Name: Analyse des N- glycans de Raphanus sativus Cultivars à l’aide de PNGase H+ (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Découvrez une méthode rapide d'analyse des N-glycanes chez Raphanus sativus sans changement de tampon. Cette technique simplifie la préparation enzymatique et la dérivatisation pour la glycoscience végétale.

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Ce travail a été soutenu en partie par la Fondation des sciences naturelles de Chine (accorder des numéros 31471703, A0201300537 et 31671854 à J.V. et L.L., octroyer le numéro 31470435 à G.Y.) et le Plan de Talents étrangers 100 (numéro de licence JSB2014012 à J.V.).

1. le prélèvement
<ol><li>Acheter différents cultivars de frais radis (Raphanus sativus L.).</li>
</ol>2. isolement des protéines de radis
<ol><li>Homogénéiser environ 100 g de radis frais avec un mixeur de cuisine pendant 10 min.</li>
	<li>Transférer la pâte dans un tube à centrifuger de 50 mL et centrifuger à 14 000 × g à 4 ° C pendant 20 min enlever la matière insoluble.</li>
	<li>Transvaser le surnageant soigneusement dans un nouveau tube de centrifuger de 50 mL et ajouter un volume égal de solution d’acide trichloracétique (TCA) de 2 M. NOTE : Ajout des TCA précipitera soluble (glyco) protéines.</li>
	<li>Centrifuger à 14 000 × g à 4 ° C pendant 30 min et retirez le surnageant des granulés (glyco) protéines.</li>
	<li>Laver le culot avec 20 mL d’eau désionisée et centrifuger à 14 000 × g à 4 ° C pendant 5 min éliminer les polysaccharides et oligosaccharides solubles.</li>
	<li>Répétez l’étape 2.5. quatre fois.</li>
	<li>Remettre en suspension les boulettes dans 1 mL d’eau désionisée et transfert dans un tube à centrifuger fraîches 1,5 mL.</li>
</ol>3. préparation des N- Glycans
<ol><li>Mélanger 50 µL de solution protéique de l’étape 2.7. (égal à 5 g de radis frais) avec 0,2 mU de recombinaison PNGase H+ dans l’acide acétique 10 mM.</li>
	<li>Incuber le mélange réactionnel à 37 ° C pendant 12 h. Après l’incubation, centrifuger à 14 000 x g pendant 5 min retirer le supplément de protéines et enzymes.</li>
	<li>Transférer le surnageant dans un tube à centrifuger fraîches 1,5 mL.</li>
</ol>4. la purification des N- Glycans
<ol><li>Préparer la colonne d’extraction en phase solide (SPE) pour enrichir les N- glycanes et retirer les sels et les autres impuretés du mélange réactionnel, accroître la sélectivité de le fluorogène 2-aminobenzamide (2-AB) étiquetage agent N- glycane dérivatisation.<ol>
<li>Ajouter 3 mL d’eau désionisée pour laver la colonne.</li>
		<li>Ajouter 3 mL de solution à 80 % d’acétonitrile contenant de l’acide trifluoroacétique (TFA, 0,1 % v/v) d’active la SPE-colonne.</li>
		<li>Ajouter 3 mL d’eau désionisée s’équilibrer la SPE-colonne.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transférer l’échantillon de l’étape 3.3 sur la colonne et jeter le cheminement.</li>
	<li>Ajouter 1,5 mL d’eau désionisée pour laver la colonne et éliminer les intermédiaires.</li>
	<li>Éluer les N- glycanes libérés de la colonne à l’aide de 1,5 mL de solution aqueuse de 20 % d’acétonitrile, contenant 0,1 % TFA (v/v) dans un tube à centrifuger 2 mL.</li>
	<li>Éliminer le solvant par évaporation centrifuge à température ambiante. Évaporer jusqu'à ce que l’échantillon soit complètement sec.</li>
</ol>5. fluorescence dérivatisation de N- Glycans
<ol><li>Préparer 1 mL de solution 2-AB, composé de 35 mM 2-AB et 0,1 M cyanoborohydrure de sodium en solution acide acétique/sulfoxyde de diméthyle (7:3, v/v).</li>
	<li>Ajouter 5 µL de solution de 2-AB pour les échantillons séchés (étape 4.5.) provenant de six différents radis. Vortex chaque échantillon jusqu'à ce que complètement dissous.</li>
	<li>Incuber le mélange pendant 2 h à 65 ° C.</li>
	<li>Laisser refroidir les échantillons à température ambiante pendant 5 min et ajouter 5 µL d’eau désionisée et 40 µL d’acétonitrile. Centrifuger les tubes à 14 000 x g pendant 3 min.</li>
	<li>Transférer 48 µL du surnageant dans un flacon HPLC d’haute-récupération 300 µL. Stocker les dérivés N- glycanes échantillons à-20 ° C pour environ un mois.</li>
</ol>6. HILIC-UPLC profilage des N- glycans
<ol><li>Analyser les échantillons en utilisant un système standard de UPLC relié à un detectorset de fluorescence en ligne à la longueur d’onde d’excitation/émission de 330 nm/420 nm, respectivement.</li>
	<li>Utiliser une chromatographie liquide hydrophobe (HILIC)-colonne de glycane UPLC à une température de 60 ° C pour l’analyse de la colonne.</li>
	<li>Préparer le solvant A diluer 50 mL de solution (solution de formiate d’ammonium 1 M, pH 4,5) 950 ml de liquide chromatographie spectrométrie de masse (LCMS)-qualité de l’eau. Préparer la solution comme suit :<ol>
<li>Ajouter 43 mL d’acide formique à 700 mL de LCMS-grade H2O.</li>
		<li>Ajuster le pH à 4,5 par addition de goutte à goutte de la solution aqueuse d’ammoniaque (25 % p/p).</li>
		<li>Transférer le solvant dans une éprouvette graduée et remplissez-le à 1000 mL LCMS-grade H2O. magasin à 4-6 ° C pendant 3 mois.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utiliser le LCMS-grade acétonitrile comme solvant B.</li>
	<li>N- glycans se séparent avec l’élution gradient suivante :<ol>
<li>Commencez par ajouter des 95 % de solvant B en solvant A. régler le débit à 0,5 mL/min de 0 à 44,5 min.</li>
		<li>De 0 min à 6 min, diminuer progressivement la proportion du solvant B % to78 dégradé linéaire.</li>
		<li>De 6 min à 44,5 min, diminuer progressivement la proportion du solvant B avec un dégradé linéaire à 55,9 %.</li>
		<li>De 44,5 min min 46,5, rapidement diminuer la proportion du solvant B avec un dégradé linéaire de 55,9 % à 0 % et tenir à 0 % pendant 2 min et lancer le lavage de la colonne. Réduire la vitesse d’écoulement de 44,5 à 0,25 mL/min à 55 min.</li>
		<li>Laver la colonne plus loin en augmentant de solvant B à 95 % de 48,5 min à 50,5 min et tenir à 95 % pour 4,5 min.</li>
		<li>Rééquilibrer la colonne pour les conditions initiales de 95 % de solvant B à 0,5 mL/min de 50,5 à 57 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injecter 45 µL de l’échantillon dans le système de l’UPLC.</li>
	<li>Éluer les N- glycanes par UPLC avec des temps de rétention entre 15 et 40 min.</li>
	<li>Collecter chaque fraction de pic UPLC observée à l’aide de tubes à centrifuger 2 mL et sécher les échantillons par évaporation centrifuge.</li>
	<li>Injecter environ 1 pmol de 2-AB étiqueté dextran standard (unités de glucose 2−20) pour calibrer la plante -N- glycanes profilage et d’attribuer leur temps d’élution en unités glucose normalisés.</li>
</ol>7. MALDI-TOF MS Analysis
<ol><li>Dissoudre des échantillons provenant d’étape 6,8 à 5 µL de LCMS-qualité de l’eau. Mélanger 1 µL de la solution d’échantillon et 1 µL de solution (ATT) (0,3 % p/v dans l’acétonitrile aqueuse 70 % v/v) 6-aza-2-thymine et la pipette le mélange sur le porte-échantillon de MALDI-TOF.</li>
	<li>Analyse des échantillons à l’aide d’un instrument de spectromètre de masse MALDI-TOF en mode ions positifs en appuyant sur le bouton Démarrer .</li>
	<li>Analyser les spectres de masse en utilisant le logiciel d’analyse de MALDI-TOF-MS qui l’accompagne.</li>
	<li>Interpréter les spectres à l’aide d’une source ouverte glycane interprétation logiciel19. Définissez les paramètres de recherche pour 2-AB, étiquetage, [M + Na]+et définissez le paramètre de précision Da 2.0.</li>
</ol>

<ol><li>Altmann, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17033195">The Role of Protein Glycosylation in Allergy.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 142 (2), 99-115 (2007).</li>
<li>Van Ree, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2+%281%2C+2%29-xylose+and+%CE%B1+%281%2C+3%29-fucose+residues+have+a+strong+contribution+in+IgE+binding+to+plant+glycoallergens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">β (1, 2)-xylose and α (1, 3)-fucose residues have a strong contribution in IgE binding to plant glycoallergens.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (15), 11451-11458 (2000).</li>
<li>Biswas, H., Chattopadhyaya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+Curcuma+longa+rhizome+lectin%3A+Role+of+N-linked+glycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Stability of Curcuma longa rhizome lectin: Role of N-linked glycosylation.</a> Glycobiology. 26 (4), 410-426 (2016).</li>
<li>Lefebvre, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+N-glycosylation+sites+and+CXC+motifs+in+trafficking+of+Medicago+truncatula+Nod+factor+perception+protein+to+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Role of N-glycosylation sites and CXC motifs in trafficking of Medicago truncatula Nod factor perception protein to plasma membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (14), 10812-10823 (2012).</li>
<li>Severino, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+glycan+moiety+on+the+structure-function+relationships+of+PD-L1%2C+type+1+ribosome-inactivating+protein+from+P.+dioica+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+BioSystems%22%5BJournal%5D)">The role of the glycan moiety on the structure-function relationships of PD-L1, type 1 ribosome-inactivating protein from P. dioica leaves.</a> Molecular BioSystems. 6 (3), 570-579 (2010).</li>
<li>Lige, B., Ma, S., Van Huystee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+the+site-directed+removal+of+N-glycosylation+from+cationic+peanut+peroxidase+on+its+function%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">The effects of the site-directed removal of N-glycosylation from cationic peanut peroxidase on its function.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 386 (1), 17-24 (2001).</li>
<li>Ceriotti, A., Duranti, M., Bollini, R. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/jxb/article/49/324/1091/481062">Effects of N-glycosylation on the folding and structure of plant proteins.</a> Journal of Experimental Botany. 49 (324), 1091-1103 (1998).</li>
<li>Kamerling, J. P., Gerwig, G. J. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/46698050_Strategies_for_the_Structural_Analysis_of_Carbohydrates">Strategies for the Structural Analysis of Carbohydrates.</a> Comprehensive Glycoscience. , 1-68 (2007).</li>
<li>Huang, Y., Mechref, Y., Novotny, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+nonreductive+release+of+O-linked+glycans+for+subsequent+analysis+through+MALDI+mass+spectrometry+and+capillary+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Microscale nonreductive release of O-linked glycans for subsequent analysis through MALDI mass spectrometry and capillary electrophoresis.</a> Analytical Chemistry. 73 (24), 6063-6069 (2001).</li>
<li>Triguero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+enzymatic+N-glycan+release+comparison+for+N-glycan+profiling+of+monoclonal+antibodies+expressed+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chemical and enzymatic N-glycan release comparison for N-glycan profiling of monoclonal antibodies expressed in plants.</a> Analytical Biochemistry. 400 (2), 173-183 (2010).</li>
<li>Tretter, V., Altmann, F., Marz, L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1868849">Peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase F cannot release glycans with fucose attached α1 → 3 to the asparagine-linked N-acetylglucosamine residue.</a> European Journal of Biochemistry. 199 (3), 647-652 (1991).</li>
<li>Fan, J. -Q., Lee, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+studies+on+substrate+structure+requirements+of+glycoamidases+A+and+F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Detailed studies on substrate structure requirements of glycoamidases A and F.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 27058-27064 (1997).</li>
<li>Altmann, F., Paschinger, K., Dalik, T., Vorauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+peptide-N4-%28N-acetyl-%CE%B2-glucosaminyl%29asparagine+amidase+A+and+its+N-glycans%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterisation of peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase A and its N-glycans.</a> European Journal of Biochemistry. 252 (1), 118-123 (1998).</li>
<li>Altmann, F., Schweiszer, S., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+comparison+of+peptide%3A+N-glycosidases+F+and+A+reveals+several+differences+in+substrate+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+Journal%22%5BJournal%5D)">Kinetic comparison of peptide: N-glycosidases F and A reveals several differences in substrate specificity.</a> Glycoconjugate Journal. 12 (1), 84-93 (1995).</li>
<li>Wang, T., Voglmeir, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PNGases+as+valuable+tools+in+glycoprotein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+and+Peptide+Letters%22%5BJournal%5D)">PNGases as valuable tools in glycoprotein analysis.</a> Protein and Peptide Letters. 21 (10), 976-985 (2014).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+characterization+of+a+novel+extremely+acidic+bacterial+N-glycanase+with+combined+advantages+of+PNGase+F+and+A%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Discovery and characterization of a novel extremely acidic bacterial N-glycanase with combined advantages of PNGase F and A.</a> Bioscience Reports. 34 (6), 00149(2014).</li>
<li>Du, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+sample+preparation+methodology+for+plant+N-.glycan+analysis+using+acid-stable+PNGase+H%2B%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid sample preparation methodology for plant N-.glycan analysis using acid-stable PNGase H+.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (48), 10550-10555 (2015).</li>
<li>Wang, T., Hu, X. -C., Cai, Z. -P., Voglmeir, J., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+and+Quantitative+Analysis+of+Carbohydrate+Modification+on+Glycoproteins+from+seeds+of+Ginkgo+biloba%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Qualitative and Quantitative Analysis of Carbohydrate Modification on Glycoproteins from seeds of Ginkgo biloba.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (35), 7669-7679 (2017).</li>
<li>Ceroni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GlycoWorkbench%3A+a+tool+for+the+computer-assisted+annotation+of+mass+spectra+of+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">GlycoWorkbench: a tool for the computer-assisted annotation of mass spectra of glycans.</a> Journal of Proteome Research. 7 (4), 1650-1659 (2008).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le protocole que nous avons présenté ici permet la comparaison des profils N- glycanes de diverses variétés de radis. Un avantage important de cette méthode par rapport aux protocoles existants, c’est qu’aucun changement de tampon entre la libération enzymatique de N- glycanes et la réaction de dérivatisation avec 2-AB n’est requises. L’étape la plus critique de cette procédure est la purification des N- glycans utilisant la colonne SPE, comme un échec pour enlever les sels ou autres impuretés ...

N- glycanes chez les plantes ont attiré l’attention accrue ces dernières années, que des recherches antérieures a souligné N- glycans comme une source potentielle des réactions immunologiques croisées qui peut provoquer des réactions allergiques1,2 . Il a été démontré précédemment que N- glycans sur les glycoprotéines de la plante peut affecter l’activité catalytique3,4, thermostabilité et pliage5,6 ou localisation subcellulaire et 7de sécrétion. Afin de corréler les structures glycane avec leurs fonctions respectives, N- glycans doit être sorti des glycoprotéines chimiquement ou par voie enzymatique. La méthode chimique classique pour libérer les deux N- et O- glycanes est β-élimination, dans lequel traitement alcalin échantillon est accompagnée de réduction avec le borohydrure de céder un alditol8. Toutefois, cette procédure empêche marquage avec un fluorophore et provoque le carie importante d’unités monosaccharide de l’extrémité réductrice de la structure de glycane. Déglycosylation chimique basée sur le traitement de l’hydroxyde d’ammonium/carbonate est également une méthode alternative couramment utilisés9. Aucune de ces méthodes de libération chimique dégrade des protéines intactes, qui permet l’analyse par spectrométrie de masse de glycane non-marqué piscines sans l’interférence des fragments peptidiques dans la même gamme de masse. Cependant, un inconvénient de ces méthodes est le taux de dégradation accrue de α1, 3-fucosylées N- glycans, une structure commune d’hydrates de carbone trouvé dans plantes10. Par ailleurs, les méthodes de libération enzymatique à l’aide de peptide :N- glycanases (PNGases, EC 3.5.1.52) sont également largement utilisés. Recombinant PNGase F (à partir de Flavobacterium meningosepticum) est le choix le plus courant et permet la libération de tous les types de N- glycanes, sauf les structures portant un noyau α1, 3 fucose11,12. Par conséquent, PNGase A (isolés des graines d’amandes) est habituellement utilisé pour l’analyse des plantes N- glycans13. Toutefois, cette enzyme deglycosylates seulement clivage protéolytique dérivé de glycopeptides et est incapable de déglycosyler natif de glycoprotéines14. Par conséquent, un bilan de plusieurs étapes échantillon est nécessaire avant analyse plus approfondie, ce qui provoque une perte importante de glycanes, en particulier ceux de faible abondance,15. L’objectif global de la méthode est de présenter un flux de travail optimisé pour la libération de N- glycanes et fluorescence d’étiquetage de manière simple et robuste. Le raisonnement sous-jacent est que PNGase H+, ce qui a été récemment découvert chez Terriglobus roseus et peut être inoculation exprimée chez e. coli, peut hydrolyser N- glycans directement à partir de l’échafaudage de protéines en acides conditions16. Un avantage clé de l’utilisation de PNGase H+ sur des méthodes alternatives, c’est que les réactions de marquage fluorescentes peuvent être effectuées dans le même tube de réaction sans modifier la réaction tampons17,18. Les conditions de préparation simple et une récupération élevée des oligosaccharides de faible abondance font de cette méthode un outil précieux dans l’analyse des N- glycans. Ce protocole est adapté pour l’analyse des N- glycans de diverses espèces végétales.

<table><tbody><Acide trichloracétique <tr><td></fort>></td><td></td><td></td><td></td></tr> fort<tr><td>&nbsp ;</td><td>SCR, Shanghai</td><td>80132618</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique glacial</td><td>Huada, Guangzhou</td><td>64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>Acétonitrile</td><td>Réactif général</td><td>G80988C</td><td></td></tr><tr><td>Acide trifluoroacétique</td><td>Énergie chimique</td><td>W810031</td><td></td></tr><tr><td>2-aminobenzamide</td><td>Heowns, Tianjin</td><td>A41900</td><td></td></tr><tr><td>Cyanoborohydrure de sodium</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>314162</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Huada, Guangzhou</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Échelle de dextran marquée 2AB, 200 pmol</td><td>Agilent Technologies</td><td>AT-5190-6998</td><td></td></tr><tr><td>6-Aza-2-thiothymine&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>275514</td><td></td></tr><tr><td>Outils/Matériaux :</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mélangeur de cuisine</td><td>Bear, Guangzhou</td><td>LLJ-A10T1</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Techcomp</td><td>CT15RT</td><td></td></tr><tr><td>Évaporateur centrifuge</td><td>Hualida, Taicang</td><td>LNG-T120</td><td></td></tr><tr><td>Colonne SPE</td><td>Supelco</td><td>Supelclean ENVI Carb SPE</td><td></td></tr><tr><td>Spectromètre de masse MALDI-TOF</td><td>Bruker</td><td>Autoflex</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Analyse :</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flacon HPLC à haute récupération</td><td>Agilent Technologies</td><td>&nbsp ;# 5188-2788</td><td></td></tr><tr><td>Système HPLC</td><td>Shimadzu</td><td>Nexera</td><td></td></tr><tr><td>Détecteur de fluorescence pour HPLC</td><td>Shimadzu</td><td>RF-20Axs&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Four à colonne</td><td>Hengxin</td><td>CO-2000</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Colonne Waters</td><td>Acquity UPLC BEH colonne glycane</td><td>2.1 &times ; 150 mm, 1.7 &mu ; Eau</td></tr> de <tr><td>qualité LCMS</td><td>Merck Millipore</td><td>#WX00011</td><td></td></tr><tr><td>Acétonitrile de qualité LCMS</td><td>Merck Millipore</td><td># 100029</td><td></td></tr><tr><td>Acide formique</td><td>Aladdin</td><td>F112034</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’ammoniac</td><td>Aladdin</td><td>A112080</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse des n- glycans de raphanus sativus cultivars à l’aide de pngase h+

Analysis of N-glycans from Raphanus sativus Cultivars Using PNGase H+

Ces dernières années, les fractions glucidiques de plantes ont reçu une attention considérable, car ils sont une source potentielle de la réponse immunitaire croisée, provoquant des allergies. En outre, structures glucidiques jouent également un rôle essentiel dans le métabolisme de la plante. Nous présentons ici une méthode simple et rapide pour la préparation et l’analyse des N- glycans de différents cultivars de radis (Raphanus sativus) à l’aide d’un N- glucanase spécifique pour la libération des structures végétales glucidiques. Pour y parvenir, brute de l’acide trichloroacétique précipités des homogénats de radis ont été traitées avec PNGase H+et étiquetées à l’aide de 2-aminobenzamide comme une balise fluorescente. Étiqueté N- glycanes échantillons ont été analysés par la suite par séparation par chromatographie liquide (UPLC) ultra performant et laser assistée par matrice desorption ionisation-temps de spectrométrie de masse (MALDI-TOF) de vol pour une structure détaillée évaluation et quantification relatives abundancies des N- glycanes structures dérivées de radis. Ce protocole peut également être utilisé pour l’analyse des N- glycans de diverses autres espèces végétales et peut-être être utile pour une enquête plus approfondie de la fonction et les effets des N- glycans sur la santé humaine.

La figure 1 montre un aperçu schématique du protocole décrit, notamment l’isolement des protéines (glyco-) de radis, la préparation des N- glycans, l’analyse de l’UPLC et l’analyse de MALDI-TOF-MS de ces composants. La figure 2 montre les chromatogrammes UPLC représentatifs de dérivés N- glycans des cultivars radis analysées. La figure 3 montre les résultats obtenus des 2AB-dérivati...

Nous décrivons une méthode simple et rapide pour la préparation et l’analyse des N- glycans de différents cultivars de radis (Raphanus sativus).

Analyse des N- glycans de Raphanus sativus Cultivars à l’aide de PNGase H+

In recent years, the carbohydrate moieties of plants have received considerable attention, as they are a potential source of cross-reactive, ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions dans le domaine de la glycoscience végétale, telles que la façon dont les N-glycanes d’origine végétale peuvent être rapidement analysés et caractérisés. Le principal avantage de cette technique est qu’elle ne nécessite aucun changement de tampon entre la libération enzymatique de N-glycanes et les réactions de dérivatisation avec le 2-aminobenzamide. La démonstration de la procédure sera Mlle Ya-Min Du et Mlle Shen-Li Zhen ; deux étudiants diplômés du Centre de recherche en bio-ingénierie de la glycomique et des glycanes de l’Université agricole de Nanjing.Pour commencer à isoler les protéines, utilisez un mixeur de cuisine pour homogénéiser environ 100 grammes de radis frais pendant dix minutes. Transférez la boue obtenue dans un tube à centrifuger de 50 millilitres. Centrifuger à 14 000 fois la gravité à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes pour éliminer le matériau insoluble.Après cela, transférez soigneusement le surnageant dans un nouveau tube à centrifuger de 50 millilitres. Ajouter une quantité égale d’une solution d’acide trichloracétique à deux molaires. Centrifugeuse à 14 000 fois la gravité à quatre degrés Celsius

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Biochimie

Nous décrivons une méthode pour l'analyse de l'altération des N-glycanes par le début de la vie des glycoprotéines après leur biosynthèse dans les cellules de mammifères. Ceci est réalisé par pulse-chase analyse des glycanes métaboliquement étiquetés, libération enzymatique des glycoprotéines et l'examen par HPLC.

Pulse-chase Analyse des chaînes de sucre N-glycoprotéines liées à des cellules de mammifères

Un moyen rapide est décrite afin de mieux connaître la structure des polysaccharides dans une matrice extracellulaire. La méthode tire parti de la spécificité de glycosylhydrolases et la sensibilité de la spectrométrie de masse permettant d'infimes quantités de matériaux à analyser. Cette technique est adaptable pour être utilisé directement sur le tissu lui-même.

Profilage de masse Oligo (OLIMP) de polysaccharides extracellulaires

Utiliser glycosidases spécifiques pour éliminer les sucres de glycoprotéines suivi par SDS-PAGE est une méthode utile pour détecter des modifications glycane sur des échantillons de protéines et est un bon choix pour des études glycobiologie initiale. Les changements suivants déglycosylation peuvent être détectés comme des changements dans la mobilité de gel ou par coloration avec glycane réactifs sensibles.

Identification et caractérisation des glycosylation des protéines spécifiques en utilisant des endo-et exoglycosidases

Profilage Glycan des polymères végétaux de la paroi cellulaire en utilisant Microarrays

Un protocole à haut débit a été développé pour la purification combinée de la protéomique et de la glycomique et la quantification LC-MS/MS dans le plasma. L’analyse par désamidation des motifs de glycosylation liés à l’azote était spécifique aux sites déglycosylés. Une quantification précise des N-glycanes a été obtenue en couplant la séparation des N-glycanes assistée par filtre à la normalisation de l’individualité lors du marquage avec la stratégie de marquage avec des marqueurs d’hydrazide...

A Quantitative Glycomics et protéomique Stratégie Purification Combined

Cet article présente une forme améliorée d’une nouvelle technique de glycomique ascendante conçue pour analyser le profil de composition groupé des glycanes dans les biofluides non fractionnés par la décomposition chimique des glycanes en leurs monosaccharides spécifiques de liaison constitutive pour la détection par GC-MS. Les applications potentielles comprennent la détection précoce du cancer et d’autres troubles glycanes-affectifs.

Glycan Analyse Node: une approche bottom-up à Glycomics

Un protocole pour l’analyse structurale des polysaccharides par électrophorèse sur gel (APCE), à l’aide de mannane à titre d’exemple, est décrite.

Caractérisation des Polysaccharides pariétaux Mannan chez les plantes à l’aide de rythme

Immunoglobulin G (IgG) N-glycanest caractérisé en utilisant la chromatographie d'interaction hydrophile UPLC. En outre, la structure de IgG N-glycan est clairement séparée. Présenté ici est une introduction à cette méthode expérimentale afin qu'il puisse être largement utilisé dans les milieux de recherche.

Immunoglobuline G N-Glycan Analysis par Ultra-Performance Liquid Chromatography

Le profilage des polymères par puces à ADN (MAPP) est une technique à haut débit pour l’analyse de la composition des glycanes dans les échantillons biologiques.

Profilage des polymères par puce à ADN (MAPP) pour l’analyse des glycanes à haut débit

Nous présentons ici un protocole détaillé pour la libération d’O-glycanes à partir des mucines, ainsi que le dessalage, la perméthylation et l’analyse ultérieurs à l’aide de la spectrométrie de masse MALDI-TOF.

Profilage des O-glycanes de mucine perméthylée à l’aide de la spectrométrie de masse à temps de vol par désorption/ionisation laser assistée par matrice

Découvrez une méthode rapide d'analyse des N-glycanes chez Raphanus sativus sans changement de tampon. Cette technique simplifie la préparation enzymatique et la dérivatisation pour la glycoscience végétale.

Analyse des N- glycans de Raphanus sativus Cultivars à l’aide de PNGase H⁺

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