Name: Criblage de surexpression axée sur l’accouplement chez la levure (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Découvrez un criblage de surexpression basé sur l'accouplement chez la levure pour étudier la toxicité des protéines associées aux maladies neurodégénératives. Cette méthode efficace permet d'identifier les facteurs génétiques modulateurs.

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Nous sommes reconnaissants pour des discussions approfondies avec les membres du laboratoire Ju et laboratoire de Zhong et le soutien financier de la Wright State University.

Remarque : Le protocole décrit ici est conçu pour le dépistage des plasmides de bibliothèque contenues dans dix plaques de 96 puits mais peut évoluer vers le haut ou vers le bas en conséquence. Le protocole doit être répété pour compléter l’examen préalable de toute bibliothèque. Généralement, dépistage de 10 plaques de gènes de la bibliothèque chaque fois peut être confortablement géré par 1 personne.
1. préparation pour la Transformation de la levure de 96 puits
Remarque : Cette étape est faite comme précédemment décrit7,10.
<ol><li>Aliquote 5 µL (environ 50 à 100 ng) de l’ADN d’une bibliothèque de plasmide déployèrent dans chaque puits d’une plaque de 96 puits fond rond de plasmide. Remarque : Un exemple d’une telle bibliothèque serait une levure gène surexpression bibliothèque10.</li>
	<li>Inoculer 150 mL de levure peptone dextrose (DPJ) médias dans un ballon jaugé de 500 mL avec une colonie (2 – 3 mm de diamètre) de la souche de levure haploïde W303α. Les incuber pendant la nuit à 30 ° C sous agitation (200 tr/min).</li>
	<li>Le lendemain matin, mesurer l' OD600 de la culture au jour le jour et diluer la culture de levure à OD600 = 0,1 (jusqu'à) 2 l de la DPJ. Incuber à 30 ° C sous agitation (200 tr/min) pendant environ 5 h, jusqu'à ce que la culture atteint OD600 = 0,4 à 0,6.</li>
</ol>2. Transformation de levure
<ol><li>Récolte de la culture de levure par 8 bouteilles de centrifugeuse stérile 250 mL de remplissage et leur centrifugation à température ambiante à 3 000 g pendant 10 min. décanter le liquide surnageant sans déranger le culot. NOTE : Effectuer toutes les étapes de centrifugation à température ambiante.</li>
	<li>Laver la levure avec stérile distillée H2O. Pour ce faire, ajouter 100 mL de stérile H2O à chaque bouteille de la centrifugeuse et le vortex à Resuspendre le culot cellulaire. Combiner les cellules lavées dans 2 bouteilles et centrifuger à 3 000 g pendant 5 min. décanter le liquide surnageant.</li>
	<li>Laver les cellules dans chaque bouteille dans 100 mL de 0.1 M LiOAc/1XTE (100 mM LiOAc ; 10 mM Tris, pH 8,0 ; 1 mM EDTA) et les centrifuger à 3 000 x g pendant 5 min. Pour désactiver le surnageant.</li>
	<li>Pendant la centrifugation, faites bouillir 5 mL de sperme de saumon ADN (10 mg/mL) à 100 ° C à l’aide d’un chauffe-bloc pendant 3 min et puis refroidir sur glace.</li>
	<li>Resuspendre le culot dans 25 mL de 0.1 M LiOAc/1XTE dans chaque bouteille, combiner les cellules resuspendues et transférez-les sur un flacon de 150 mL. Ajouter 5 mL de sperme saumon refroidi préalablement ADN et il incuber à 30 ° C sous agitation (225 tr/min) pendant 30 min.</li>
	<li>Versez le mélange de cellules dans un réservoir jetable stérile et, à l’aide d’une pipette multicanaux, transférer 35 µL du mélange cellulaire dans chaque puits de la plaque à 96 puits fond rond contenant l’ADN de plasmide de bibliothèque. Plaques de Vortex le 96 puits à l’aide d’une plaque vortexer pendant 1 min à 1 000 tr/min. Incuber les boîtes pendant 30 min à 30 ° C sans agitation. Remarque : Ne pas empiler les plaques, donc la chaleur peut transférer plus efficacement. Nous avons constaté que Vortex les plaques 96 puits à 1 000 tr/min ne provoque pas de liquide se répandre hors du puits, mais une vitesse sécuritaire vortex doit être testée avant de passer à l’étape.</li>
	<li>Dans une fiole, préparer 200 mL du tampon transformation contenant une concentration finale de 40 % PEG3350, 10 % DMSO et 0,1 M LiOAc. Préparer le tampon de transformation immédiatement avant utilisation et bien mélanger en agitant.</li>
	<li>Supprimer 96 plats de l’incubateur à 30 ° C et mélanger pendant 30 s à 1 000 tr/min à l’aide de la plaque vortexer. Ajouter 125 µL de tampon de la transformation à chaque puits et puis vortex les plaques pendant 1 min à 1 000 tr/min.</li>
	<li>Incuber les plaques à 30 ° C pendant 30 min et puis chauffer choc la levure en plaçant les plaques dans un incubateur à 42 ° C pendant 15 min. Remarque : Ne pas empiler les plaques.</li>
	<li>Centrifuger les plaques pendant 5 min à 3 000 x g. Retirer le tampon de la transformation des puits en inversant les plaques sur une poubelle et le dumping avec force la mémoire tampon des plaques. Rapidement, épongez les plaques inversées sur une serviette en papier propre pour enlever n’importe quel liquide sur le dessus des plaques.</li>
	<li>Rincer les cellules en ajoutant à la plaques 200 µL d’un minimum d’abandon moyen correspondant au marqueur sélectionnable sur le plasmide de bibliothèque. NOTE : Nous avons utilisé un Ura-milieu synthétique.</li>
	<li>Centrifuger les plaques pendant 5 min à 3 000 x g et éliminer le surnageant sur une poubelle comme au point 2.10.</li>
	<li>Ajouter 160 µL de minimes Ura-milieu contenant 2 % de glucose. Vortex les plaques pendant 1 min à 1 000 tr/min et les incuber à 30 ° C pendant 48 h sans agiter. Après 48 h, Notez qu’une pastille de levure transformée est visible au bas de chaque puits.</li>
	<li>À l’aide d’un distributeur de liquide, ajouter 100 µL de glucose contenant Ura-médias dans chaque cupule d’un nouvel ensemble de plaques de 96 puits.</li>
	<li>Vortex les plaques contenant de la levure transformée (de l’étape 2.13) à 1 000 tr/min pendant 30 s. à l’aide d’un réplicateur de 96 broches en plastique stérile, placez les chevilles dans les puits contenant de la levure transformée et puis leur inoculer dans les puits correspondants des nouvelles plaques rempli de médias. Le nouveau incuber à 30 ° C pendant 24 h. NOTE : Si vous travaillez avec 10 plaques, le milieu peut également être dispensé manuellement à l’aide de pipettes multicanaux.</li>
	<li>Après 24h, une pastille de levure doit être visible dans le fond de chaque puits contenant de la levure transformée avec succès. Pour enregistrer ces souches de levures dans les stocks de glycérol, ajouter 50 µL de glycérol à 50 % dans chaque puits, vortex les plaques pendant 30 s à 1 000 tr/min, sceller les plaques avec du ruban d’étanchéité et congeler à-80 ° C. Remarque : Les étapes ci-dessus suffit à être exécutée une fois. Futures projections de modèles différents de levure contre le même réservoir de réactif jetable de bibliothèque peuvent commencer provenant des stocks de glycérol et procéder immédiatement de la procédure ci-dessous.</li>
</ol>3. l’accouplement entre les cellules qui contiennent des gènes de la bibliothèque et de la levure de requête
<ol><li>Afin de raviver les souches de bibliothèque sur le stock de glycérol, prendre les plaques de 96 puits sortis du congélateur-80 ° C, retirez la bande d’étanchéité et laissez la levure décongeler à température ambiante pendant environ 30 min.</li>
	<li>Une fois que la levure a dégelé, utilisez un réplicateur de 96 broches en plastique stérile pour inoculer les stocks de glycérol à 160 µL de frais Ura-médias contenant 2 % de glucose en plaques 96 puits et les incuber à 30 ° C pendant 24 h. immédiatement après que les souches de bibliothèque sont utilisés , sceller les plaques avec bande d’étanchéité et les ramener au congélateur à-80 ° C.</li>
	<li>Le même jour, les souches de la bibliothèque (W303α) sont décongelés, inoculer la souche de levure de requête (en l’occurrence, FUS en W303a) à 50 mL de la DPJ et développez-le du jour au lendemain à 30 ° C sous agitation à 250 tr/min.</li>
	<li>Le lendemain, verser la souche de levure de requête à un réservoir de réactif jetable stérile et aliquote 160 µL de la souche de requête pour chaque puits d’une plaque 96 puits à l’aide d’une pipette multicanaux.</li>
	<li>Utilisation du distributeur de liquid, distribuer 160 µL des médias de la DPJ dans chaque puits de dix plaques de 96 puits. Utiliser ces plaques plus tard pour l’accouplement de la souche de levure de requête avec la levure de la bibliothèque.</li>
	<li>Brièvement, vortex la plaque à 96 puits contenant la souche de la requête, puis utilisez un réplicateur 96 broches stérile pour transférer la requête souche pour les plaques de la DPJ.</li>
	<li>Brièvement le vortex la bibliothèque plaques de la souche et, pour chaque plaque de souche de bibliothèque, utiliser un nouveau réplicateur de 96 broches stérile pour transférer les souches de bibliothèque pour les plaques de la DPJ qui ont été inoculés avec la souche de la requête. Remarque : Les cellules en glycérol perdent leur viabilité après plusieurs cycles de gel-dégel. Les souches de la bibliothèque de retour vers le stockage à long terme (congélateur à-80 ° C) dès que possible gardera la bibliothèque de bonne qualité et prêt pour une utilisation future. Bien entretenu, le stock de glycérol peut être congelé et décongelé au moins 10 fois. Nous recommandons également garder une copie de travail et des copies de sauvegarde de l’encours de glycérol. Lorsque le stock de travail ne fonctionne pas, immédiatement faire une nouvelle copie de travail de la copie de sauvegarde.</li>
	<li>Incuber les plaques de la DPJ à 30 ° C pendant 24 h. Note qu’une pastille de levure sera visible dans le fond de chaque puits après 24h.</li>
	<li>Plaques de remplissage 96 puits avec un support minimal d’abandon contenant 2 % raffinose, correspondant aux marqueurs sélectionnables sur le plasmide dans la souche de la requête ainsi que sur le plasmide de bibliothèque (par exemple, ici Ura - son-).</li>
	<li>Un réplicateur 96 broches stérile permet de transférer les levures de la DPJ accouplement des cultures à des milieux sélectifs. Incuber les plaques 96 puits à 30 ° C pendant 48 h ; uniquement les cellules qui ont jumelé de levure et diploïde formé des cellules et, donc, contiennent tous deux le plasmide de requête et le plasmide de bibliothèque sera capable de croître dans ce média. Après 2 jours, observer qu’un pellet est visible sur le fond des puits.</li>
</ol>4. dosage de spotting
<ol><li>
Après 48 h de croissance dans les milieux sélectifs contenant du raffinose, repérer les levures sur milieu gélosé.
	<ol>
<li>Préparer 2 jeux de plaques de Ura-His-abandon contenant 2 % d’agar à l’aide de plaques de polystyrène clair, un galactose contenant de 2 % et l’autre contenant 2 % de glucose.</li>
		<li>Plaques de Vortex le 96 puits pendant 1 min à 1 000 tr/min, puis repérer la levure aux plaques Ura-His-abandon contenant du galactose de 2 % et 2 % d’agar (gènes FUS et bibliothèque sont induits) et des plaques de Ura-His-abandon contenant 2 % de glucose et 2 % d’agar (gènes FUS et bibliothèque réprimée) utilisant une machine robotique de détachage, par lequel la culture de chacun est bien repérée sur les géloses en quatre exemplaires (p. ex., la culture en 1 bien est repérée à 4 taches sur la gélose).</li>
		<li>Après avoir repéré, laisser les géloses sécher et ensuite les placer à l’envers dans une étuve à 30 ° C. Photographier les géloses toutes les 24 h pour enregistrer une croissance plus rapide/plus levure dont la toxicité pour la souche de requête est sauvée ou d’enregistrer une croissance plus lente et moins dont la toxicité pour la souche de requête est exacerbée. Incuber les boîtes pendant 4 jours. Remarque : La culture dans chaque bien peut être repérée sur plaques de gélose 1-to-1, comme indiqué dans une précédente méthode axée sur la transformation10. Cependant, le 1 à 4 taches ici (ce qui peut être configuré facilement utiliser la machine robotisée détachage) augmente de manière significative la robustesse du dosage en réduisant le nombre de faux positifs. Hits positifs sont considérés uniquement lorsque toutes les 4 colonies du même bien montrent un phénotype similaire.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Dujon, B. A., Louis, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+diversity+and+evolution+in+the+budding+yeasts+%28Saccharomycotina%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome diversity and evolution in the budding yeasts (Saccharomycotina).</a> Genetics. 206 (2), 717-750 (2017).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous décrivons ici un protocole pour effectuer un écran de surexpression de plasmide dans la levure à l’aide de l’accouplement d’introduire de la bibliothèque de plasmide dans le modèle de la levure. En utilisant cette approche, plusieurs modèles de levure de toxicité de protéine maladies neurodégénératives peuvent projetés à l’aide de la même collection de levure transformée avec une bibliothèque de plasmide. Le laborieux processus de transformation ne doit être effectuée une seule fois, après quel levure très efficace ...

La levure Saccharomyces cerevisiae a été employé couramment dans la recherche scientifique fondamentale1 pour comprendre les processus cellulaires directement liés aux maladies humaines. En outre, il a été utilisé comme un organisme modèle pour étudier les protéines associées à la maladie humaines, telles que celles liées aux maladies neurodégénératives plus courants, y compris la maladie d’Alzheimer, de Parkinson, la maladie de Huntington et amyotrophique Latérale amyotrophique (SLA)2. Un avantage du modèle levure est la facilité avec laquelle un génome-large écran peut être effectué afin d’identifier des voies cellulaires liés à la toxicité des protéines liées à la maladie, ce qui donne un aperçu sur le mécanisme de leur toxicité. Un tel écran est appelé un écran Bibliothèque surexpression, dans lequel chacun des 5 500 gènes levure dans une bibliothèque qui se transforme en un modèle de levure pour identifier quels gènes peuvent modifier la toxicité lorsque surexprimés. Cette méthode de dépistage a été appliquée avec succès dans les modèles de la levure de multiples protéines associés à la maladie de neurodégénératives, y compris la huntingtine pour la maladie de Huntington3, α-synucléine pour la maladie de Parkinson4,5 , Bêta-amyloïdes de la maladie d’Alzheimer,6et FUS et TDP-43 ALS7,8,9. Alors qu’il est généralement fait dans une manière haut débit10, l’étape la plus fastidieuse de l’écran se transforme individuellement 5 500 gènes de levure d’une bibliothèque de rangées. Cette étape doit être exécutée chaque fois que la projection est répétée, et chaque fois qu’un modèle de levure nouvellement créé doit être étudié. Il est important de trouver un moyen plus efficace pour accomplir cette tâche.
Les cellules de levure peuvent exister stablement sous forme haploïde et diploïde. Il y a deux en face de l’accouplement des types de cellules haploïdes, l’accouplement de type a et α. cellules haploïdes de chaque croisement type produire et sécrètent leur propre phéromone accouplement spécifique, auxquels répondent seules les cellules de type sexuel opposé. Cela permet l’accouplement entre un et α des cellules pour produire des cellules diploïdes stables, a/α. Ce processus est spontanée et très efficace11. Nous pouvons tirer profit de ce cycle de vie unique de S. cerevisiae d’introduire de la bibliothèque de plasmide. Plus précisément, chaque gène dans la bibliothèque de plasmide déployèrent se transformeront en cellules haploïdes d’un type sexuel, c'est-à-dire, cellule α. Ces cellules contenant les gènes de la bibliothèque seront alors stockées en stock de glycérol dans un format de 96 puits rangé. Pour chaque modèle de levure qui doit être projeté, contenant les gènes de la bibliothèque de cellules de levure peuvent être décongelés sur le stock de glycérol, et le dépistage peut être effectué via l’accouplement avec le modèle de levures d’intérêt dans le type sexuel opposé, c'est-à-diretype sexuel un. Cette idée d’utiliser l’accouplement de réunir les deux gènes dans la levure n’est pas nouveau. Elle a été appliquée avec succès dans la levure de haut-débit dépistage-hybride, dans lequel un appât construire (p. ex.fusions de Gal4-DNA-binding domain) dans un seul type d’accouplement est réuni par accouplement avec une proie de construction d’une bibliothèque de rangées 12. Toutefois, cette stratégie n’a jamais été appliquée dans la surexpression bibliothèque de films, qui ont toujours utilisé les méthodes traditionnelles de transformation.
Notre laboratoire a déjà établi un modèle de la levure de la protéine associée aux ALS FUS7. Par le biais de criblage de surexpression en utilisant la méthode de transformation, nous avons découvert cinq gènes de la levure (ECM32, NAM8, SBP1, SKO1et VHR1) que sauver la toxicité du FUS lorsque surexprimés. Ces résultats ont été indépendamment confirmés avec une étude similaire réalisée par un autre groupe8. hUPF1, un homologue humain du ECM32, s’est avéré par la suite supprimer la toxicité des cellules neuronales primaires13 et dans un modèle animal de ALS14 établissements. À l’aide de ces cinq gènes comme preuve de principe, nous démontrons que tous les cinq gènes secourir de même toxicité FUS lorsqu’ils sont introduits dans le modèle de levure FUS par l’accouplement. Puisque les cellules de levure contenant les gènes de la bibliothèque peuvent être stockés en permanence en stock de glycérol et relancés chaque fois que nécessaire, cette méthode basée sur l’accouplement supprime la longue étape de transformation chaque fois que la bibliothèque doit être projeté contre. Étant donné que l’accouplement est très efficace avec aucune transformation de plasmide impliquée, cette stratégie diminue également de façon significative le coût associé à la purification et la transformation d’une bibliothèque de gros plasmide. Nous appliquerons avec succès cette méthode dans une bibliothèque de dépistage contre le modèle de la levure du FUS.
La procédure de dépistage basé sur l’accouplement est brièvement décrite à la Figure 1. Au départ, la bibliothèque du plasmide qui se transforme en une souche de levure haploïde de l’accouplement de type α, en utilisant un protocole de transformation de levure de haut-débit dans lesquels chaque puits d’une plaque 96 puits contient levure transformée avec un plasmide de bibliothèque spécifique. Cette collection de levure transformée est enregistrée comme un stock de glycérol qui peut être décongelé et relancé pour une utilisation plus tard. Le modèle de levures d’intérêt, dans cette affaire toxicité FUS, doit être généré dans une souche de levure haploïde avec le type sexuel opposé (type sexuel un). D’une manière de haut débit utilisant des réplicateurs de 96 broches stériles, le FUS souche souches de levure contenant la bibliothèque de plasmide transférés à plaques à 96 puits contenant des médias riches et sont autorisés pour s’accoupler. Après l’accouplement, un petit volume de chaque puits de la culture d’accouplement est transféré à plaques à 96 puits contenant des médias synthétiques d’abandon dans lequel levure uniquement diploïde contenant les deux Dug et gènes de bibliothèque peuvent se développer. Une machine robotisée tache sert ensuite de transférer la culture de levure de chaque puits, sur plaques de gélose, où l’expression des gènes Bibliothèque et FUS est induite.  En outre, culture de levure est repérée pour contrôler les boîtes de gélose où FUS et les gènes de bibliothèque ne sont pas exprimées. Après une croissance sur milieu gélosé, gènes de sauvetage ou d’aggravent la toxicité FUS seront identifiés.

<table><tbody><tr><td>ADN DE SPERMATOZOÏDE DE SAUMON (ADN SS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp ; D1626</td><td></td></tr><tr><td>YPD</td><td>Bouillon Research Products International (RPI)</td><td>Y20090</td><td></td></tr><tr><td>Gélose Fisher</td><td>Sci</td><td>BP97445</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>G32040</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Galactose</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>G33000</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Raffinose Pentahydrate</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>R20500</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate d’ammonium</td><td>Fisher Sci</td><td>A702-500</td><td></td></tr><tr><td>Ura- milieu de chute synthétique</td><td>Clontech</td><td>630416</td><td></td></tr><tr><td>Supplément d’acide aminé de levure -histidine/-uracil</td>, <td>Clontech</td><td>630422</td><td></td></tr><tr><td>base d’azote de levure sans acides aminés et sulfate d’ammonium</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>Y20060</td><td></td></tr><tr><td>Sulfoxyde de diméthyle (DMSO)</td><td>Fisher Sci</td><td>S67496</td><td></td></tr><tr><td>Acétate de lithium, anhydre</td><td>Fisher Sci</td><td>AC268640010</td><td></td></tr><tr><td>Polyéthylène glycol 3350 (PEG-3350)</td><td>Spectrum Chemical&nbsp ;</td><td>PO125-12KG</td><td></td></tr><tr><td>Réplicateur à 96 broches&nbsp ;</td><td>Scinomix</td><td>SCI-5010-OS</td><td></td></tr><tr><td>Nunc OmniTray</td><td>Thermo Sci</td><td>140156</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 96 plaque de dosage, fond rond avec couvercle</td><td>Fisher Sci</td><td>07-200-760</td><td>non traité, stérile</td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp ; Recherche plus Pipette multicanaux</td><td>Eppendorf</td><td>TI13690052</td><td>volume 30-300ul Fisherbrand</td></tr><tr><td>&nbsp ; Isotemp Bains secs/chauffe-moteurs numériques</td><td>Fisher Sci</td><td>88-860-023</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp ; MixMate</td><td>Eppendorf</td><td>21-379-00</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse Eppendorf 5810R</td><td>Fisher Sci</td><td>05-413-112</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse Avanti J-26 XPI</td><td>Beckman</td><td>393127</td><td></td></tr><tr><td>MultiFlo FX Distributeur multimode</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor HDA&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Instruments de</td><td></td><td></td> chanteur</tr></tbody></table>

criblage de surexpression axée sur l’accouplement chez la levure

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

La levure de bière a été largement utilisée comme un modèle dans l’étude des protéines associées à des maladies humaines. Génome-large dépistage génétique est un outil puissant couramment utilisé dans les études de levure. L’expression d’un certain nombre de protéines associés à la maladie neurodégénérative levure provoque la cytotoxicité et formation globale, récapitulant les résultats observés chez les patients atteints de ces troubles. Nous décrivons ici une méthode de dépistage d’un modèle de la levure de la protéine associée à la sclérose latérale amyotrophique FUS pour les modificateurs de sa toxicité. Au lieu d’utiliser la transformation, cette nouvelle plateforme de projection s’appuie sur l’accouplement de levure pour introduire une bibliothèque déployèrent des plasmides dans le modèle de levure. La méthode d’accouplement a deux avantages : Premièrement, il est très efficace ; Deuxièmement, la bibliothèque déployèrent préalablement transformée des plasmides peut être conservée pendant à long terme comme un stock de glycérol et rapidement appliquée aux autres écrans sans la fastidieuse étape de transformation dans le modèle de levure chaque fois. Nous montrons comment cette méthode peut être utilisée avec succès pour dépister les gènes qui modifient la toxicité du FUS.

La protéine associée aux ALS FUS, une protéine de liaison ARN/ADN, a été étudiée précédemment dans la levure haploïde7,8. Génétique de dépistage à l’aide de la méthode axée sur la transformation découvert plusieurs gènes de la levure qui suppriment la toxicité FUS. Plus tard, l’homologue humain de l’un des gènes de la levure a été démontrée efficace à réprimer la toxicité neuronale de cellules primaire et modèle de rat de ALS<sup ...

Cet article présente une méthode basée sur l’accouplement afin de faciliter le dépistage surexpression dans la levure de bière en utilisant une bibliothèque de plasmide rangés.

Criblage de surexpression axée sur l’accouplement chez la levure

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des maladies neurodégénératives, telles que les facteurs génétiques et les voies qui régulent la toxicité des protéines associées à la maladie. Le principal avantage de cette technique est que le processus très efficace d’accouplement de levure est utilisé pour cribler des modèles de levure contre une grande collection de gènes de banque. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la toxicité des protéines des maladies neurodégénératives, elle peut également être appliquée à l’étude d’autres processus cellulaires chez la levure, tels que la tolérance à d’autres conditions de stress.Commencez cette procédure en aliquotant cinq microlitres par puits d’ADN plasmidique à partir d’une bibliothèque de plasmides en réseau sur des plaques à fond rond de 96 puits. Gardez les assiettes à quatre degrés Celsius. Ensuite, inoculez 150 millilitres de peptone dextrose de levure ou de milieu YPD dans un flacon de 500 millilitres avec une colonie de la souche de levure haploïde W303 Alpha.Incuber la culture à 30 degrés Celsius en secouant à 200 tr/min pendant la nuit. Le lendemain matin, après avoir mesuré la DO 600 de la culture de nuit, diluez la culture à une DO 600 de 0,1 dans deux litres de YPD. Incuber à 30 degrés Celsius en secouant à 200 tr/min pendant environ cinq heures, jusqu’à ce que la culture atteigne une OD600 de 0,4 à 0,6.Pour récolter la culture de levure, remplissez huit bouteilles de centrifugeuse stériles de 250 millilitres et centrifugez à 3000 xG pendant 10 minutes à température ambiante. Versez le surnageant sans perturber la pastille. Lavez la levure comme décrit dans le protocole textuel et consolidez les cellules dans deux tubes à centrifuger.Remettre en suspension chaque pastille de cellule dans 25 millilitres d’une solution d’acétate de lithium à 0,1 molaire. Combinez les cellules remises en suspension, ajoutez cinq millilitres d’ADN de spermatozoïde de saumon et transférez-les dans une fiole de 150 millilitres. Incuber à 30 degrés Celsius en secouant à 225 tr/min pendant 30 minutes.Après 30 minutes, versez le mélange cellulaire dans un réservoir de réactif jetable stérile. À l’aide d’une pipette multicanaux, transférez 35 microlitres du mélange cellulaire dans chaque puits des plaques à 96 puits à fond rond, contenant la banque d’ADN plasmidique préparée précédemment. Vortex les plaques de 96 puits à 1000 tr/min pendant une minute.Incuber les plaques à 30 degrés Celsius sans secouer pendant 30 minutes. N’empilez pas les plaques, afin que la chaleur puisse être transférée plus efficacement. Retirez les plaques à 96 puits de l’incubateur à 30 degrés Celsius et mélangez-les à 1000 tr/min pendant 30 secondes.Ajoutez 125 microlitres de tampon de transformation dans chaque puits, puis faites tourbillonner les plaques à 1000 tr/min pendant une minute. Incuber les assiettes à 30 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, choquez la levure par la chaleur en plaçant les plaques dans un incubateur à 42 degrés Celsius pendant 15 minutes.Centrifugez les plaques à 3000 xG pendant cinq minutes. Retirez le tampon de transformation des puits en inversant les plaques au-dessus d’une poubelle et en déchargeant avec force le tampon des plaques. Épongez rapidement les plaques inversées sur une serviette en papier propre pour enlever tout liquide sur le dessus des assiettes.Rincez les cellules en ajoutant dans chaque puits, 200 microlitres de milieu de chute minimale correspondant au marqueur sélectionnable sur le plasmide de la banque. Le milieu synthétique ura minus est utilisé ici. Centrifugez les plaques à 3000 xG pendant cinq minutes.Retirez le surnageant au-dessus d’une poubelle comme indiqué précédemment. Ajoutez 160 microlitres de milieu ura minus, contenant 2 % de glucose dans chaque puits et vortex les plaques à 1000 tr/min pendant une minute. Incuber les plaques sans les secouer à 30 degrés Celsius pendant 48 heures.Au bout de 48 heures, une pastille de levure transformée doit être visible au fond de chaque puits. À l’aide d’un distributeur de liquide, ajoutez 100 microlitres de milieu ura moins contenant du glucose dans chaque puits d’un nouvel ensemble de plaques à 96 puits. Vortex les plaques contenant la levure transformée à 1000 tr/min pendant 30 secondes.À l’aide d’un réplicateur en plastique stérile à 96 broches, placez les broches dans les puits contenant la levure transformée, puis inoculancez-les dans les puits correspondants des nouvelles plaques remplies de milieu. Incuber les nouvelles plaques à 30 degrés Celsius pendant 24 heures. Après 24 heures, une pastille de levure devrait être visible au fond de chaque puits contenant de la levure transformée avec succès.Pour conserver ces souches de levure sous forme de stocks de glycérol, ajoutez 50 microlitres de glycérol à 50 % dans chaque puits, vortex les plaques à 1000 tr/min pendant 30 secondes, scellez les plaques avec du papier d’aluminium et congelez à moins 80 degrés Celsius. Pour raviver les souches de la bibliothèque à partir du stock de glycérol, sortez les plaques à 96 puits du congélateur à moins 80 degrés Celsius, retirez le papier d’aluminium et laissez la levure décongeler à température ambiante pendant environ 30 minutes. Une fois la levure décongelée, utilisez un réplicateur en plastique stérile à 96 broches pour inoculer les stocks de glycérol à 160 microlitres de milieu d’ura frais moins contenant 2 % de glucose dans des plaques à 96 puits et incuber à 30 degrés Celsius pendant 24 heures.Immédiatement après l’utilisation des souches de la bibliothèque, scellez les plaques et remettez-les dans le congélateur à moins 80 degrés Celsius. Le jour même où les souches de la bibliothèque sont décongelées, inoculez la souche de levure query dans 50 millilitres de YPD et cultivez-la à 30 degrés Celsius en secouant à 250 tr/min pendant la nuit. Le lendemain matin, versez la souche de levure query dans un réservoir de réactif stérile jetable et aliquote 160 microlitres de la souche query dans chaque puits d’une plaque de 96 puits.À l’aide du distributeur de liquide, distribuez 160 microlitres par puits de média YPD dans des plaques de 96 puits. Vortex brièvement les plaques à 96 puits contenant la souche query et les plaques de souche de la banque, puis utilisez un réplicateur stérile à 96 broches pour transférer les souches de la banque sur les plaques YPD qui ont été inoculées avec la souche query. Incuber les plaques YPD à 30 degrés Celsius pendant 24 heures.Après 24 heures, une pastille de levure sera visible au fond de chaque puits. Remplissez des plaques de 96 puits avec un milieu de rodage minimal contenant 2 % de Raffinose correspondant aux marqueurs sélectionnables sur le plasmide dans la souche de requête, ainsi que sur le plasmide de la bibliothèque. Utilisez un réplicateur stérile à 96 broches pour transférer la levure des cultures d’accouplement YPD vers le milieu sélectif.Incuber les plaques de 96 puits à 30 degrés Celsius pendant 48 heures. Seules les cellules de levure qui se sont accouplées et qui ont formé des cellules diploïdes et qui contiennent donc à la fois le plasmide de requête et le plasmide de banque pourront se développer dans ce milieu. Après 48 heures de croissance dans le milieu sélectif contenant du Raffinose, observez qu’une pastille est visible au fond des puits qui contiennent des cellules diploïdes.Vortex les plaques de 96 puits à 1000 tr/min pendant une minute. Utilisez une machine à détester robotisée pour repérer la levure sur des plaques de gélose en quatre exemplaires pour des plaques ura-his-droupout contenant 2 % de galactose et 2 % d’agar, et pour des plaques ura-his-droupout contenant 2 % de glucose et 2 % d’agar. Après le repérage, laissez sécher les plaques de gélose puis placez-les à l’envers dans un incubateur à 30 degrés Celsius pendant quatre jours.Toutes les 24 heures, photographiez les plaques de gélose pour enregistrer la croissance de la levure. La toxicité de la protéine FUS associée à l’ALS a été examinée pour la première fois chez des levures diploïdes. Comme l’indique la plaque de gélose contenant du galactose, qui induit le FUS, la toxicité du FUS est constante chez les levures diplod et haploïdes.Cinq gènes précédemment identifiés comme suppresseurs de la toxicité du FUS à partir d’une méthode basée sur la transformation ont été testés par la méthode d’accouplement. La première voie est une souche de levure témoin transformée avec deux vecteurs vides. La deuxième voie est la souche de levure diploïde FUS avec un vecteur vide où l’expression de FUS est très toxique.Les voies trois à sept montrent une levure diploïde exprimant FUS ainsi qu’un gène de suppression. Les cinq gènes sauvent la toxicité de FUS chez la levure diploïde, indiquant que la méthode d’accouplement était efficace. Cette méthode basée sur l’accouplement a ensuite été appliquée à un criblage de 940 gènes dans une banque de surexpression.Et une photo d’une plaque représentative est montrée. Comme indiqué sur la plaque de galactose, où FUS et les gènes de la banque sont exprimés, FUS était toxique pour la cellule de levure diplod. Le gène de la bibliothèque, indiqué par le carré vert, a sauvé la toxicité de FUS.Alors que le gène de la banque, indiqué par le carré rouge, a augmenté la toxicité. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 120 heures, si elle est exécutée correctement. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de vérifier au préalable que le phénotype utilisé pour le dépistage n’est pas dépendant du type d’accouplement haploïde.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’identifier les facteurs génétiques lors de la surexpression qui sauvent la toxicité des protéines associées à la maladie chez la levure. Après son développement, cette technique peut ouvrir la voie aux chercheurs dans le domaine des maladies neurodégénératives, pour explorer les mécanismes de cytotoxicité des protéines associées à la maladie dans le modèle de levure. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que le dosage de la bêta-galactosidase peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme si le sauvetage est spécifique.

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