Forcé de Salivation comme une méthode pour analyser la compétence vectorielle de moustiques
7 août 2018
Pour un contrôle efficace des moustiques, la charge de la transmission du virus, la connaissance du potentiel vecteur de moustiques respectifs est particulièrement intéressant. Nous décrivons la salivation forcée comme une méthode pour analyser la compétence vectorielle d’Aedes albopictus et trois différents taxons de Culex pour la transmission du virus Zika.
Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des maladies transmises par les moustiques, par exemple si une espèce de moustique est un vecteur compatible d’un certain virus. Le principal avantage de cette méthode est qu’une grande quantité de moustiques peut être analysée simultanément, sans l’utilisation d’animaux de laboratoire comme les souris. Généralement, les personnes novices dans cette méthode auront du mal car elle nécessite des capacités de motricité fine qui ne peuvent être acquises que par la pratique.
La démonstration visuelle de cette technique est essentielle, car les étapes clés sont difficiles à apprendre ; Ils nécessitent de l’expérience dans la manipulation des moustiques et des virus, ainsi que de la motricité fine. Pour commencer, diluez le stock de virus. Ensuite, mélangez du sang humain périmé avec du fructose, du sérum bovin filtré et le stock de virus.
Congelez 140 microlitres de mélange de farine de sang pour une analyse plus approfondie via TCID50. Ensuite, mettez deux gouttelettes de 50 microlitres du mélange de farine de sang dans un flacon en plastique et laissez les moustiques se nourrir pendant deux heures. Après avoir anesthésié les moustiques, comptez les individus complètement engorgés et transférez-les dans un nouveau flacon contenant un coton imbibé de fructose.
Ensuite, maintenez les moustiques à 27 degrés Celsius et 80 % d’humidité pendant 14 ou 21 jours. Réapprovisionnez les cotons saturés de fructose toutes les 72 heures avec 1,5 millilitre de fructose. Tout d’abord, ensemencez 20 000 cellules Vero par puits dans une plaque de 96 puits avec un milieu de croissance supplémenté.
Pour préparer l’appareil de salivation, placez une plaque de verre carrée sur le banc à un angle de 30 degrés. Ensuite, collez du ruban adhésif double face sur le dessus de la plaque de verre. Ensuite, roulez la pâte à modeler jusqu’à ce qu’elle ait un diamètre de 0,5 centimètre et fixez-la à la plaque horizontalement à un centimètre du ruban adhésif double face.
Coupez les pointes du nombre requis d’embouts filtrants de 10 microlitres et remplissez chaque embout avec 10 microlitres de PBS. Ensuite, placez les pointes sur la pâte à modeler et fixez-les avec une légère pression. Ensuite, immobilisez les moustiques en leur enlevant les pattes et les ailes.
Fixez les moustiques sur le ruban adhésif au-dessus des pointes du filtre. Placez délicatement la trompe de chaque moustique dans un embout filtrant. Après 30 minutes, retirez les pointes du filtre et jetez l’argile et le ruban adhésif.
Transférez la salive recueillie dans des tubes de réaction contenant 10 microlitres de PBS. Mélangez doucement la salive et le PBS et transférez le mélange dans les puits d’une plaque à 96 puits. Incuber la plaque pendant sept jours à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.
À l’aide d’un microscope optique, vérifiez que les cellules ne présentent pas d’effet cytopathique. Une fois qu’un puits est positif pour l’effet cytopathique, utilisez une pipette pour prélever 140 microlitres de surnageant. Ensuite, transférez le surnageant dans un tube à réaction.
Ensuite, mélangez 140 microlitres de surnageant avec 560 microlitres de tampon AVL et incubez pendant 10 minutes à température ambiante. Enfin, ajoutez 560 microlitres d’éthanol et retournez l’échantillon pour mélanger. À l’aide de ce protocole, plusieurs espèces de moustiques ont été testées pour l’infection et la transmission du virus Zika dans diverses conditions climatiques.
Dans des conditions d’incubation de 27 degrés Celsius, toutes les espèces d’Aedes présentaient une salive positive au virus Zika. À l’inverse, aucun des échantillons de salive des taxons Culex ne contenait de preuve de la présence du virus. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée pour 50 moustiques en une heure si elle est correctement exécutée.
Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer des expériences de salivation forcée. N’oubliez pas que travailler avec des moustiques infectés peut être très dangereux, c’est pourquoi des mesures de sécurité spéciales pour la manipulation des moustiques dans des conditions BSA-3 doivent toujours être prises lors de la réalisation de toute expérience.
Aperçu
Cet article traite d'une méthode pour analyser la compétence vectorielle des moustiques, spécifiquement Aedes albopictus et divers taxa de Culex, pour la transmission du virus Zika. La technique de salivation forcée permet l'analyse simultanée de plusieurs moustiques sans utilisation d'animaux de laboratoire.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie des vecteurs
- Virologie
- Maladies transmises par les moustiques
Contexte
- Comprendre la compétence vectorielle est crucial pour contrôler les virus transmis par les moustiques.
- La salivation forcée est une méthode nouvelle pour évaluer le potentiel de transmission des moustiques.
- Les méthodes précédentes nécessitaient souvent des animaux de laboratoire, ce que cette technique vise à éliminer.
- Les compétences en motricité fine sont essentielles pour cette méthode, nécessitant de la pratique et de l'expérience.
Objectif de l'étude
- Évaluer la compétence vectorielle de différentes espèces de moustiques pour le virus Zika.
- Démontrer une méthode permettant une analyse à haut débit de la salive des moustiques.
- Fournir un guide visuel pour les chercheurs novices dans la technique.
Méthodes utilisées
- Préparation d'un mélange de repas sanguin pour l'alimentation des moustiques.
- Technique de salivation forcée pour recueillir la salive des moustiques.
- Méthodes de culture cellulaire pour évaluer la présence du virus Zika.
- Incubation et analyse des échantillons pour les effets cytopathogènes.
Résultats principaux
- Les espèces d'Aedes ont montré une salive positive pour le virus Zika dans des conditions contrôlées.
- Les taxa de Culex n'ont pas présenté de preuves de virus Zika dans leur salive.
- La méthode permet de tester jusqu'à 50 moustiques en une heure une fois maîtrisée.
- Les démonstrations visuelles aident significativement à l'apprentissage de la technique.
Conclusions
- La salivation forcée est une méthode efficace pour étudier la transmission des virus par les moustiques.
- La formation et la pratique sont essentielles pour une mise en œuvre réussie de la technique.
- Les mesures de sécurité doivent être respectées lors de la manipulation de moustiques infectés.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Forced salivation assays enable high-throughput evaluation of mosquito vector competence without animal models, supporting early-stage target validation in antiviral discovery. The method provides quantitative, replication-competent virus detection from individual insects, informing go/no-go decisions for prophylactic or therapeutic candidates against arboviruses. Its scalability and reproducibility enhance predictive confidence in preclinical de-risking of transmission-blocking interventions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring virus transmission potential in individual disease vectors.
- Operational Value: Enables biological de-risking of targets through direct assessment of vector competence under controlled conditions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying non-competent vector species, reducing false-positive leads in arbovirus programs.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream antiviral screening by confirming virus susceptibility in vector models.
- Operational Value: Standardizes saliva collection and virus detection, ensuring reproducible quantitative outputs across large mosquito cohorts.
- Scalability: Facilitates platform reuse for high-throughput evaluation of transmission-blocking compounds or vaccines.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by testing vector competence under epidemiologically relevant temperatures (18–27°C).
- Operational Value: Ensures continuity from discovery to preclinical validation via consistent saliva-based virus readouts.
- Risk Mitigation: Informs advancement decisions by establishing temperature-dependent transmission thresholds for lead candidates.
Pipeline & Workflow Integration
The forced salivation method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, particularly for arbovirus-directed interventions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying virus presence in mosquito saliva as a functional readout of transmission potential.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility through standardized saliva collection and TCID50-equivalent virus detection in Vero cells.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (viral titer in saliva) enabling comparison across species, strains, and environmental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via temperature-stratified transmission data that mirrors field-relevant transmission windows.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for screening multiple arboviruses (e.g., ZIKV, DENV, CHIKV) across vector species without reoptimization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in transmission biology.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability across entomology and virology teams.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in antiviral programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on empirical vector competence data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mosquito handling, virology, and microsurgical techniques under BSL-3 containment.
- Dependent on specialized instrumentation including salivation devices, incubators with precise humidity control, and microscopy for cytopathic effect scoring.
- Necessitates cross-team standardization of bloodmeal preparation, incubation timelines, and saliva collection intervals.
- Adaptation considerations include species-specific proboscis size, feeding behavior, and salivary gland morphology across vector models.
- Practical limitations include the need for extensive training to achieve proficiency and the method’s dependence on viable virus recovery from saliva.
