Criblage de surexpression axée sur l’accouplement chez la levure

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des maladies neurodégénératives, telles que les facteurs génétiques et les voies qui régulent la toxicité des protéines associées à la maladie. Le principal avantage de cette technique est que le processus très efficace d’accouplement de levure est utilisé pour cribler des modèles de levure contre une grande collection de gènes de banque. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la toxicité des protéines des maladies neurodégénératives, elle peut également être appliquée à l’étude d’autres processus cellulaires chez la levure, tels que la tolérance à d’autres conditions de stress.

Commencez cette procédure en aliquotant cinq microlitres par puits d’ADN plasmidique à partir d’une bibliothèque de plasmides en réseau sur des plaques à fond rond de 96 puits. Gardez les assiettes à quatre degrés Celsius. Ensuite, inoculez 150 millilitres de peptone dextrose de levure ou de milieu YPD dans un flacon de 500 millilitres avec une colonie de la souche de levure haploïde W303 Alpha.

Incuber la culture à 30 degrés Celsius en secouant à 200 tr/min pendant la nuit. Le lendemain matin, après avoir mesuré la DO 600 de la culture de nuit, diluez la culture à une DO 600 de 0,1 dans deux litres de YPD. Incuber à 30 degrés Celsius en secouant à 200 tr/min pendant environ cinq heures, jusqu’à ce que la culture atteigne une OD600 de 0,4 à 0,6.

Pour récolter la culture de levure, remplissez huit bouteilles de centrifugeuse stériles de 250 millilitres et centrifugez à 3000 xG pendant 10 minutes à température ambiante. Versez le surnageant sans perturber la pastille. Lavez la levure comme décrit dans le protocole textuel et consolidez les cellules dans deux tubes à centrifuger.

Remettre en suspension chaque pastille de cellule dans 25 millilitres d’une solution d’acétate de lithium à 0,1 molaire. Combinez les cellules remises en suspension, ajoutez cinq millilitres d’ADN de spermatozoïde de saumon et transférez-les dans une fiole de 150 millilitres. Incuber à 30 degrés Celsius en secouant à 225 tr/min pendant 30 minutes.

Après 30 minutes, versez le mélange cellulaire dans un réservoir de réactif jetable stérile. À l’aide d’une pipette multicanaux, transférez 35 microlitres du mélange cellulaire dans chaque puits des plaques à 96 puits à fond rond, contenant la banque d’ADN plasmidique préparée précédemment. Vortex les plaques de 96 puits à 1000 tr/min pendant une minute.

Incuber les plaques à 30 degrés Celsius sans secouer pendant 30 minutes. N’empilez pas les plaques, afin que la chaleur puisse être transférée plus efficacement. Retirez les plaques à 96 puits de l’incubateur à 30 degrés Celsius et mélangez-les à 1000 tr/min pendant 30 secondes.

Ajoutez 125 microlitres de tampon de transformation dans chaque puits, puis faites tourbillonner les plaques à 1000 tr/min pendant une minute. Incuber les assiettes à 30 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, choquez la levure par la chaleur en plaçant les plaques dans un incubateur à 42 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Centrifugez les plaques à 3000 xG pendant cinq minutes. Retirez le tampon de transformation des puits en inversant les plaques au-dessus d’une poubelle et en déchargeant avec force le tampon des plaques. Épongez rapidement les plaques inversées sur une serviette en papier propre pour enlever tout liquide sur le dessus des assiettes.

Rincez les cellules en ajoutant dans chaque puits, 200 microlitres de milieu de chute minimale correspondant au marqueur sélectionnable sur le plasmide de la banque. Le milieu synthétique ura minus est utilisé ici. Centrifugez les plaques à 3000 xG pendant cinq minutes.

Retirez le surnageant au-dessus d’une poubelle comme indiqué précédemment. Ajoutez 160 microlitres de milieu ura minus, contenant 2 % de glucose dans chaque puits et vortex les plaques à 1000 tr/min pendant une minute. Incuber les plaques sans les secouer à 30 degrés Celsius pendant 48 heures.

Au bout de 48 heures, une pastille de levure transformée doit être visible au fond de chaque puits. À l’aide d’un distributeur de liquide, ajoutez 100 microlitres de milieu ura moins contenant du glucose dans chaque puits d’un nouvel ensemble de plaques à 96 puits. Vortex les plaques contenant la levure transformée à 1000 tr/min pendant 30 secondes.

À l’aide d’un réplicateur en plastique stérile à 96 broches, placez les broches dans les puits contenant la levure transformée, puis inoculancez-les dans les puits correspondants des nouvelles plaques remplies de milieu. Incuber les nouvelles plaques à 30 degrés Celsius pendant 24 heures. Après 24 heures, une pastille de levure devrait être visible au fond de chaque puits contenant de la levure transformée avec succès.

Pour conserver ces souches de levure sous forme de stocks de glycérol, ajoutez 50 microlitres de glycérol à 50 % dans chaque puits, vortex les plaques à 1000 tr/min pendant 30 secondes, scellez les plaques avec du papier d’aluminium et congelez à moins 80 degrés Celsius. Pour raviver les souches de la bibliothèque à partir du stock de glycérol, sortez les plaques à 96 puits du congélateur à moins 80 degrés Celsius, retirez le papier d’aluminium et laissez la levure décongeler à température ambiante pendant environ 30 minutes. Une fois la levure décongelée, utilisez un réplicateur en plastique stérile à 96 broches pour inoculer les stocks de glycérol à 160 microlitres de milieu d’ura frais moins contenant 2 % de glucose dans des plaques à 96 puits et incuber à 30 degrés Celsius pendant 24 heures.

Immédiatement après l’utilisation des souches de la bibliothèque, scellez les plaques et remettez-les dans le congélateur à moins 80 degrés Celsius. Le jour même où les souches de la bibliothèque sont décongelées, inoculez la souche de levure query dans 50 millilitres de YPD et cultivez-la à 30 degrés Celsius en secouant à 250 tr/min pendant la nuit. Le lendemain matin, versez la souche de levure query dans un réservoir de réactif stérile jetable et aliquote 160 microlitres de la souche query dans chaque puits d’une plaque de 96 puits.

À l’aide du distributeur de liquide, distribuez 160 microlitres par puits de média YPD dans des plaques de 96 puits. Vortex brièvement les plaques à 96 puits contenant la souche query et les plaques de souche de la banque, puis utilisez un réplicateur stérile à 96 broches pour transférer les souches de la banque sur les plaques YPD qui ont été inoculées avec la souche query. Incuber les plaques YPD à 30 degrés Celsius pendant 24 heures.

Après 24 heures, une pastille de levure sera visible au fond de chaque puits. Remplissez des plaques de 96 puits avec un milieu de rodage minimal contenant 2 % de Raffinose correspondant aux marqueurs sélectionnables sur le plasmide dans la souche de requête, ainsi que sur le plasmide de la bibliothèque. Utilisez un réplicateur stérile à 96 broches pour transférer la levure des cultures d’accouplement YPD vers le milieu sélectif.

Incuber les plaques de 96 puits à 30 degrés Celsius pendant 48 heures. Seules les cellules de levure qui se sont accouplées et qui ont formé des cellules diploïdes et qui contiennent donc à la fois le plasmide de requête et le plasmide de banque pourront se développer dans ce milieu. Après 48 heures de croissance dans le milieu sélectif contenant du Raffinose, observez qu’une pastille est visible au fond des puits qui contiennent des cellules diploïdes.

Vortex les plaques de 96 puits à 1000 tr/min pendant une minute. Utilisez une machine à détester robotisée pour repérer la levure sur des plaques de gélose en quatre exemplaires pour des plaques ura-his-droupout contenant 2 % de galactose et 2 % d’agar, et pour des plaques ura-his-droupout contenant 2 % de glucose et 2 % d’agar. Après le repérage, laissez sécher les plaques de gélose puis placez-les à l’envers dans un incubateur à 30 degrés Celsius pendant quatre jours.

Toutes les 24 heures, photographiez les plaques de gélose pour enregistrer la croissance de la levure. La toxicité de la protéine FUS associée à l’ALS a été examinée pour la première fois chez des levures diploïdes. Comme l’indique la plaque de gélose contenant du galactose, qui induit le FUS, la toxicité du FUS est constante chez les levures diplod et haploïdes.

Cinq gènes précédemment identifiés comme suppresseurs de la toxicité du FUS à partir d’une méthode basée sur la transformation ont été testés par la méthode d’accouplement. La première voie est une souche de levure témoin transformée avec deux vecteurs vides. La deuxième voie est la souche de levure diploïde FUS avec un vecteur vide où l’expression de FUS est très toxique.

Les voies trois à sept montrent une levure diploïde exprimant FUS ainsi qu’un gène de suppression. Les cinq gènes sauvent la toxicité de FUS chez la levure diploïde, indiquant que la méthode d’accouplement était efficace. Cette méthode basée sur l’accouplement a ensuite été appliquée à un criblage de 940 gènes dans une banque de surexpression.

Et une photo d’une plaque représentative est montrée. Comme indiqué sur la plaque de galactose, où FUS et les gènes de la banque sont exprimés, FUS était toxique pour la cellule de levure diplod. Le gène de la bibliothèque, indiqué par le carré vert, a sauvé la toxicité de FUS.

Alors que le gène de la banque, indiqué par le carré rouge, a augmenté la toxicité. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 120 heures, si elle est exécutée correctement. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de vérifier au préalable que le phénotype utilisé pour le dépistage n’est pas dépendant du type d’accouplement haploïde.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’identifier les facteurs génétiques lors de la surexpression qui sauvent la toxicité des protéines associées à la maladie chez la levure. Après son développement, cette technique peut ouvrir la voie aux chercheurs dans le domaine des maladies neurodégénératives, pour explorer les mécanismes de cytotoxicité des protéines associées à la maladie dans le modèle de levure. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que le dosage de la bêta-galactosidase peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme si le sauvetage est spécifique.