Name: Production semi automatisée de Hepatocyte comme cellules de cellules souches pluripotentes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 43 s
Description: Découvrez une méthode semi-automatisée pour produire des cellules de type hépatocyte à partir de cellules souches pluripotentes humaines en format 96 puits. Cette approche rapide et reproductible permet la production en masse pour la modélisation de maladies hépatiques et le criblage de médicaments.

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Ce travail a été soutenu avec prix du Bureau de l’expert scientifique en chef (SDC/16/37) et une bourse de doctorat de la MRC.

1. ensemencement des cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) en 96 bien plaques d’hépatocytes différenciation
Remarque : Les réactifs et les équipements utilisés dans le présent protocole a été énumérés au tableau 1. Support utilisé pour cette expérience doit être stérile et à température ambiante pour la culture cellulaire. Tous les volumes de réactifs/solution décrites dans cette partie du protocole sont basés sur un seul puits d’une plaque 96 puits, sauf indication contraire.
<ol><li>
Préparer laminine enduit les plaques bien 96.
	<ol>
<li>Décongeler un flacon de laminine recombinant 521 (100 µg/mL) (LN-521) pendant 2 h à une nuit à 4 ° C.</li>
		<li>Préparer une solution de 5 µg/mL en diluant LN-521 glacée 1 x tampon phosphate salin de Dulbecco (SPD) (avec Ca2 +/Mg2 +).</li>
		<li>Une manipulation distributeur avec un tube standard cassette de distribution de liquides automatique permet d’ajouter 50 µL de la solution de LN-521 / puits d’une plaque 96 puits. NOTE : Volume total de la dispense sont effectuées par un distributeur automatique manipulation de liquides avec un tube standard distribution cassette sauf indication contraire. Amorcer la solution jusqu'à ce qu’elle atteigne la fin de distribution de la cassette, puis continuez à distribuer. Plusieurs 96 plats peuvent être préparés dans la même expérience en répétant la procédure autant de fois que nécessaire.</li>
		<li>Incuber les plaques de revêtement LN521 à 37 °C/5% CO2 pendant 2 à 4 h. Remarque : LN521 revêtu de plaques peuvent être conservés jusqu'à deux semaines à 4 ° C. Garder les plaques scellées sur une surface plane afin d’éviter l’évaporation et la contamination.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Le nombre requis de plaques revêtus à 37 ° C pendant 30 min à 1 h d’échauffement.</li>
	<li>Aspirer le reste de la solution de la surface à l’aide d’un adaptateur d’aspiration 8 canaux LN-521. Remarque : Il est essentiel d’éviter tout contact avec la surface recouverte pour éviter la dégradation du revêtement.</li>
	<li>Ajouter 50 µL / puits de mTeSR1 milieu supplémenté avec inhibiteur de kinase associée à Rho (ROCK) 10 µM Y27632 immédiatement et maintiennent la plaque dans l’incubateur cellule ensemencement à 37 °C/5% CO2. NOTE : Ne pas laisser les puits laminin-enduit sécher.</li>
	<li>
Préparer une suspension de cellules de 3 x 105 cellules/mL dans mTeSR1 additionné à l’inhibiteur de ROCK 10 µM Y27632. Remarque : La densité de semis pour chaque lignée cellulaire nécessiteront d’optimisation.<ol>
<li>Aspirer le moyen d’une boîte de Pétri avec une culture non différenciée de hPSCs à environ 75 % à 85 % confluence cultivé sur LN-521 comme décrit plus haut12. Remarque : hPSCs sont cultivées sur LN-521 dans mTSER1 avec le milieu a changé toutes les 24 h et subcultures régulièrement une fois les cellules atteignent 80 % de confluence comme décrit précédemment12.</li>
		<li>Laver les cellules avec 5 mL de la température de la pièce 1 x DPBS (sans Ca2 +/Mg2 +) et aspirer la mémoire tampon.</li>
		<li>Ajouter 5 mL de 1 x doux réactif de Dissociation cellulaire aux cellules et incuber à 37 ° C pendant 6 à 8 min pour la dissociation cellulaire. Remarque : Pour arrêter la réaction, examinez le détachement des cellules de la matrice sous le microscope. Les cellules doivent être partiellement détachés de la plaque. Si ce n’est pas le cas, prolonger l’incubation pour un appoint 1 à 2 min.</li>
		<li>Fin de la réaction en aspirant le réactif de la Dissociation cellulaire doux et ajouter 5 mL de mTeSR1 frais additionné d’inhibiteur de ROCK 10 µM Y27632 aux cellules. Utilisez un grattoir de cellules pour soulever les cellules de la matrice et la pipette de haut en bas en utilisant un embout de P1000 plusieurs fois pour mélanger.</li>
		<li>Compter les cellules viables utilisant un hémocytomètre basé sur la méthode d’exclusion du bleu de Trypan et préparer la suspension cellulaire avec des concentrations requises.</li>
		<li>Pipeter le nombre désiré de cellules dans un tube à centrifuger 15 mL ou 50 mL stérile et faire tourner les cellules vers le bas en centrifugeant eux à 115 x g pendant 5 min à température ambiante. Remarque : Pour une 96 plaque bien, 5 mL de mTeSR1 milieu contenant 3 x 105 cellules/mL est requise pour la lignée de cellules H9.</li>
		<li>Aspirer le surnageant et doucement Resuspendre le culot cellulaire jusqu'à l’obtention d’une solution homogène à 37 ° C dans un mTeSR1 milieu supplémenté avec inhibiteur de ROCK 10 µM Y27632. Remarque : L’utilisation de l’inhibiteur de la roche est recommandée car il améliore la cellule survie post ré-ensemencement.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajouter 50 µL de la suspension cellulaire sur la plaque bien 96 contenant 50 µL de mTeSR1 avec inhibiteur de ROCK 10 µM Y27632.</li>
	<li>Après l’ensemencement, regagner l’incubateur de cellules à 37 °C/5% CO2 pendant 24 heures afin de permettre les cellules fixer les plaques.</li>
	<li>Examiner les cellules le lendemain et retirer l’inhibiteur de la roche une fois établi le contact de cellule à cellule. À la confluence de 40 %, placez-vous au milieu de la différenciation (Figure 1 b). Remarque : Si la confluence de la cellule est supérieure à 40 %, les plaques ne conviennent pas pour la différenciation HLC avec la lignée cellulaire H9.</li>
</ol>2. différenciation hPSCs de cellules semblables à des hépatocytes sur Recombinant laminines en plaques 96 puits
<ol><li>
Préparer la différenciation des facteurs de milieu et de la croissance.
	<ol>
<li>Préparer solution humaine activine A (100 µg/mL) en dissolvant la poudre activine A humaine dans stérile 0,2 % sérum d’albumine bovine (BSA) dans du PBS. Aliquote du stock et les conserver à-20 ° C. Utilisez à 1:1, 000.</li>
		<li>Préparer la souris Wnt3a (10 µg/mL) solution en dissolvant la poudre Wnt3a souris stérile 0,2 % BSA. Aliquote du stock et les conserver à-20 ° C. Utiliser au 1 : 200.</li>
		<li>Préparer d’hépatocytes humains facteur de croissance (HGF) (10 µg/mL) solution en dissolvant la poudre HGF humaine en stérile 0,2 % de BSA. Aliquote du stock et les conserver à-20 ° C. Utiliser au 1/1000.</li>
		<li>Préparer oncostatine M (OSM) (20 µg/mL) solution en dissolvant la poudre stérile 0,2 % BSA. Aliquote du stock et les conserver à-20 ° C. Utilisez à 1:1, 000.</li>
		<li>Endoderme définitif : préparer le moyen de différenciation endoderme, Supplément de 2 % B27 (50 x, sans insuline), consistant en 1 % pénicilline/streptomycine (concentration finale : 100 UI/mL et 100 µg/mL, respectivement) ajouté à Roswell Park Memorial Institute 1640 ( RPMI 1640) milieu de base. Conserver à 4 ° C et utiliser dans les deux semaines. A chaque changement moyen, compléter le volume requis avec activine A et Wnt3a à une concentration finale de 100 ng/mL et 50 ng/mL, respectivement.</li>
		<li>Hepatoblast différenciation : préparer le moyen de différenciation hepatoblast, consistant en remplacement de sérum de knockout de 20 % (KSR), 0,5 % une alternative supplément de L-glutamine, 1 % des acides aminés non essentiels (NEAA), 0,1 mM bêta-mercaptoéthanol, DMSO 1 % et 1 % la pénicilline/streptomycine (concentrations finales à 100 UI/mL et de 100 µg/mL, respectivement) ajouté à débouchure DMEM (KO-DMEM). Filtrer sous vide et conserver à 4 ° C. Utiliser dans les deux semaines.</li>
		<li>Différenciation des hépatocytes : préparer le milieu de différenciation hépatocyte, composé de 1 %, une solution de rechange supplément de L-glutamine, 10 µM hydrocortisone 21-sodium hémisuccinate (HCC), 1 % pénicilline/streptomycine (concentrations finales à 100 UI/mL et 100 µg/mL, respectivement) ajouté au milieu de HepatoZYME. Stocker le stock à 4 ° C et utiliser dans les deux semaines. Pour chaque changement médiatique, compléter le volume requis par HGF et OSM (concentration finale 10 ng/mL et 20 ng/mL, respectivement).</li>
	</ol>
</li>
	<li>après 24h, ensemencement, retirer le support à l’aide d’un système de pipette automatique de canaux électroniques portatifs soigneusement et ajouter 100 µL de milieu d’amorçage / endoderme frais additionné de 100 ng/mL activine A et 50 ng/mL Wnt3a. Remarque : Le processus de différenciation commence une fois que le milieu de l’endoderme définitif a été ajouté. Une fois que l’ensemencement de la cellule est optimisé, la différenciation cellulaire est normalement initiée sous 24h. Moyen toutes les modifications sont effectuées en enlevant le milieu avec un système de pipette automatique de canaux électroniques portatifs et distribuer 100 µL de milieu frais à l’aide d’un distributeur automatique manipulation de liquides avec une norme tube cassette distribution sauf si autrement spécifié. Un système de pipette automatique de canaux électroniques portatifs a été utilisé avec une tête de puits, utilisant 300 µL pointe de 96. En bref, 90 µL ont été aspiré de la bien en évitant tout contact avec les cellules, et il ne faut ne pas faire sécher les cellules pendant le changement moyen pour réduire le stress cellulaire.</li>
	<li>Pour les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh), changer le moyen de différenciation endoderme quotidiennement pendant trois jours. Si la différenciation s’effectue pour les cellules souches humaines pluripotentes induites (hiPSCs), prolonger la phase de l’endoderme définitif pour 2 jours supplémentaires à l’aide d’activine A seulement.</li>
	<li>Après l’induction de l’endoderme définitive, passer au milieu de KSR/DMSO pour la spécification de hepatoblast et changer le milieu tous les 2 jours pendant 5 jours. Remarque : S’il y a un certain nombre de cellules non inscrits dans le puits, utiliser non supplémenté KO-DMEM pour laver les cellules une fois avant le prochain changement médiatique. En raison de la durée de la deuxième phase du protocole (5 jours), il y aura 3 modifications moyennes dont la dernière le dernier jour de la spécification hepatoblast.</li>
	<li>Suite à la différenciation hepatoblast, passer au milieu de HepatoZYME pour la maturation de l’hépatocyte. Laver les cellules une fois avec HepatoZYME sans le supplément après avoir enlevé le milieu KSR/DMSO et ajouter 100 µL de milieu de maturation HepatoZYME additionné de 10 ng/mL HGF et 20 ng/mL OSM.</li>
	<li>Changer le support de toutes les 48 h pour les 7 à 10 jours. Au 18e jour de la différenciation, caractériser HLCs en analysant l’expression génique et l’activité métabolique de CYP P450.</li>
</ol>3. caractérisation des hépatocytes-comme des cellules différenciées sur laminines Recombinant
<ol><li>Détecter l’expression des marqueurs spécifiques des hépatocytes et des marqueurs de polarisation à l’aide d’immunomarquage.</li>
	<li>Tester la fonction métabolique hépatocyte utilisant la CYP P450 comme décrit avant le12.</li>
	<li>Déterminer la variation de la plaque, comptant le nombre total de cellules par puits par plaque.</li>
</ol>4. haut débit immunocytochimie et Acquisition d’images
<ol><li>Jour 18 de différenciation, laver les puits trois fois avec 1 x DPBS, à résoudre les HLCs de distribution 50 µL de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) et incuber à température ambiante pendant 15 à 30 min. Après fixation, laver trois fois avec PBST (0,1 % tween) (sans Ca2 +/Mg2 +) en utilisant une machine à laver automatique de plaques. Remarque : Tous les lavages dans cette section sont effectuées à l’aide d’un laveur de plaques automatique sauf indication contraire. Tous les lavages sont faits suivant le même protocole.</li>
	<li>Permeabilize la membrane de distribution à 100 µL de PBST (sans Ca2 +/Mg2 +) et incuber pendant 20 min à température ambiante. Ensuite, effectuer le blocage de protéine par dosage 100 µL de 10 % de BSA dans du PBST et incuber pendant 1 heure en agitant doucement à l’aide d’un agitateur de plaque. Après le blocage de la protéine, ajouter 50 µL de 1 % de BSA dans du PBST contenant les anticorps primaires, incuber à 4 ° C pendant la nuit avec agitant doucement à l’aide d’un agitateur de plaque. Remarque : Ne pas laver entre ajout bloc et anticorps de protéine.</li>
	<li>Après 24h, laver trois fois avec 1 x DPBS (sans Ca2 +/Mg2 +) et ajoutez l’anticorps secondaire de distribution 50 µL de 1 % de BSA dans du PBST. Incuber 1 h à température ambiante dans l’obscurité.</li>
	<li>Après l’incubation de l’anticorps secondaire, laver 3 fois avec 1 x DPBS. Ajouter 50 µL de SPD au DAPI (10 µg/mL) et incuber pendant 5 à 10 min à température ambiante dans l’obscurité.</li>
	<li>Enfin, laver 3 fois avec le SPD et laisser 100 µL de 1 x DPBS dans le puits. Les plaques sont prêtes pour l’imagerie. NOTE : Plaques doivent être conservés à 4 ° C dans l’obscurité jusqu'à l’imagerie.</li>
	<li>L’image de la plaque à l’aide d’un système d’imagerie de haute teneur et acquérir plusieurs champs dans le puits afin d’obtenir une bonne représentation du puits. Quantifier l’expression des marqueurs différents dans les HLCs en utilisant le logiciel de Columbus (logiciel système d’analyse d’imagerie haute teneur). NOTE : Columbus est un logiciel d’analyse de contenu élevé, qui offre l’analyse par segmentation cellulaire pour la détermination du phénotype cellulaire. Des résultats similaires peuvent être obtenus à l’aide de CellProfiler, un logiciel open-source pour l’analyse quantitative d’images biologiques22.</li>
</ol>

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</ol>

Prof. David C. Hay est cofondateur et directeur du Stemnovate limitée.
Prof. David C. Hay est un réalisateur de HigherSteaks Limited.

Notre procédure semi-automatique est performant, fiable et économique, permettant de produire des HLCs à échelle (Figure 1). Il y n'avait pas de différence significative en termes de nombre de cellules entre les puits de la plaque, rendant cette plate-forme une approche appropriée pour dépistage basé sur la cellule (Figure 2). En outre, le flux de travail semi automatisation permet à l’utilisateur de produire un grand nombre de plaques à la fois, qui n’était pas possible avant d’utiliser des processus manuels5,12.
Ce qui est important, le processus d’automatisation n’avait aucune incidence sur le rendement de différenciation, la majorité des cellules exprimant HNF4α (89,2 % ±2) et ALB (92,8 % ±6) (Figure 3). HLCs a aussi exprimé CYP P450 enzymes CYP2D6 et CYP3A4 et affichent l’activité métabolique du CYP1A2 et CYP3A comparable aux précédentes expériences rapportées (Figure 3)5. Malgré la normalisation du protocole, confluence des cellules avant la différenciation est essentielle pour la différenciation HLC pure. Par conséquent, garantissant une distribution bon cellulaire dans le puits est une considération importante (Figure 1). Cela s’est avéré pour être dépendants de la lignée cellulaire, optimisation de semis et de la densité cellulaire est requise pour chaque avant de ligne cellulaire intensifier.
Dans sa forme actuelle, cette plateforme n’est pas apte à produire de grandes quantités de HLCs pour des applications cliniques, et cela sera très probablement réalisé à l’aide de bioréacteurs et usines de la cellule. Cependant, la méthodologie développée permet la génération rapide de cellules hépatiques humaines pour la modélisation de la maladie, de dépistage des drogues et/ou de drogues recibler les études. En outre, l’essai est susceptible de multiplexage, permettant la génération d’ensembles de données multiparamétriques pour analyse mécaniste. Aller plus loin, nous croyons aussi que cette technologie pourrait être appliquée à in vitro des systèmes plus complexes comme la différenciation 3D ou comme une plate-forme pour améliorer HLC phénotype in vitro.
En conclusion, nous croyons que notre système simple et semi-automatisé va augmenter le débit expérimental et réduire la variation expérimentale, améliorant ainsi la qualité des ensembles de données biologiques et leur extrapolation vers la physiologie humaine.

Les hépatocytes humains primaires (HHP) représentent la norme actuelle pour la recherche biomédicale sur le foie. Malgré leurs avantages, HHP représente une source limitée des hépatocytes matures avec phénotype instable1. Cellules souches embryonnaires (CSE) et les cellules souches humaines pluripotentes induites (iPSC) ont été proposés comme une ressource puissante pour la recherche biomédicale, promettant une source renouvelable de tissus humains, y compris du foie2,3,4 . Les procédures actuelles de différenciation des hépatocytes génèrent des cellules qui expriment des marqueurs hépatocyte, des gènes et des fonctions similaires à HHP3,4,5,6,7, 8,9,10,11. Plus récemment, l’utilisation de matériaux définis et matrices telles que recombinant laminines, a phénotype cellulaire améliorée et reproductibilité expérimentale5,12,13,14.
Techniques de culture cellulaire traditionnel reposent largement sur pipetage manuel, qui est beaucoup de temps et source d’erreurs. Cela limite le débit de l’essai et le format de la plaque on peut travailler avec. A ce jour, la plupart des études décrivant la génération de HLCs sont de main-d'oeuvre dans la nature et donc de petite échelle en taille15,16,17.
Courant des avances dans la manipulation de liquides et systèmes de pipetage, en combinaison avec la microscopie automatisée et analyseurs de laboratoire, ont permis d’élaborer des procédures qui réduisent au minimum la nécessité d’une intervention humaine. Nous avons profité de ces technologies et a développé un système de différenciation semi-automatisées permettant de générer de grandes quantités de tissu du foie humain pour basic et recherche biomédicale appliquée. Cette approche peut être effectuée à la fois humaine ESC et iPSC lignes avec des modifications mineures nécessaires, selon la lignée cellulaire. Combinant ce système à haute teneur en analyse, nous démontrons que le phénotypage HLC peut être moins chronophage et interprété à échelle18,19,20,21.
En résumé, l’automatisation des techniques de culture cellulaire décrit ci-après a permis d’améliorer en fiabilité, gestion du temps expérimental et débit de dosage.

<table><tbody><tr><td>405 LS Washer</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27 supplément</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>bêta-mercaptoéthanol</td><td>Life Technologies</td><td>31350</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>DPBS avec calcium et magnésium</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td>14040133</tr><tr><td>Réactif de dissociation cellulaire douce</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7174</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>GripTips pour VIAFLO 96</td><td>Integra</td><td>6434</td><td></td></tr><tr><td>HepatoZYME-SFM</td><td>Life Technologies</td><td>&nbsp ; 17705021</td><td></td></tr><tr><td>Human Activin A</td><td>Peprotech</td><td>120-14E</td><td></td></tr><tr><td>Facteur de croissance des hépatocytes humains</td><td>Peprotech</td><td>100-39</td><td></td></tr><tr><td>Oncostatine humaine M</td><td>Peprotech</td><td>300-10</td><td></td></tr><tr><td>Laminine recombinante humaine 521</td><td>BioLamina</td><td>LN521-02</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone 21-hemisuccinate sel de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4881</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>10829</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Remplacement sérique</td><td>Life Technologies</td><td>10828</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Distributeur de réactifs MultidropCombi</td><td>ThermoFisher</td><td>5840300</td><td></td></tr><tr><td>Acides aminés non essentiels</td><td>Life Technologies</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Système d’imagerie à haut contenu Operetta</td><td>PerkinElmer</td><td>HH12000000</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>souris recombinante Wnt3a</td><td>R& D Systems</td><td>1324-WN-500/CF</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de la kinase associée à la rho (ROCK) Y27632</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503-1MG</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>21875</td><td></td></tr><tr><td>Cassette de distribution de tubes standard</td><td>ThermoFisher</td><td>24072670</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>VIAFLO 96 Pipette électronique 96 canaux</td><td>Integra</td><td>6001</td><td></td></tr><tr><td>PBS, sans calcium, sans magnésium</td><td>ThermoFisher</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Solution de formaldéhyde 4 %, tamponnée, pH 6,9</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1,00496&nbsp ; EMD MILLIPORE</td><td></td></tr><tr><td>P450-Glo CYP3A4 Système de dosage et de criblage</td><td>Promega</td><td>V8801</td><td></td></tr><tr><td>P450-Glo CYP1A2 Système de dosage et de criblage</td><td>Promega</td><td>V8771</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6684</td><td>1:200 (souris)</td></tr><tr><td>Alpha-fœtoprotéine</td><td>Abcam</td><td>ab3980</td><td>1:500 (souris)</td></tr><tr><td>CYP2D6</td><td>Université de Dundee</td><td>Université de Dundee</td><td>1:200 (mouton)</td></tr><tr><td>CYP3A4</td><td>Université de Dundee</td><td>Université de Dundee</td><td>1:200 (mouton)</td></tr><tr><td>HNF-4&alpha ;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8987</td><td>1:400 (lapin)</td></tr><tr><td>E-cadhérine</td><td>Abcam</td><td>ab76055</td><td>1:200 (souris)</td></tr><tr><td>IgG</td><td>DAKO</td><td></td><td>1:400</td></tr><tr><td>Anti-souris 488 (anticorps secondaire)</td><td>Life technologies</td><td>A-11001</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Anti-sheep 488 (anticorps secondaire)</td><td>Life technologies</td><td>A-11015</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Anti-rabbit 488 (anticorps secondaire)</td><td>Technologies de la vie</td><td>A-11008</td><td>1:400</td></tr></tbody></table>

production semi automatisée de hepatocyte comme cellules de cellules souches pluripotentes

Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells

Cellules souches pluripotentes humaines représentent une source renouvelable de tissus humains. Notre recherche se concentre sur la production de tissu hépatique humain de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et induit des cellules souches pluripotentes (CISP). Les procédures actuelles de différenciation génèrent humains cellules semblables à des hépatocytes (HLCs) affiche un mélange de traits foetales et adultes. Pour améliorer le phénotype cellulaire, nous avons entièrement défini notre procédure de différenciation et le créneau de la cellule, ayant pour résultat la génération de populations de cellules qui affichent l’expression des gènes améliorée et la fonction. Alors que ces études marquent des progrès, la capacité de générer de grandes quantités de plats multi pour le dépistage a été limitée par des interventions intensives du travail et de la variation de lots. Pour remédier à ce problème, nous avons développé une plateforme semi-automatisé pour différencier des cellules souches pluripotentes dans HLCs. Stem cell ensemencement et différenciation ont été effectuées à l’aide de la manipulation de liquides et de systèmes de pipettage automatique au format de la plaque à 96 puits. Suite à la différenciation, phénotype cellulaire a été analysée à l’aide de la microscopie automatisée et un luminomètre bien multi.

La différenciation cellulaire a été réalisée à l’aide d’une ligne de cellules souches embryonnaires (H9). La plate-forme semi-automatique a été utilisée pour différencier et de caractériser les cellules (Figure 1 a). Un distributeur de manipulation de liquides automatique servait à enduire la matrice et cellules individuelles des graines. Différenciation cellulaire a été lancée lorsque les cellules ont atteint 40 % confluence (jour 0). Changements de médias ont été réalisées à l’aide d’un système de pipette automatique de canaux électroniques portatifs pour enlever le support et le distributeur de manipulation de liquides pour l’addition moyenne (Figure 1 a). Fixation cellulaire et les taches ont été effectuées à l’aide de la manipulation de liquides automatique distributeur en combinaison avec la machine à laver automatique de plaques. D’imagerie et de quantification ont été effectuées en utilisant un système d’imagerie de haute teneur et le logiciel de Columbus. L’activité du cytochrome P450 a été mesurée à l’aide d’un dosage établi. Après incubation de substrat, les surnageants de cellules ont été récoltées et bioluminescence enregistrées à l’aide d’un lecteur de microplaques multimode (Figure 1 a). En outre, microscopie à contraste de phase classique a été utilisée pour mesurer les changements dans la morphologie des cellules au cours de la différenciation des hépatocytes (Figure 1 b).
Le jour 18, la variabilité du nombre de cellules entre puits fut examinée suite DAPI coloration (Figure 2 a). Sept champs de vue ont été capturés par les puits et le nombre de noyaux quantifié (Figure 2 a). Nous avons ne détecté aucune différence statistique entre les puits avec une moyenne de 41 662 ±3, 366 cellules par puits (Figure 2 b).
Au 18e jour, HLCs étaient fixe et colorées pour marqueurs hépatocyte typique (Figure 3A-G) et testés à l’activité des CYP P450. HLCs exprimé marqueurs hépatocyte tels que HNF4α (89,2 % ±2 cellules positives), ALB (±6 92,8 % des cellules positives), AFP (61,8 % ± 2 cellules positives). HLCs a aussi exprimé des protéines CYP P450, CYP2D6 et CYP3A4 et affichent une apparence distincte polygonale comme indiqué par l’expression de la protéine E-cadhérine. Activité des CYP P450 HLCs a été mesurée au jour 18. HLCs ont manifesté une activité CYP1A2 à ±45 295 906, 828 RLU/mL/mg de protéine et CYP3A à 1 066 112 ±177, 416 RLU/mL/mg de protéine (Figure 3 H).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57995/57995fig1v2.jpg"> Figure 1 : différenciation des hépatocytes de PSC dans le 96 bien formater. (A). schéma de l’équipement permettant de semi-automatiser la différenciation cellulaire, fixation, coloration, imagerie et activité fonctionnelle. (B). représentant changements dans la morphologie cellulaire durant la différenciation HLC. En bref, PSC est amorcée vers définitif endoderme, suivie de la spécification hepatoblast caractérisée par cellules affichant morphologie pavées et avant la maturation des hépatocytes avec cellules acquisition de forme polygonale. Echelle = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57995/57995fig1v2large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57995/57995fig2v3.jpg"> Figure 2 : évaluation de la variabilité des puits à puits HLCs. (A) représentation d’un 96 plaque bien vue des HLCs colorées au DAPI. Echelle = 1 mm. (B) Quantification du nombre de cellules par puits. Moyenne du nombre de cellules par puits dans les colonnes (en haut) et lignes (en bas), de sept champs de vues par puits et quantifiées à l’aide de logiciels de Columbus. Nombre moyen de cellules dans l’ensemble de la plaque est 41 662 ± 3 366 SEM des cellules par puits. Aucune différence statistiquement significative ont été observés entre les puits. Une ANOVA unidirectionnel avec des tests statistiques post-hoc de Tukey travaillait. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57995/57995fig2v2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57995/57995fig3v2.jpg"> Figure 3 : expression de marqueurs hépatocyte et mesure de l’activité CYP P450 dans HLCs au 18e jour. (A) le pourcentage des hépatocytes nucléaire facteur 4 alpha (HNF4α) expression ± SEM repose sur trente puits avec dix champs de vue par puits. (B) le pourcentage d’expression d’albumine (ALB) +/-SEM, est issu des 3 puits séparés avec dix champs de vue par puits. (C) le pourcentage de l’alpha foetoprotéine (AFP) +/-SEM repose sur 3 puits séparés avec dix champs de vue par puits. (D) E-cadhérine coloration. Coloration de CYP2D6 (E) . Coloration de CYP3A4 (F) . (G). immunoglobuline G (IgG) contrôle la coloration. Echelle = 50 µm. (H) CYP P450 1 a 2 et 3 a activité métabolique des HLCs au jour 18. La représente de données biologiques six réplicats +/-SEM. activité est cité comme unités de lumière relative (RLUs) / ml par 1 mg de protéine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57995/57995fig3v2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Ce protocole décrit une approche semi-automatisée pour produire des cellules semblables à des hépatocytes de cellules souches pluripotentes humaines dans un format de 96 puits plat. Ce processus est rapide et rentable, ce qui permet que la production de qualité assurée des lots de cellules semblables à des hépatocytes pour la recherche humaine fondamentale et appliquée.

Production semi automatisée de Hepatocyte comme cellules de cellules souches pluripotentes

Human pluripotent stem cells represent a renewable source of human tissue. Our research is focused on generating human liver tissue from human embryonic ...

Cette méthode produit des cellules hépatocytaires hautement reproductibles dans un format de 96 puits à l’aide de plateformes semi-automatisées. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est rapide, rentable, avec une variation réduite et permet la production de masse de plaques de 96 puits de cellules de type hépatocytaire. Préparez une solution de cinq microgrammes par millilitre de laminine 521 décongelée en la diluant dans une solution saline tamponnée au phosphate Dulbecco’s glacée ou dans du DPBS avec du calcium et du magnésium.À l’aide d’un distributeur automatique de liquide doté d’une cassette de distribution de tube standard, ajoutez 50 microlitres de la solution de laminine 521 par puits d’une plaque de 96 puits. Incuber les plaques revêtues de laminine 521. Après l’incubation, aspirez la solution de laminine 521 de la surface revêtue, à l’aide d’un adaptateur d’aspiration à huit canaux et évitez tout contact avec la surface revêtue.Ajouter immédiatement 50 microlitres par puits de milieu mTeSR1 complété par 10 micromolaires de kinase associée à Rho ou d’inhibiteur de ROCK Y27632. Conservez la plaque dans un incubateur jusqu’à ce que l’ensemencement cellulaire soit à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2. D’une suspension cellulaire de trois fois 10 à la cinquième cellule par millilitre dans le milieu mTeSR1 complété par 10 micromolaires inhibiteur de ROCK Y27632.Ajoutez 50 microlitres de suspension cellulaire sur la plaque. Après l’ensemencement, remettez les plaques dans l’incubateur de cellules à 37 degrés Celsius, 5 % de CO2, pendant 24 heures pour permettre aux cellules de se fixer. Après avoir sorti la plaque de l’incubateur, examinez la plaque le lendemain et vérifiez que le contact de cellule à cellule a été établi et que la confluence atteint 40 %, puis passez aux milieux de différenciation.La confluence cellulaire fait appel au début de la différenciation. Il est essentiel d’obtenir une bonne qualité de cellules semblables à celles des hépatocytes. Le début de la différenciation, une fois que la confluence atteint 40 %Si la confluence est plus élevée, les plaques ne sont pas bien adaptées à la différenciation.24 heures après l’ensemencement, retirer soigneusement le milieu à l’aide d’une pipette électronique à main automatique. Et ajoutez 100 microlitres de milieu d’amorçage endodermique frais complété par 100 nanogrammes par millilitre d’activine A et 50 nanogrammes par millilitre de Wnt3a. Après l’induction définitive de l’endoderme, passer au milieu KSR DMSO pour la spécification de l’hépatoblaste.Et changez de support tous les deux jours pendant cinq jours. Après la différenciation de l’hépatoblaste, retirez le milieu KSR DMSO et lavez les cellules une fois avec le milieu HepatoZYME sans le supplément. Après le lavage, ajoutez 100 microlitres de milieu de maturation HepatoZYME complété par 10 nanogrammes par millilitre de facteur de croissance hépatocytaire et 20 nanogrammes par millilitre d’Oncostatin M.Changez le milieu toutes les 48 heures pendant sept à dix jours.Au 18e jour de la différenciation, fixez les cellules et effectuez l’immunocytochimie, en utilisant la manipulation des liquides et le laveur automatique de plaques. Conservez les plaques à quatre degrés Celsius dans l’obscurité jusqu’à l’imagerie. Poursuivez avec l’imagerie et la quantification.Le 18e jour, la variabilité et le nombre de cellules entre les puits ont été examinés après la coloration au DAPI. Après la capture de sept champs de vision par puits et la quantification du nombre de noyaux, aucune différence statistique n’a été identifiée. La coloration des cellules hépatocytaires humaines ou HLC au jour 18 a montré l’expression des marqueurs hépatocytaires HNF4 alpha, l’albumine et l’AFP.Les HLC ont également exprimé les protéines CYP P450, CYP2D6 et CYP3A4 ont montré une activité métabolique CYP P450. Les HLC présentaient également un aspect polygonal distinct, montré par l’E-cadhérine. Malgré la standardisation de ce protocole, la confluence cellulaire avant la différenciation est essentielle pour la différenciation des HRC.Nous voyons la cellule indépendante. Par conséquent, l’ensemencement de vente et l’optimisation de la densité sont nécessaires pour chaque lignée cellulaire. Une fois maîtrisée, cette méthodologie permet la génération rapide de plusieurs plaques de cellules hépatiques humaines pour la modélisation de maladies, le criblage de médicaments ou les études de proposition de médicaments.Ce système permet la génération d’ensembles de données multiparamétriques pour l’analyse mécaniste de la biologie des hépatocytes.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

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Production semi automatisée de Hepatocyte comme cellules de cellules souches pluripotentes

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