Name: Saccharomyces cerevisiae Métabolique marquage avec 4-thio-uracile et la Quantification des nouvellement synthétisé ARNm comme un Proxy pour l’activité de l’ARN polymérase II (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Découvrez le marquage métabolique de Saccharomyces cerevisiae avec la 4-thiouracile pour quantifier l'ARNm nouvellement synthétisé. Cette méthode mesure précisément l'activité de l'ARN polymérase II.

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Nous remercions Laszlo Tora pour son soutien et V. Fisher, K. Schumacher et F. El Saafin pour leurs discussions. C.T. a été soutenue par une bourse Marie Curie-ITN (PITN-GA-2013-606806, NR-NET) et l’ARC de la Fondation. Ce travail a été soutenu par des fonds de l’Agence Nationale de la Recherche (ANR-15-CE11-0022 SAGA2). Cette étude a été soutenue également par l’ANR-10-LABX-0030-INRT, un fonds de l’État Français géré par l’Agence Nationale de la Recherche dans le cadre programme Investissements d’avenir ANR-10-IDEX-0002-02.

1. cellule culture et l’appauvrissement de la rapamycine d’une sous-unité de la SAGA
<ol><li>Pour chaque souche de S. cerevisiae et répétés, y compris de type sauvage ou les souches témoins, inoculer une seule colonie d’une plaque de frais sur 5 mL de milieu YPD (2 % Peptone, extrait de levure 1 % et 2 % de glucose).</li>
	<li>La croissance de cellules de S. cerevisiae nuit à 30 ° C sous agitation constante (150 tr/min).</li>
	<li>Mesurer la densité optique à 600 nm (OD600) et diluer la culture à une OD600 d’environ 0,1 dans 100 mL de milieu YPD et laisser pousser jusqu'à ce que l' OD600 est d’environ 0,8.</li>
	<li>En parallèle, inoculer une seule colonie de cellules de S. pombe d’une plaque de frais sur 50 mL de milieu d’Oui (0,5 % d’extrait de levure, 250 mg/L adénine, histidine, uracile, leucine, lysine ; et 3 % de glucose) et pousser les cellules durant la nuit à 32 ° C sous agitation constante (150 tr/min).</li>
	<li>Mesurer l' OD600 de la culture au jour le jour de S. pombe et diluer la culture à une OD600 d’environ 0,1 à 500 mL de milieu Oui et laisser pousser jusqu'à ce que l' OD600 est d’environ 0,8.</li>
	<li>Pour chaque souche ancre-loin de S. cerevisiae et répétés, y compris de type sauvage ou les souches témoins, inoculer une seule colonie d’une plaque de frais sur 5 mL de milieu YPD (2 % Peptone, extrait de levure 1 % et 2 % de glucose).</li>
	<li>Cultiver les cellules pendant la nuit à 30 ° C sous agitation constante (150 tr/min).</li>
	<li>Le lendemain matin, mesurer l' OD600, diluer la culture à une OD600 d’environ 0,1 dans 100 mL de milieu YPD et laisser pousser jusqu'à l’OD600≈ 0,8.</li>
	<li>Ajouter 100 µL de la rapamycine dans la culture d’une solution mère de 1 mg/mL (concentration finale rapamycine de 1 µg/mL) et laisser les cellules à incuber à 30 ° C avec agitation constante pendant le temps nécessaire pour la protéine d’intérêt à s’épuiser sous condition de la (noyau en général, 30 min est suffisante). Pour le contrôle, utilisez une culture de levure semblables, mais au lieu d’ajouter la rapamycine, ajouter le volume équivalent de diméthylsulfoxyde (DMSO).</li>
</ol>2. 4tU marquage avec S. pombe comme Spike-in (comptage)
<ol><li>
Préparer une nouvelle solution de 2 M 4-thio-uracile. Une fois préparée, gardez-le à température ambiante et à l’abri de la lumière.
	<ol>
<li>Peser 64,1 mg de 4-thio-uracile pour chaque culture de S. cerevisiae et dissolvez-le dans 250 µL de diméthylformamide (DMF) ou 250 µL de DMSO.</li>
		<li>Pour la culture de S. pombe à être utilisés comme spike, peser 320,5 mg de 4-thio-uracile et dissoudre dans 1 250 µL de DMSO.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajoutez la solution de 4-thio-uracile à S. cerevisiae et S. pombe cultures pour une concentration finale de 5 mM et les incuber pendant 6 min avec une agitation constante à 30 ° C et 32 ° C, respectivement.</li>
	<li>Après 6 min, enlever une petite aliquote de chaque culture pour le comptage des cellules. Compter les cellules à l’aide d’un compteur de cellule automatique ou d’une chambre de Neubauer.</li>
	<li>Recueillir les cellules par centrifugation (2 500 x g) pendant 5 min à 4 ° C.</li>
	<li>Jeter le surnageant, laver les cellules avec glacee 1 x PBS et centrifuger à nouveau (2 500 x g, 4 ° C, 5 min).</li>
	<li>Calculer le nombre total de cellules dans chacun des échantillons S. cerevisiae et S. pombe .</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules dans 5 mL de PBS glacée 1 x et S. cerevisiae se mêlent des cellules de S. pombe avec un ratio de 3:1.</li>
	<li>Centrifuger les cellules (2 500 x g, 4 ° C, 5 min), retirer le PBS, flash-gel les cellules de la liquide N2et conserver l’échantillon à-80 ° C jusqu'à l’utilisation ultérieure.</li>
</ol>3. RNA Extraction et traitement de DNase
<ol><li>Décongeler les cellules sur la glace pendant environ 20 à 30 min.</li>
	<li>Procéder à l’extraction de l’ARN à l’aide d’un kit d’extraction d’ARN-levure (Table des matières) avec quelques adaptations.</li>
	<li>Par chaque échantillon, verser 750 µL de perles glacées de zircone dans un tube avec bouchon à vis 1,5 mL fourni avec le kit. Gardez à l’esprit que par chaque tube, ARN jusqu'à 109 cellules peut être efficacement extrait. Par conséquent, préparer le nombre de tubes nécessaires pour chaque échantillon. Par exemple, une culture de S. cerevisiae de 100 mL (OD600≈ 0,8) peut rendre autour de 2 x 109 3 x 109 cellules, menant à un total de 2,7 x 109 à 4 x 109 cellules au total (après le pic-in avec un tiers de la de S. pombe cellules). Dans ce cas, jusqu'à 3-4 tubes de réaction par chaque échantillon/condition/mutant/répétition serait nécessaire.</li>
	<li>Par les cellules de chaque 1 x 10-9 , ajouter 480 µL de la mémoire tampon de lyse fournie avec le kit, 48 µL du SDS de 10 % et 480 µL de phénol : chloroforme : isoamylique alcool (25:24:1, v/v/v).</li>
	<li>Mélanger les cellules à l’aide d’un agitateur Vortex et transférez-les sur les tubes contenant les billes de zircone glacées.</li>
	<li>Accueillir les tubes sur un adaptateur de mélangeur vortex, tournez le vortex à vitesse maximale et battre pendant 10 min à lyser les cellules de levure (en chambre à 4 ° C). Sinon, effectuer la lyse des cellules dans un perle-batteur automatique.</li>
	<li>Centrifuger les tubes à 16 000 x g pendant 5 min à température ambiante et recueillir soigneusement la phase supérieure (phase contenant du RNA) à un tube de faucon de frais 15 mL. En général, le volume récupéré par chaque tube est d’environ 500 à 600 µL.</li>
	<li>Pour les tubes de 15 mL contenant l’ARN partiellement purifié, ajouter le tampon de liaison fourni avec le kit et mélanger soigneusement. Par chaque 100 µL de solution de RNA, ajouter 350 µL de tampon de liaison (c'est-à-dire, lorsque le volume de la solution de la phase aqueuse est 600 µL, 2,1 mL de tampon de la liaison doit être ajoutée).</li>
	<li>Au mélange précédent, ajouter de l’éthanol à 100 % et bien mélanger. Par chaque 100 µL de solution de RNA, addition de 235 µL d’éthanol à 100 % (c'est-à-dire, lorsque le volume de la solution de la phase aqueuse est 600 µL, ajouter 1,41 mL d’éthanol).</li>
	<li>Appliquer jusqu'à 700 µL du mélange de l’étape 3.9 pour une cartouche de filtre assemblé dans un tube de prélèvement, tous deux fournis avec le kit.</li>
	<li>Centrifuger pendant 1 min à 16 000 x g. Si la durée de centrifugation n’était pas suffisant pour le volume total de passer par le filtre, répétez la centrifugation pendant 30 s.</li>
	<li>Jeter le cheminement et réutiliser le même tube de prélèvement. Ajouter un autre 700 µL de solution tampon-éthanol liaison à l’ARN pour la filtrer et centrifuger à nouveau à 16 000 x g pendant 1 min.</li>
	<li>Jeter le cheminement et répétez les étapes 3.11 et 3.12 jusqu'à ce que la solution RNA est terminée.</li>
	<li>Laver le filtre 2 x 700 µl de la solution 1 de lavage. Recueillir la lavage solution par centrifugation à 16 000 x g pendant 1 min et gardez toujours le tube de prélèvement.</li>
	<li>Laver le filtre 2 x 500 µl de la solution 2 de lavage. Recueillir la lavage solution par centrifugation à 16 000 x g pendant 1 min et gardez toujours le tube de prélèvement.</li>
	<li>Centrifuger les tubes une fois de plus à 16 000 x g pendant 1 min sécher complètement le filtre.</li>
	<li>Transférer la cartouche du filtre à la collection finale (tube de RNA adaptées) et éluer l’ARN avec 50 µL de traitée DEPC, exempte de RNase H2O (préchauffé à 100 ° C).</li>
	<li>Centrifuger pendant 1 min à 16 000 x g.</li>
	<li>Éluer l’ARN nouveau (pour le même tube) avec 50 µL de préchauffé traitée DEPC, exempte de RNase H2O. Assurez-vous que tout le volume est passé par le filtre ; dans le cas contraire, centrifuger pendant de longues périodes.</li>
	<li>Si les tubes multiples pour un seul échantillon sont utilisés, leur piscine tous dans un seul tube.</li>
	<li>Quantifier et vérifier la pureté de l’échantillon à l’aide de l’équipement approprié. Remarque : Alors que 4tU est seulement constituée au sein de l’ARN nouvellement synthétisé, il y a un risque de contamination mineure avec l’ADN. Pour cette raison, il est toujours conseillé de traiter les échantillons à la DNase I. Pour cela, utilisez les réactifs fournis avec le kit d’extraction de l’ARN (Table des matières) suite aux recommandations du fabricant.</li>
</ol>4. thiol-spécifique Biotinylation des ARN nouvellement synthétisé
<ol><li>Ajuster la concentration de l’ARN obtenu à l’article 3 du protocole à 2 mg/mL. Aliquote 200 µg d’ARN total, chauffer pendant 10 min à 60 ° C et le refroidir immédiatement sur la glace pendant 2 min.</li>
	<li>
La partie aliquote de RNA, ajouter les réactifs mentionnés ci-dessous dans l’ordre suivant : 600 µL de traitée DEPC, exempte de RNase H2O, 100 µL de tampon de biotinylation (100 mM Tris-HCl [pH 7.5] et 10 mM EDTA, traitée DEPC, exempte de RNase H2O) et 200 µL de biotine-HPDP d’un stock de 1 mg/mL biotine-HPDP dans le DMSO ou DMF.
	<ol>
<li>Dans certaines situations, la solution de biotine-HPDP a tendance à précipiter, probablement en raison de sa faible solubilité dans l’eau. Dans ce cas, augmenter le volume du DMSO/DMF jusqu'à 40 % du volume de réaction (à l’exemple de RNA, ajouter 400 µL de traitée DEPC H2O, 100 µL de tampon de biotinylation et 400 µL de biotine-HPDP d’un stock de 0,5 mg/mL).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incuber les échantillons à la température ambiante et l’abri de la lumière pendant 3 h, avec agitation douce.</li>
	<li>Après incubation, ajouter un volume égal environ du chloroforme pour les tubes et mélanger vigoureusement.</li>
	<li>Faire tourner l’échantillon à 13 000 x g pendant 5 min, à 4 ° C. Cette étape permet l’élimination des excès biotine qui n’a pas biotinylater l’ARN. Vous pouvez également effectuer cette étape en utilisant des tubes de phase-lock (lourds). Pour cela, tournez en bas des tubes de phase-serrure pendant 1 min à 13 000 x g, ajouter le mélange de RNA et une quantité égale de chloroforme, mélangez-les vigoureusement et les centrifuger à 13 000 x g pendant 5 min, à 4 ° C.</li>
	<li>Transvaser avec soin la phase supérieure dans nouveaux tubes de 2 mL.</li>
	<li>Ajouter un dixième du volume de 5 M de NaCl et mélanger l’échantillon.</li>
	<li>Ajouter un volume égal d’isopropanol, bien mélanger l’échantillon et le tourner à 13 000 x g pendant au moins 30 min, à 4 ° C.</li>
	<li>Avec précaution, retirez le surnageant et ajouter 1 mL d’éthanol glacé de 75 %.</li>
	<li>Tourner à 13 000 x g pendant 10 min, à 4 ° C.</li>
	<li>Soigneusement retirer le surnageant, rapide-spin le tube et supprimer le reste de la solution d’éthanol. Veillez à ce que le culot de RNA ne sèche pas.</li>
	<li>Suspendre l’ARN dans 100 µL de traitée DEPC, exempte de RNase H2O.</li>
</ol>5. purification de la Fraction nouvellement synthétisée de l’ARN Total et non étiqueté à l’aide de streptavidine des billes magnétiques
<ol><li>Faire chauffer le biotinylé RNA pendant 10 min à 65 ° C et ensuite refroidir les échantillons sur la glace pendant 5 min.</li>
	<li>Ajouter 100 µL de streptavidine des billes magnétiques pour le biotinylé RNA (à un volume final de 200 µL). Plus précisément, il est recommandé d’utiliser les perles indiquées dans la Table des matières, puisque, après des conversations avec d’autres laboratoires, ces semblait être la plus cohérente et la plus fiable.</li>
	<li>Incuber l’échantillon avec la légère secousse pendant 90 minutes, à température ambiante.</li>
	<li>Placer les colonnes fournies avec le kit (Table des matières) dans le support magnétique.</li>
	<li>Ajouter 900 µL de tampon de lavage à température ambiante (100 mM Tris-HCl [pH 7.5], 10 mM EDTA, 1 M NaCl et 0,1 % de Tween 20, dans traitée DEPC, exempte de RNase H2O) aux colonnes (testé et équilibrer).</li>
	<li>Appliquer perles/ARN mélange (200 µL) sur les colonnes.</li>
	<li>Recueillir le cheminement dans des tubes de 1,5 mL et appliquez-le à nouveau à la même colonne magnétique. Si nécessaire, garder ce cheminement car il représente la fraction d’ARN non étiquetée.</li>
	<li>Laver les colonnes 5 x avec augmentation du volume de tampon de lavage (600, 700, 800, 900 et 1 000 µL).</li>
	<li>Éluer l’ARN nouvellement synthétisé avec 200 µL de 0,1 M TNT.</li>
	<li>Effectuer une deuxième d’élution, 3 min plus tard, avec un volume égal de 0,1 M TNT.</li>
	<li>Après élution de l’ARN, ajouter 0,1 volumes de 3 M AcONa (pH 5,2), 3 volumes d’éthanol glacé de 100 % et 2 µL de glycogène de 20 mg/mL (RNA-grade) et laisser la nuit précipitée de RNA, à-20 ° C.</li>
	<li>Récupérer l’ARN par centrifugation (13 000 x g pendant 10 min, à 4 ° C) et il resuspendre dans 15 µL de traitée DEPC, exempte de RNase H20. La proportion d’ARN marqué-à-total devrait être d’environ 2 % à 4 % (généralement plus vers l’extrémité inférieure), rendre d’environ 2,0 µg d’ARN nouvellement synthétisée. Cette quantité est suffisante pour faire plusieurs expériences de qPCR, ainsi que pour les analyses de microarray/séquençage.</li>
</ol>6. RT-qPCR Validation des différentes Fractions
<ol><li>Synthèse de cDNA de 2 µg d’ARN total ou 10 µL d’ARN marqué à l’aide des hexamères aléatoire et la transcriptase inverse de choix, selon les instructions du fabricant (Table des matières).</li>
	<li>Amplifier l’ADNc par qPCR en temps réel en utilisant un protocole standard (Table des matières). Remarque : Tous les échantillons doivent être exécutés en trois exemplaires d’un minimum de deux réplicats biologiques. Corrigez toutes les valeurs brutes pour l’expression de S. pombe tubuline.</li>
</ol>7. l’hybridation « microarray »
<ol><li>Hybrider les échantillons d’ARN sur puces de microarray préféré selon les instructions du fabricant (pour ce protocole spécifique, consultez la Table des matières). En bref, préparer biotinylé cRNA cibles de 150 ng d’ARN en utilisant le Premier Kit d’Amplification d’ARN (Table des matières), selon les instructions du fabricant. Hybrider 4 mg de Crna fragmentés pendant 16 h à 45 ° C et 60 tr/min sur les puces de microarray.</li>
	<li>Laver, tache et balayer les puces à l’aide de la station indiquée et le scanner (Table des matières). Extraire les données brutes (fichiers CEL intensité) à partir des images numérisées à l’aide de la console de commande (AGCC, version 4.1.2).</li>
	<li>Encore traiter les fichiers CEL avec la version du logiciel Console Expression 1.4.1 pour calculer la sonde définie les intensités du signal et en utilisant les algorithmes statistiques MAS 5.0 avec les paramètres par défaut et la mise à l’échelle mondiale comme méthode de normalisation. Remarque : L’intensité cible moyenne ajustée de chaque puce a été fixée arbitrairement à 100. Effectuer toutes les expériences à l’aide d’au moins deux réplicats biologiques indépendants. Normaliser les données brutes pour le signal de S. pombe et calculer le pli des changements dans les niveaux d’ARN totales et nouvellement synthétisées.</li>
</ol>8. analyse à l’aide d’un tuyau existant de R
<ol><li>Calculer la synthèse et de la décomposition des taux à l’aide d’un pipeline et les R/Bioconductor paquet accessible au public, comme décrit précédemment8,,10.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Alors que le génome des outils pour analyser les changements dans la transcription sont améliorent encore, la seule analyse du transcriptome par le biais de la quantification des niveaux d’équilibre de l’ARN pourrait reflètent pas exactement les changements dans l’activité d’ARN polymérase II. En effet, les niveaux d’ARNm sont réglementés non seulement par la synthèse de l’ARN, mais aussi par leur maturation et leur dégradation. Pour mesurer la synthèse d’ARNm dételée de dégradation de l’ARNm, protocoles distincts ont ét...

Les cellules répondent aux signaux endogènes et exogènes, par le biais de la modification dynamique de leur programme d’expression de gène. Ces dernières années, un formidable développement de méthodologies de Génome-large permet la description précise et complète du transcriptome changements dans différentes conditions. Dans la plupart des études de transcriptomique, microarray hybridation ou haut débit séquençage sont utilisés pour quantifier les niveaux d’ARN d’une fraction de RNA totale stationnaire. Transcriptionnelles modifications sous une perturbation spécifique peuvent afficher un large éventail de résultats possibles, avec les modifications de l’expression génique spécifique ou un large spectre de gènes étant up - ou réprimés. L’expression des gènes est le résultat d’un équilibre finement élaboré — ou stationnaire — entre la synthèse de l’ARN par des ARN polymérases et autres processus influant sur les niveaux d’ARN. Transcription de l’ARN polymérase II, y compris ses trois phases distinctes (initiation, élongation et résiliation), sont hautement et intimement associé à traitement ARNm, exportation cytoplasmique, traduction et de dégradation.
Plusieurs études récentes ont démontré que la décomposition et la synthèse de l’ARNm sont des mécanismes couplés et a montré que transcriptionnelles effets sur mutation ou sous des stimuli peuvent être négligés lors de la quantification de l’ARN total stationnaire. Tout d’abord, la détection de changements transcriptionnelles par le biais de l’analyse de l’équilibre des niveaux d’ARNm toujours dépend de l’ARNm Half-Life. Dès que la perturbation est introduite, les niveaux d’équilibre des ARNm ayant une demi-vie longue seront beaucoup moins affectées que celles des ARNm ayant une demi-vie courte. Par conséquent, la détectabilité des changements dans la synthèse d’ARN fortement biaisée en faveur des transcriptions de courte durée, alors que l’analyse des vécus ARNm espèces risquent de ne pas révéler l’évolution dynamique du taux de transcription. Deuxièmement, plusieurs rapports ont montré que, tant chez les levures et les mammifères, les changements globaux dans la transcription pourraient être négligées lorsqu’on analyse les niveaux d’équilibre de l’ARNm. C’est probablement due à des mécanismes qui lient la synthèse de l’ARNm et dégradation aboutissant à la mise en mémoire tampon des ARNm. Cela a incité le développement de nouveaux protocoles pour quantifier la synthèse d’ARNm dételée de dégradation, par le biais de l’analyse de l’ARNm nouvellement transcrites. Ces dernières années, plusieurs alternatives ont été présentées, dont le séquençage exécuter-sur global (GRO-seq)1et transcription élongation native séquençage (NET-seq)2,3. Ici, nous vous présentons un protocole initialement développé dans les cellules de mammifères4,5,6 et ensuite adapté à levure7,8,9,10, 11, qui est basé sur RNA marquage avec un nucléoside THIOLÉS ou base analogique, 4-thiouridine (4sU) ou 4-thio-uracile (4tU), respectivement.
Cette méthode spécifiquement purifie ARN nouvellement transcrite les cellules dans les ARN sont marqués au pouls avec 4sU avec pratiquement aucune interférence dans l’homéostasie cellulaire. Par conséquent, une fois que les cellules sont exposées à 4sU, la molécule est rapidement absorbée, phosphorylé en triphosphate-4sU et incorporé dans l’ARN étant transcrite. Une fois marqué impulsion, il est possible d’extraire l’ARN cellulaire total (correspondant aux niveaux d’équilibre de l’ARN), et, par la suite, la fraction d’ARN marqué 4sU est thiol-spécifiquement modifié, conduisant à la formation d’un pont disulfure entre la biotine et la nouvellement transcrites RNA4,5. Cependant, 4sU ne peut être absorbée par les cellules exprimant un transporteur de nucléosides, comme le transporteur de nucléosides équilibrant humaine (hENT1), empêchant son utilisation immédiate chez les levures bourgeonnantes ou fission. Alors qu’on pourrait exprimer hENT1 dans S. pombe ou S. cerevisiae, une approche plus facile peut être réalisée à l’aide de la 4tU base modifiée, car les cellules de levure peuvent faire 4tU, sans avoir besoin d’expression d’un nucléoside transporteur10, 11 , 12 , 13. en effet, le métabolisme du 4tU requiert l’activité de l’enzyme uracile phosphoribosyltransférase (UPRT). Plusieurs organismes, y compris les levures mais pas de mammifères, UPRT est essentiel pour une voie de récupération des pyrimidines, recyclage uracile à l’uridine monophosphate.
Un biais important dans les études de transcriptomique peuvent être introduit par la normalisation entre les différents échantillons analysés en parallèle. En effet, de nombreux facteurs qui DÉVIES peuvent affecter l’analyse du transcriptome de mutant et de souches sauvages : l’efficacité de la lyse cellulaire, les différences dans l’extraction et la récupération de l’ARN et les écarts dans l’étalonnage du scanner pour les analyses de microarray , entre autres. Comme indiqué plus haut, ces variations peuvent être particulièrement trompeuses lorsque les effets globaux sur la transcription de l’ARN polymérase II sont supposés. Un élégant moyen de comparer avec précision les taux de synthèse d’ADN messagère entre différents échantillons a été conçu à l’aide de la levure de fission lointainement connexe Schizosaccharomyces pombe comme étalon interne. Pour cela, un nombre fixe de marquées S. pombe cellules est ajouté aux échantillons de S. cerevisiae , cellules sauvage ou mutants, avant la lyse cellulaire et RNA extraction10. Par la suite, RNAs stationnaire et nouvellement synthétisées de S. pombe et S. cerevisiae sont quantifiées par RT-qPCR ou via l’utilisation de copeaux de microarray ou séquençage haut-débit10. En combinant ces données avec modélisation cinétique, on peuvent mesurer les taux absolus de la synthèse de l’ARNm et la décomposition dans la levure de bière.
Dans le cadre de ce manuscrit, nous allons montrer comment l’analyse de l’ARN transcrit nouvellement autorisé à révéler un rôle global pour les complexes de coactivateur SAGA et TFIID dans RNA polymérase II transcription en bourgeonnement levure14,15, 16. Ce qui est important, des études antérieures quantifier les niveaux d’ARNm stationnaire chez S. cerevisiae et a suggéré que la SAGA joue un rôle prédominant sur un nombre limité de gènes de levure qui sont fortement touchés par des mutations dans la SAGA mais relativement résistants à TFIID les mutations17,18,19. Étonnamment, l’activité de la SAGA qui ont été montrées pour agir sur le génome entier transcrit, suggérant un rôle plus large pour cet co activateur de transcription de l’ARN polymérase II. Une diminution RNA polymérase II le recrutement à gènes exprimés plus a été observé sur l’inactivation de la SAGA ou TFIID, suggérant que ces coactivateurs collaborent à la plupart des gènes. Par conséquent, la quantification des ARNm transcrit nouvellement révélé que SAGA et TFIID sont nécessaires pour la transcription des gènes de la quasi-totalité de la RNA polymérase II14,15,16. La mise en œuvre de mécanismes compensatoires émerge comme un moyen pour les cellules faire face à une diminution globale de synthèse des ARNm qui est protégée par une baisse simultanée des mondiale dans la dégradation de l’ARNm. SAGA ajoute à la liste des facteurs qui ont un effet global sur la RNA polymérase II la transcription, comme l’ARN Pol II sous-unités10, le médiateur coactivateur complexe20, le général transcription facteur TFIIH21,22 et indirectement, les éléments de l’ARNm dégradation machines9,10,23. Tels événements compensatoires ont été universellement observés chez les mutants SAGA, tenir compte des modifications dans les niveaux d’ARNm équilibre malgré une diminution globale et sévère à l’ARNm synthèse14modestes et limitées. Des analyses similaires ont aussi été réalisées dans une souche de suppression de BRE1 , ce qui entraîne une perte complète de l’histone H2B ubiquitination. Fait intéressant, un beaucoup plus doux mais cohérent global d’effet sur la transcription de l’ARN polymérase II pourrait être détecté en l’absence de Bre1, ce qui indique que le marquage métabolique de l’ARN nouvellement transcrite dans la levure peut détecter et quantifier un large éventail de changements dans l’ARNm taux de synthèse.

<table><tbody><tr><td>4-Thiouracil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# 440736</td><td></td></tr><tr><td>Rapamycin</td><td>Euromedex</td><td>Cat# SYN-1185</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL Compteur de cellules automatisé</td><td>ThermoFisher</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>RiboPure Kit de purification de l’ARN, levure</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# AM1926</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 Spectrophotomètre</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>TURBO Kit sans ADN</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1907</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link HPDP Biotine</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# 21341</td><td></td></tr><tr><td>Thiolutin</td><td></td><td>Abcam ab143556</td><td></td></tr><tr><td>&micro ; MACS Kit streptavidine</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Cat# 130-074-101</td><td></td></tr><tr><td>Transcripteur Transcriptase</td><td>Inverse Roche</td><td>03 531 295 001</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I Master</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td></td></tr><tr><td>GeneChip Yeast Genome 2.0</td><td>ThermoFisher</td><td>900555</td><td></td></tr><tr><td>GeneChip Fluidics Station 450</td><td>ThermoFisher</td><td>00-0079</td><td></td></tr><tr><td>GeneChip Scanner 3000 7G</td><td>ThermoFisher</td><td>00-0210</td><td></td></tr></tbody></table>

saccharomyces cerevisiae métabolique marquage avec 4-thio-uracile et la quantification des nouvellement synthétisé arnm comme un proxy pour l’activité de l’arn polymérase ii

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Globales défauts de transcription de l’ARN polymérase II pourraient être négligées par transcriptomique études analysant stationnaire RNA. En effet, la diminution globale de synthèse de l’ARNm s’est avérée être compensée par une baisse simultanée de la dégradation de l’ARNm pour rétablir l’équilibre des niveaux normaux. Par conséquent, la quantification du génome entier de la synthèse de l’ARNm, indépendamment de la désintégration de l’ARNm, est le meilleur reflet direct de l’activité transcriptionnelle de RNA polymérase II. Ici, nous discutons d’une méthode à l’aide de marquage métabolique non perturbant d’ARN naissante chez Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). En particulier, les cellules sont cultivées pendant 6 min avec un uracile analogiques, 4 thio-uracile et le RNAs nouvellement transcrit étiqueté sont purifié et quantifié pour déterminer le taux de synthèse de l’ARNm individuels tous les. En outre, à l’aide d’étiqueté Schizosaccharomyces pombe cellules comme étalon interne permet de comparer la synthèse de l’ARNm dans différentes S. cerevisiae souches. Utilisant ce protocole et ajustement des données avec un modèle cinétique dynamique, les taux de décroissance ARNm correspondants peuvent être déterminées.

Lorsque vous effectuez un marquage métabolique de l’ARN transcrit nouvellement, plusieurs aspects doivent être contrôlés : le temps et l’efficacité de l’étiquetage, l’épi-en proportion, le protocole d’extraction et l’efficacité de la biotinylation (y compris signal-to-noise ratio), Parmi d’autres. Ces conditions ont été longuement et méthodiquement illustrées par d’autres7,10,11. Ici, nous nous c...

Le protocole décrit ici est basé sur la quantification de Génome-large d’ARNm nouvellement synthétisées purifiée à partir de cellules de levure marquées avec 4-thio-uracile. Cette méthode permet de mesurer la synthèse d’ARNm dételée de désintégration de l’ARNm et, par conséquent, donne une mesure précise de la transcription de l’ARN polymérase II.

Saccharomyces cerevisiae Métabolique marquage avec 4-thio-uracile et la Quantification des nouvellement synthétisé ARNm comme un Proxy pour l’activité de l’ARN polymérase II

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Le principal avantage de cette technique est qu’elle reflète l’activité de l’ARN polymésase II en mesurant l’ARNm nouvellement synthétisé qui ne sont pas influencés par la dégradation de l’ARN. Ce protocole a été décrit à l’origine utilisant l’hybridation de microarray, mais peut facilement être adopté au séquençage élevé-tout au long de l’ARNm nouvellement transcrit. Tiago Baptista, un ancien diplômé de notre laboratoire, démontrera cette procédure.Après avoir inoculé les cellules S.cerevisiae, les cultiver pendant la nuit à 30 degrés Celsius avec agitation constante à 150 RPM. Le lendemain, mesurez la densité optique à 600 nanomètres. Diluer la culture à un OD600 d’environ 0,1 dans 100 millilitres de milieu YPD.Faire grandir les cellules jusqu’à ce que l’OD600 soit d’environ 0,8. Après cela, mesurer l’OD600 de la culture du jour au lendemain S.pombe. Diluer cette culture à un OD600 d’environ 0,1 dans 500 millilitres de milieu YAS et laisser grandir jusqu’à ce que l’OD600 est d’environ 0,8.Tout d’abord, préparer une nouvelle solution de deux molar quatre thiouracil. Gardez la solution préparée à température ambiante et à l’abri de la lumière. Ajoutez la solution à quatre thiouracils aux cultures S.cerevisiae et S.pombe de telle sorte que la concentration finale soit de cinq millimolaires.Incuber les cultures S.cerevisiae et S.pombe à 30 degrés Celsius et 32 degrés Celsius respectivement avec agitation constante pendant six minutes. Après cela, retirez un petit aliquot de chaque culture et comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatique ou d’une chambre Neubauer. Centrifugeuse à 2500 fois g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes pour recueillir les cellules.Jetez le supernatant et lavez les cellules avec de la glace froide une fois PBS. Centrifugeuse à nouveau à 2500 fois g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, resuspendez les cellules en cinq millilitres de froid glacial une fois PBS.Mélanger les cellules S.cerevisiae et S.pombe à un rapport de trois pour un. Centrifuger les échantillons mélangés à 2 500 fois g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Retirez ensuite le PBS et clignotez les cellules dans de l’azote liquide.Conserver l’échantillon à 80 degrés Celsius négatif jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi. Lorsque vous êtes prêt à procéder, décongeler les cellules sur la glace pendant environ 20 à 30 minutes. Utilisez un kit d’extraction d’ARN de levure adapté pour extraire l’ARN tel que décrit dans le protocole de texte.Après cela, transférez la cartouche de filtre dans le tube de collecte final. Elute l’ARN avec 50 microlitres d’eau sans RNase traitée par DEPC qui a été préchauffée à 100 degrés Celsius. Centrifugeuse à 16 000 fois g pendant une minute.Utilisez ensuite 50 microlitres d’eau sans RNase préchauffée traitée par DEPC pour éduuter à nouveau l’ARN dans le même tube. Centrifugeuse à 16 000 fois g pendant une minute pour s’assurer que tout le volume de l’échantillon est passé à travers le filtre. Si ce n’est pas le cas, centrifugez à nouveau pendant une plus longue période de temps.Une fois terminé, quantifier et vérifier la pureté de l’échantillon à l’aide de l’équipement approprié. Utilisez de l’eau sans nucléase traitée par DEPC pour ajuster la concentration de l’ARN précédemment acquis à deux milligrammes par millilitre. Aliquot 200 microgrammes d’ARN total et le chauffer à 60 degrés Celsius pendant 10 minutes.Refroidissez-le immédiatement sur la glace pendant deux minutes. Ajouter 600 microlitres d’eau sans RNase traitée par DEPC. Ajouter 100 microlitres de tampon de biotinylation, puis ajouter 200 microlitres de biotine HPDP.Si la solution HPDP de biotine se précipite hors de la solution, augmentez le volume de DMSO ou de DMF jusqu’à 40% du volume de réaction tel que décrit dans le protocole de texte. Protégez l’échantillon de la lumière et incubez-le à température ambiante avec une agitation douce pendant trois heures. Après cela, ajouter un volume à peu près égal de chloroforme aux tubes et mélanger vigoureusement.Centrifugeuse à 13 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, transférez soigneusement la phase supérieure dans de nouveaux tubes de deux millilitres. Ajouter une quantité de cinq chlorure de sodium molaire égale à environ 1/10 du volume de l’échantillon.Ensuite, mélanger l’échantillon. Tout d’abord, chauffer l’ARN biotinylé à 65 degrés Celsius pendant 10 minutes. Réfrigérer ensuite les échantillons sur la glace pendant cinq minutes.Ajouter 100 microlitres de perles magnétiques enduites de streptavidine à l’ARN biotinylé. Incuber à température ambiante avec une légère secousse pendant 90 minutes. Placez les colonnes fournies avec le kit dans le support magnétique.Ensuite, ajoutez 900 microlitres de tampon de lavage à température ambiante aux colonnes. Appliquer le mélange de perles et d’ARN de 200 microlitres sur les colonnes. Recueillir le flow-through dans des tubes de 1,5 millilitre, puis l’appliquer à nouveau à la même colonne magnétique.Gardez ce flux si nécessaire car il représente la fraction arn non étiqueté. Pour commencer la validation RT-qPCR des différentes fractions, synthétisez d’abord cDNA tel que décrit dans le texte. Ensuite, amplifiez l’ADN en temps réel qPCR à l’aide d’un protocole standard.Les niveaux mesurés de transcriptions en fractions purifiées à partir de cellules de type sauvage cultivés avec et sans quatre thiouracil ont confirmé cette procédure purifie spécifiquement l’ARN étiqueté. L’analyse de la souche delta du spt20 révèle que la quantité totale d’ARN à l’état stable est en grande partie inchangée ou n’est que légèrement réduite pour les gènes testés. Des résultats similaires sont observés pour les souches supprimées pour bre1.Cependant, l’analyse de l’ARN nouvellement transcrit dans la souche du delta du spt20 révèle une diminution de trois à cinq fois la synthèse de l’ARNm pour tous les gènes testés. Pendant ce temps, la perte de bre1 conduit à une diminution plus discrète mais encore visible. Lors de l’épuisement inductible du spt7, une sous-unité structurelle du complexe saga, les niveaux nouvellement transcrits d’ARNm sont réduits dans une mesure similaire à la souche de suppression.Lorsque les niveaux totaux d’ARN sont mesurés par analyse à l’échelle du génome, seuls quelques gènes sont considérés comme faisant modifier leurs niveaux d’expression lors de la suppression du spt20, soit par régulation vers le haut, soit par régulation vers le bas. Cependant, l’analyse de l’ARN nouvellement transcrit révèle que les niveaux de plus de 4000 gènes sont significativement réduits au moins deux fois lors de la suppression du spt20, ce qui suggère un effet positif global de la saga sur la transcription de la polymése II arn chez les levures en herbe. Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de la transcription dans Saccharomyces cerevisiae, elle n’a été appliquée qu’avec de légères variations à En utilisant ce protocole, nous avons pu détecter une diminution globale de la synthèse de l’ARNm qui a été compensée par une diminution globale de la dégradation de l’ARNm.

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Saccharomyces cerevisiae Métabolique marquage avec 4-thio-uracile et la Quantification des nouvellement synthétisé ARNm comme un Proxy pour l’activité de l’ARN polymérase II (Vidéo) | JoVE Journal

Saccharomyces cerevisiae Métabolique marquage avec 4-thio-uracile et la Quantification des nouvellement synthétisé ARNm comme un Proxy pour l’activité de l’ARN polymérase II

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