixation du tissu, reportez-vous à l’article par Gage, G. J. et al. 10
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation de la tranche de cerveau
	<ol>
<li>Décapiter la souris avec des ciseaux chirurgicaux à travers le ventre thorax et l’abdomen.</li>
		<li>Enlever le cuir chevelu et le périoste en utilisant une paire de ciseaux convenablement petite jusqu'à exposer entièrement le crâne.</li>
		<li>Briser l’os frontal et couper le crâne le long de la suture sagittale de l’os occipital, à l’aide de petits ciseaux avec soin ne pas d’endommager le cerveau.</li>
		<li>Retirez doucement le crâne et la dure-mère successivement à l’aide de pinces fines.</li>
		<li>Extraire le cerveau à l’aide d’une cuillère en plastique souple, en prenant soin de ne pas pour endommager les tissus.</li>
		<li>Rincer et faire tremper le cerveau extrait dans une solution PFA de 4 % pendant 30 min à 4 ° C.</li>
		<li>Tranchez le cerveau fixe en 100 – 150 µm sections à l’aide d’un vibratome. Remarque : Pour plus de détails sur la préparation du tissu, reportez-vous à l’article de Segev et al. 11. pour les procédures suivantes, le tissu doit être découpé en sections plus mince que l’épaisseur de la cale d’espacement.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montage de la tranche de cerveau
	<ol>
<li>Préparer la lame de 1 verre et 2 verres à couvercle carrés (22 × 22 × 0,17 mm) pour chaque tranche de tissu.</li>
		<li>Un des verres couvercle carrés coupé en moitié (deux morceaux rectangulaires) à l’aide d’un coupe-verre.</li>
		<li>Fixez les deux des lunettes couverture coupées en deux à l’aide d’une colle super sur la vitre de la diapositive. Remarque : L’espace entre les deux moitiés verres devrait être légèrement supérieure à la taille de la tranche de tissu.</li>
		<li>Récolter la tranche de cerveau à l’aide d’une brosse ou une pipette et poser le tissu sur le verre de glissement entre l’entretoise. Prendre soin de ne pas pour plier le tissu.</li>
		<li>Déposer 100 μl de PBS sur la surface du tissu.</li>
		<li>Placez le couvercle en autre carré verre sur le dessus du tissu. Éviter l’inclusion de bulles d’air lors de cette étape.</li>
		<li>Joint autour du verre de couverture avec un vernis à ongles (ou adhésifs alternativement appropriés) pour empêcher évaporation de PBS et de contamination par la poussière lors de la session d’imagerie ultérieure. Remarque : L’expérimentateur peut faire une pause à ce stade.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. étalonnage
<ol><li>Allumer le microscope au moins 1 h avant l’imagerie pour permettre la stabilisation thermique du laser source (voir la Table des matières). Ensuite, activer le logiciel pour l’analyse spectrale (voir Table des matières) et cliquez sur le bouton acquérir sur le dessus de GUI (Figure 3 a).
</li>
	<li>Allumez l’obturateur de logiciel pour le laser de lumière blanche (WLL) et un tube photomultiplicateur (PMT) (Figure 3 a).</li>
	<li>Sélectionnez le mode de xyΛ sur la liste déroulante en Mode d’Acquisition, puis, le mode d’entrée du laser est automatiquement changé de Constant pour cent à Puissance constante. Décochez la case à cocher du Mouvement à remontage automatique SP. Puis, affectez la fenêtre spectrale du laser d’entrée 470 – 670 nm et la taille de palier spectrale à 4 nm sur Λ-Excitation Lambda Scan paramètres (Figure 3 b).</li>
	<li>DÉFINIR la gamme spectrale de PMT à 450-690 en double-cliquant ou en déplaçant la barre de réglage pour la gamme spectrale (Figure 3C). Remarque : Cette gamme spectrale devrait inclure la largeur de bande complète de la source d’entrée.</li>
	<li>Sélectionnez un objectif immersion dans l’eau, convenablement avec une grande ouverture numérique (NA > 0,7) et faire n’importe quelle valeur pouvoir PMT et laser pour activer le bouton configuration AOBS et Live Scan . Passer le chemin optique en vérifiant la réflexion dans la Configuration AOBS (Figure 3d).</li>
	<li>Monter un miroir de renvoi (voir Table des matières) sur la platine du microscope. La surface du miroir doit être face contre l’objectif. S’il n’est pas facile de mettre le miroir sur la platine du microscope, coller un miroir sur la plaque plate (p. ex. verre de diapositive).</li>
	<li>Contrôler la platine du microscope pour aligner le plan focal à la surface du miroir.</li>
	<li>Ajuster le gain de la PMT et la puissance du laser compte tenu de la gamme dynamique du détecteur et puis changer le mode de saisie de laser de Constant pour cent à Puissance constante. Remarque : Comme il est typique, un PMT gain de 500 (V) et une puissance laser relative de 0,1 % servent à 570 nm.</li>
	<li>Confirmer en mode pseudo-couleur pour vérifier qu’il n’y a aucune saturation sur toute la gamme de longueur d’onde. Si la saturation est observée, baisser la puissance du laser (Figure 3 a).</li>
	<li>Exécutez l’acquisition Lambda Scan .</li>
	<li>Retirer le miroir de la scène et répétez l’acquisition même sans un échantillon afin d’obtenir la référence sombre (par exemple, décalage sombre).</li>
	<li>Enregistrer les données dans un format TIF de base .</li>
</ol>3. Acquisition d’images de diffuseurs
<ol><li>Placez le tissu monté sur la platine du microscope. Pour à peu près aligner les tissus et le plan focal de l’objectif, utilisez le mode grand-angulaire fluorescence par un oculaire.</li>
	<li>Avec l’option Live Scan sur contrôler la platine du microscope pour aligner le plan focal de la région d’intérêt dans le tissu. Pour éviter le bruit de fond de la lamelle couvre-objet, sélectionnez la région cible d’au moins 15 μm profondeur dans l’interface de verre-tissu.</li>
	<li>Acquérir la pile d’image spectrale pour la région de cible en utilisant la même procédure comme décrit aux points 2.1 à 2.10.</li>
	<li>Enregistrer les données pour le tissu et le décalage sombre en format TIF de base . Remarque : L’expérimentateur peut faire une pause à ce stade.</li>
</ol>4. traitement et analyse d’images
<ol><li>Ouvrez les données spectrales (base TIF) pour le miroir de renvoi et le tissu cérébral dans ImageJ.</li>
	<li>Sélectionnez la ROIs (régions d’intérêt) pour les piles d’image ouverte — la zone centrale pour le miroir de renvoi et le segment d’une fibre de l’axone pour le tissu cérébral.</li>
	<li>Acquérir les spectres brutes pour la ROIs sélectionnée par l’Image en cours d’exécution, piles → → axe z à tracer le profil dans le menu ImageJ.</li>
	<li>Ouvrir les données décalage sombres, une prise pour le miroir de renvoi et les autres prises pour le tissu cérébral.</li>
	<li>Acquérir les spectres pour les offsets sombres par l’Image en cours d’exécution, piles → → axe z à tracer le profil dans le menu ImageJ.</li>
	<li>Enregistrez tous les spectres acquis en utilisant les options de copier / coller . Remarque : Pour l’imagerie de diffuseurs, de centre d’imagerie du champ afin de minimiser les aberrations optiques hors-axe est recommandé. Les fibres de l’axone peuvent être structurellement hétérogènes sur toute leur longueur. Par conséquent, en sélectionnant le retour sur investissement sur un segment de petit axon, typiquement < 5 µm, pour minimiser l’artefact de volume partiel est recommandé.</li>
</ol>5. données initiales Correction et analyse des signaux de diffuseurs
<ol><li>Soustraire les décalage spectres des spectres du miroir de renvoi et les tissus cérébraux.</li>
	<li>Normaliser chaque spectre en divisant l’intensité maximale du spectre.</li>
	<li>Diviser le spectre normalisé de l’axone par le spectre normalisé du miroir référence et soustraire le décalage CC parmi les fréquences normalisées.</li>
	<li>Mesurer la fréquence de l’onde en ajustant le spectre acquis à une sinusoïdale courbe (voir la Table des matières) et puis convertir le nombre d’onde acquise à périodicité par prise réciproque.</li>
	<li>Convertir le diamètre de l’axone à l’aide de l’équation dans la Figure 4 cde la périodicité de nombre d’onde.</li>
</ol>

<ol><li>Fernandez-Moran, H., Finean, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscope+and+low-angle+x-ray+diffraction+studies+of+the+nerve+myelin+sheath%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Electron microscope and low-angle x-ray diffraction studies of the nerve myelin sheath.</a> Journal of Cell Biology. 3, (1957).</li>
<li>Blaurock, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spaces+between+membrane+bilayers+within+PNS+myelin+as+characterized+by+X-ray+diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The spaces between membrane bilayers within PNS myelin as characterized by X-ray diffraction.</a> Brain Research. 210, 383-387 (1981).</li>
<li>Shim, S. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , 13978-13983 (2012).</li>
<li>Urban, N. T., Willig, K. I., Hell, S. W., Nägerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+nanoscopy+of+actin+dynamics+in+synapses+deep+inside+living+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">STED nanoscopy of actin dynamics in synapses deep inside living brain slices.</a> Biophysics Journal. 101, 1277-1284 (2011).</li>
<li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nature Methods. 5, 155-157 (2008).</li>
<li>Peters, A., Sethares, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+there+remyelination+during+aging+of+the+primate+central+nervous+system%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Is there remyelination during aging of the primate central nervous system?</a> Journal of Comparative Neurology. 460, 238-254 (2003).</li>
<li>De Campos Vidal, B., Silveira Mello, M. L., Caseiro-Filho, A. C., Godo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+properties+of+the+myelin+sheath%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochemica%22%5BJournal%5D)">Anisotropic properties of the myelin sheath.</a> Acta Histochemica. 66, 32-39 (1980).</li>
<li>Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+in+vivo+imaging+of+myelinated+axons+in+health+and+disease+with+spectral+confocal+reflectance+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy.</a> Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).</li>
<li>Kwon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+nanoscale+optical+metrology+on+myelinated+axons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Label-free nanoscale optical metrology on myelinated axons in vivo.</a> Nature Communication. 8, 1832(2017).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> JoVE. (65), e3564(2012).</li>
<li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27341060">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> JoVE. (112), e54024(2016).</li>
<li>Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15348(2015).</li>
<li>Chang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14, 593-599 (2017).</li>
<li>Polishchuk, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+light-electron+microscopy+reveals+the+tubular-saccular+ultrastructure+of+carriers+operating+between+Golgi+apparatus+and+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane.</a> Journal of Cell Biology. 148, 45-58 (2000).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent des intérêts financiers divergents : Kwon J. et M. Choi sont les inventeurs de la technologie en instance de brevet décrit dans cet Article.

Diffuseurs est une nouvelle modalité d’imagerie exempte d’étiquette basée sur l’interférométrie spectrale, qui pour la première fois, offre l’information de l’échelle nanométrique dans les axones myélinisés direct. Dans le protocole actuel de l’acquisition, la résolution spatiale pour le diamètre de l’axone est de l’ordre de 10 nm. En outre, diffuseurs utilise des ordres de grandeur plus faible dose légère par rapport aux autres microscopies de Super-résolution ; Il est donc exempt de photoblanchiment et de phototoxicité...

Dans le système nerveux des mammifères, la myéline fournit la conduction nerveuse rapide et intégrité axonale par Envellopants les fibres axonales avec gaines membraneuses multicouches. Sa structure multicouche est composé d’une alternance de minces nanométriques composées de membranes plasmiques (~ 5 nm), cytosol (environ 3 nm) et les espaces extracellulaires (~ 7 nm)1,2. La microscopie optique, y compris la microscopie de Super-résolution récente, ne conviennent pas pour l’observation de la dynamique de la myéline échelle nanométrique en raison de leur résolution insuffisante en raison de la diffraction optique3,4,5. Bien que la microscopie électronique peut fournir des détails de la nanostructure de myéline, ce n’est pas compatible avec les systèmes biologiques vivants en raison des préparations très envahissante impliquant la fixation chimique et ultrasectioning6,7 . Jusqu'à tout récemment, il n’y a eu aucune technique il y a lieu d’observer nanométriques dynamique des axones myélinisés in situ.
Schain et coll. a déjà signalé que les axones myélinisés présentent8de la réflexion de la lumière colorée. En adoptant l’analyse spectroscopique de la lumière réfléchie, nous avons mis au point une nouvelle modalité d’imagerie pour l’imagerie nanométrique des axones myélinisés, nommé réflectométrie spectrale (diffuseurs)9. Diffuseurs repose sur l’ingérence de minces qui se produisent dans la structure multicouche de la gaine de myéline (Figure 1). Par simulation optique sur les axones différents, nous avons révélé que le spectre de réflectance est une fonction périodique de nombre d’onde et sa périodicité (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57965/57965eq1.jpg">) est inversement proportionnelle au diamètre de l’axone (d). Cette relation simple (<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57965/57965eq2.jpg">) propose une quantification du diamètre de l’axone d’après les données de diffuseurs. Grâce à cela, nous avons révélé l’axone répandue renflement sous léger traumatisme crânien dans notre rapport précédent.
Le système de diffuseurs repose sur la microscopie confocale et se compose d’une source laser spécialisés et filtre (Figure 2). La source d’entrée est un laser de lumière blanche, fournissant une sortie à large bande spectrale visible à l’infrarouge. Pour l’analyse spectrale, le système est muni de deux dispositifs acousto-optiques : un filtre accordable acousto-optique (AOTF) pour fournir une longueur d’onde sélectionnée de la source à large bande d’entrée et un séparateur de faisceau d’acousto-optique (AOBS) pour guider les sélectionnés reflétés longueur d’onde du détecteur. Le logiciel pour la microscopie confocal hyperspectrales (voir Table des matières) fournit une option de balayage spectral personnalisable d’acquérir dans l’ordre les images de réflectance à différentes longueurs d’onde d’entrée. Par ailleurs, l’aberration chromatique peut gravement interférer dans la mesure spectrale ; par conséquent, l’utilisation d’une lentille d’objectif apochromat est recommandée.
À noter, lumière blanche lasers produisent une sortie spectrale inégale et les composants optiques affectent également le profil spectral. Par conséquent, les spectres acquis doivent être calibrées pour l’analyse quantitative ultérieur. Un miroir argent protégé est généralement utilisé comme référence, qui offre une réflexion presque constante (&gt; 97 %) au-dessus de la région complètement visible. Les spectres acquis sont ensuite divisés par les spectres de référence par le miroir.
La taille de palier spectrale pour l’analyse spectrale détermine la vitesse d’acquisition ; ainsi, il doit être optimisé. Comme un axone plus grande et dispose d’un délai spectral plus élevé, il faut plus fine de l’échantillonnage spectral. Par exemple, un axone d’un diamètre de 10 µm, une des axones physiologiques plus grands, dispose d’un délai spectral de ~ 8 nm. En appliquant les critères d’échantillonnage de Nyquist, nous avons utilisé l’intervalle d’échantillonnage spectral de 4 nm pour couvrir tous les axones physiologiques dans les tissus nerveux de la souris. Cette approche prend généralement plus de quelques secondes pour un scan complet spectral et donc n’est pas adaptée pour des applications in vivo , où le mouvement physiologique (p. ex. respiration et rythme cardiaque) s’ingère acquisition spectrale stable. Précédemment, nous avons résolu ce problème en instrumentant un microscope droit sur mesure, conçu pour acquérir le spectre complet pour chaque point à l’aide d’un spectromètre de tableau (acquisition Vitesse ≈ 30 ms par pixel).
Dans ce rapport, nous décrivons un protocole détaillé sur l’imagerie de diffuseurs sur une tranche fixe de cerveau, qui peut être effectuée dans un microscope hyperspectral commerciale (voir Table des matières). Ainsi, le protocole peut être complété par les expérimentateurs sans expertise en instrumentation optique. Nous couvrons également les problèmes potentiels et dépannage pour l’acquisition et l’analyse des données de diffuseurs.

<table><tbody><tr><td>Coupe-verre</td> <td>-</td><td></td> <td>Peut être acheté dans un dépanneur local ou dans des magasins en ligne.</td></tr><tr><td>Vernis à ongles</td> <td>-</td><td></td> <td>Peut être acheté dans un dépanneur local ou dans des magasins en ligne.</td></tr><tr><td>Objectif apochromatique 40°, NA 1.1</td><td>Leica Microsystems</td><td>15506357</td><td>Type à immersion</td></tr><tr><td>dans l’eau Fluoromyéline Vert</td><td>Thermo Fisher</td><td>F34651</td><td>Alternativement, le Rouge Fluoromyéline (F34652) peut être utilisé.</td></tr><tr><td>Microscope Leica SP8 TCS</td><td>Leica Microsystems</td><td>SP8</td><td>Pour plus de détails, reportez-vous à la section « Configuration du microscope » dans la section Introduction.</td></tr><tr><td>Logiciel d’imagerie</td><td>Leica Microsystems</td><td>LAS-X-Matlab</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>MathWorks</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Mirror</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-P01</td><td>Recouvert d’argent protégé.</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Life technologies</td><td>14190-136-Paraformaldéhyde</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Biosolution</td><td>BP031a</td><td>4 % v/v dans PBS</td></tr><tr><td>Lame de recouvrement</td><td>Thermo Fisher</td><td>3306</td><td>Epaisseur : #1 (0,13 à 0,17 mm)</td></tr><tr><td>Verre lame</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>5116-20F</td><td>Épaisseur : ~1 mm</td></tr><tr><td>Super colle</td><td>Henkel</td><td>Loctite 406</td><td>Utilisez un équipement de distribution pour éviter tout contact avec la peau ou les yeux.</td></tr><tr><td>Pousse-seringue</td><td>Brainetree Scientific</td><td></td> <td>BS-8000 DUAL-Vibratome</td></tr> <tr><td></td><td>Leica Biosystems</td> <td>VT1200S-Laser</td><td></td></tr> <tr><td>à lumière blanche</td><td>NKT photonique</td><td>EXB-6</td><td>EXB-6 a été abandonné et remplacé par EXU-6.</td></tr></tbody></table>

microscopie spectrale réflectométrique sur les axones myélinisés in situ

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

Dans un système nerveux des mammifères, la myéline fournit une isolation électrique par Envellopants les fibres axonales dans une spirale de multicouche. Inspiré par son architecture sous-cellulaire très organisés, nous avons récemment développé une nouvelle modalité d’imagerie, nommée réflectométrie spectrale (diffuseurs), qui permet l’imagerie nanométriques de label-free sans précédent de l' axones myélinisés live in situ. Le principe sous-jacent est d’obtenir des informations de la nanostructure en analysant le spectre de réflectance de la structure multicouche subcellulaire. Dans cet article, nous décrivons un protocole détaillé étape par étape pour réaliser une imagerie de diffuseurs de base des tissus nerveux à l’aide d’un système microscopique confocal commercial, équipé d’un laser de lumière blanche et d’un filtre accordable. Nous couvrons les procédures de préparation des échantillons, acquisition de données spectrales et traitement d’image pour obtenir des informations de nanostructure.

Selon le protocole, une tranche fixe de cerveau a été préparée avec la coloration exogène, un fluorophore de ciblage de la myéline (voir Table des matières). Diffuseurs imagerie a été réalisée sur la tranche du cerveau en utilisant un microscope confocal hyperspectral commercial conjointement avec confocal fluorescence imaging (Figure 4 a). Pour diffuseurs, intensité optique d’entrée a été fixée à 5 µW/µm2 avec un temps de pause de...

Nous présentons ici un protocole étape par étape pour l’imagerie des axones myélinisés dans une tranche de cerveau fixe à l’aide d’une échelle nanométrique exempte d’étiquette d’imagerie technique basée sur la réflectométrie spectrale.

Microscopie spectrale réflectométrique sur les axones myélinisés In Situ

In a mammalian nervous system, myelin provides an electrical insulation by enwrapping the axon fibers in a multilayered spiral. Inspired by its ...

Cette technique peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la myéline, telles que la plasticité et la démyélinisation de la myéline. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’étudier la nanostructure de l’axone myélinisé dans le tissu cérébral intact sans aucun marquage complexe ni préparation d’échantillon. Ici, nous allons faire une démonstration sur l’application dans une tranche de cerveau, mais cette technique peut être étendue à des animaux vivants.Après avoir fixé et tranché le tissu cérébral de la souris selon le protocole de texte, préparez une lame de verre et deux verres de couverture pour chaque tranche de tissu. À l’aide d’un coupe-verre, coupez l’un des verres de couverture carrée en deux. Ensuite, créez une entretoise en utilisant de la superglue pour fixer les deux pièces sur la lame de verre.À l’aide d’un pinceau ou d’une pipette, prélevez une tranche de cerveau et posez le tissu sur une lame de verre entre l’entretoise, en prenant soin de ne pas plier le tissu. Distribuez 100 microlitres de PBS à la surface du tissu. Ensuite, placez le deuxième verre de couverture carré sur le dessus du mouchoir en papier tout en évitant l’introduction de bulles d’air.Utilisez du vernis à ongles pour sceller autour du verre de protection afin d’éviter l’évaporation du PBS et la contamination par la poussière lors de la séance d’imagerie ultérieure. Au moins une heure avant l’imagerie, allumez le microscope pour permettre la stabilisation thermique de la source laser. Allumez ensuite le logiciel de balayage spectral et cliquez sur le bouton d’acquisition en haut de l’interface graphique.Allumez l’obturateur logiciel du laser à lumière blanche et du tube photomultiplicateur. Sous Mode d’acquisition, sélectionnez le mode lambda XY dans la liste déroulante. Le mode d’entrée laser passe alors automatiquement d’un pourcentage constant à une puissance constante.Sous l’excitation lambda, les paramètres de balayage lambda, décochez la case de mouvement automatique SP et réglez la fenêtre spectrale pour le laser d’entrée sur 470 à 670 nanomètres et la taille du pas spectral sur quatre nanomètres. Réglez la plage spectrale de PMT sur 450 à 690 nanomètres en double-cliquant ou en déplaçant la barre de réglage de la plage spectrale. Choisissez un objectif à immersion dans l’eau avec une ouverture numérique élevée.Donnez n’importe quelle valeur au PMT et à la puissance laser pour activer la configuration AOBS et le bouton de balayage en direct. Sous la configuration AOBS, passez au chemin optique en vérifiant la réflexion. Ensuite, montez un miroir de référence sur la platine du microscope avec la surface face à la lentille de l’objectif.S’il n’est pas facile de placer le miroir sur la platine du microscope, collez un miroir sur la plaque plane. Ajustez la platine du microscope pour aligner le plan focal sur la surface du miroir. Ensuite, ajustez le gain PMT et la puissance laser, en tenant compte de la plage dynamique du détecteur.Sous une pseudo-couleur, vérifiez qu’il n’y a pas de saturation sur toute la gamme de longueurs d’onde. Si une saturation est observée, réduisez la puissance du laser. Exécutez ensuite l’acquisition du balayage lambda.Retirez le miroir de la platine et répétez la même acquisition sans échantillon afin d’obtenir la référence sombre. Enregistrez ensuite les données dans un format TIF multi-empilés. Pour effectuer l’acquisition d’images SpeRe, placez le tissu monté sur la platine du microscope.Pour aligner grossièrement le tissu sur le plan focal de la lentille de l’objectif, utilisez le mode de fluorescence à grand champ à travers un oculaire. Avec le balayage en direct activé, contrôlez la platine du microscope pour aligner le plan focal sur la région d’intérêt dans le tissu. Pour éviter le bruit de fond de la lamelle, sélectionnez une région cible d’au moins 15 micromètres de profondeur à partir de l’interface du tissu de verre.Acquérez la pile d’images spectrales pour la région cible en utilisant la même procédure que celle illustrée précédemment dans cette vidéo. Enregistrez ensuite les données pour le tissu et l’offset sombre au format TIF multi-empilés. Pour traiter les images dans ImageJ, ouvrez les données spectrales du miroir de référence et du tissu cérébral.Sélectionnez les zones d’intérêt pour les piles d’images ouvertes, la zone centrale pour le miroir de référence et le segment d’une fibre axonale pour le tissu cérébral. Ensuite, exécutez l’image, empilez, tracez le profil de l’axe Z pour acquérir les spectres bruts pour les ROI sélectionnés. Les fibres axonales peuvent être structurellement hétérogènes sur toute leur longueur, par conséquent, il est recommandé de sélectionner le retour sur investissement sur un petit segment axonal généralement inférieur à cinq micromètres pour minimiser les artefacts de volume partiel.Ouvrez les données de décalage sombre, l’une prise pour le miroir de référence et l’autre pour le tissu cérébral, et tracez le profil de l’axe Z comme cela vient d’être démontré. Utilisez ensuite les options copier-coller pour enregistrer toutes les options acquises. Pour effectuer une correction de base et une analyse du signal SpeRe, soustrayez les spectres de décalage des spectres du miroir de référence et des tissus cérébraux.Normalisez chaque spectre en divisant l’intensité maximale du spectre. Entrez le nombre d’onde en prenant l’inverse de la longueur d’onde utilisée dans l’expérience, normalisez le spectre de l’axone en divisant celui du miroir de référence et soustrayez le décalage DC du spectre normalisé. Et puis obtenez la fréquence du nombre d’onde en ajustant le spectre acquis à une sinusoïde.Convertissez la fréquence du nombre d’onde acquis en périodicité en prenant l’inverse et convertissez la périodicité du nombre d’onde en diamètre de l’axone à l’aide de l’équation illustrée ici. Dans cette expérience, des tranches de cerveau fixes ont été colorées par fluorescence contre la myéline et l’imagerie SpeRe a été réalisée avec une dose de lumière d’un ordre de grandeur inférieur à la microscopie confocale à fluorescence conventionnelle. Le signal SpeRe a été localisé le long du centre des axones myélinisés comme prévu par la géométrie de la réflexion optique.À partir du spectre réfléchissant d’un segment axonal, la périodicité du nombre d’onde a été obtenue, qui a ensuite été convertie en diamètre axonal. Ce graphique illustre un profil transversal de l’intensité de fluorescence de la région encadrée ici, et le diamètre mesuré par SpeRe s’est avéré être en bon accord avec la mesure basée sur la fluorescence. L’imagerie SpeRe est basée sur la réflexion optique.Ainsi, une lamelle à base de silice peut introduire un bruit de fond important. Dans la configuration optique, le bruit de fond était considérable lorsque la profondeur d’imagerie de la lamelle était inférieure à cinq micromètres, mais était évité lorsque la profondeur d’imagerie était supérieure à 15 micromètres. L’étape d’étalonnage n’est pas nécessaire pour toutes les expériences, mais elle est recommandée au moins une fois par semaine.Une fois l’étalonnage terminé, la procédure d’imagerie peut être terminée en 20 secondes pour chaque champ de vision. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de ne pas oublier de tenir compte de la latence dynamique du détecteur pour le balayage du spectre complet. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’obtenir la nanostructure à partir d’axones myélinisés à l’aide d’images de réflectance.

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Une technique d'imagerie pour le suivi de l'évolution du potentiel de membrane avec une résolution spatiale sous-micrométrique et sub-milliseconde temporelle est décrit. La technique, basée sur une excitation laser de la tension de colorants sensibles, permet de mesurer des signaux dans les axones et les collatéraux axone, des branches dendritiques et terminaux individuels épines dendritiques.

Enregistrement colorant sensible à la tension d&#39;axones, des dendrites et des épines dendritiques des neurones individuels dans des tranches de cerveau

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Quatre dimensions (4D) imagerie est utilisée pour étudier le comportement et les interactions entre les deux types de endosomes dans les terminaisons nerveuses vertébrés vivant. Le mouvement de ces petites structures est caractérisé en trois dimensions, ce qui permet la confirmation des événements tels que la fusion des endosomes et l'exocytose.

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Évaluation de l’inflammation, de la démyélinisation et des lésions axonales du système nerveux central dans l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale

Découvrez la réflectométrie spectrale pour l'imagerie sans marquage des axones myélinisés dans le tissu nerveux intact. Cette technique quantifie la nanostructure axonale avec une dose lumineuse réduite.

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