Enrichissement phosphopeptide couplée à la spectrométrie masse Quantitative exempte d’étiquette d’enquêter sur le Phosphoproteome dans le Cancer de la Prostate

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans tout domaine de recherche où le signal de phosphorylation est d’intérêt, comme le domaine du cancer, pour évaluer les changements dans les réseaux de signalisation après une résistance thérapeutique. Le principal avantage de cette technique est que des milliers de phosphopeptides peuvent être identifiés de manière relativement simple et peu coûteuse pour évaluer globalement le phosphoprotéome. Pour prélever du tissu tumoral, pesez la tumeur et dans un tube à essai de culture, ajoutez deux millilitres de tampon de lyse glacée pour 100 milligrammes de tissu.

Utilisez ensuite un homogénéisateur à main ou de paillasse pour homogénéiser le lysat. Pour réduire et altérer l’échantillon, chauffez le tube à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis refroidissez l’échantillon sur de la glace pendant 15 minutes. Pendant qu’il est encore sur la glace, sonicez le lysat trois fois, puis chauffez l’échantillon à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Placez le tube de sonication dans un rotor à godets oscillants et centrifugez le lysat à 3 500 g et 15 degrés Celsius pendant 15 minutes, puis récupérez le surnageant et jetez la pastille. Pour digérer le lysat, utilisez 100 millimolaires de tris pour diluer l’échantillon 12 fois afin de réduire la quantité de guanidinium. Pour cinq milligrammes de protéines, ajoutez 10 microgrammes de lysyl endopeptidase ou de lys-C et incubez l’échantillon à température ambiante pendant cinq à six heures.

Préparez un milligramme par millilitre de trypsine traitée au TPCK dans un HCL millimolaire avec 20 millimolaires de chlorure de calcium et de trypsine ajoutés dans un rapport trypsine/protéine de 1 à 100. Incuber l’échantillon à 37 degrés Celsius pendant trois heures. Ajoutez ensuite une aliquote supplémentaire de trypsine dans le tube et incubez l’échantillon à 37 degrés Celsius pendant la nuit.

Ajouter l’échantillon dans un filtre de coupure de 15 millilitres et 10 kilodaltons. Centrifuger l’échantillon dans un godet oscillant ou un rotor à angle fixe à 3 500 g et 15 degrés Celsius jusqu’à ce que le volume de rétentat soit inférieur à 250 microlitres. Ensuite, récupérez l’écoulement et jetez le rétentat.

Pour acidifier l’échantillon, ajoutez environ 20 microlitres d’acide trifluoroacétique à 5 % ou TFA par millilitre de lysat. Mélangez bien le tube et utilisez une bandelette de pH pour mesurer le pH. Si nécessaire, ajoutez 5 % d’AGZ supplémentaire pour ajuster le pH à 2,5.

Ensuite, connectez-vous à l’extrémité la plus courte d’une colonne C18 à un collecteur à vide. Après avoir réglé le vide entre 17 et 34 kilopascals, utilisez trois millilitres d’acétonitrile à 100 % et une pipette en verre pour mouiller la colonne. Équilibrer la colonne à l’aide d’une pipette en verre et appliquer deux aliquotes de trois millilitres de 0,1 % TFA.

Chargez ensuite l’échantillon acidifié sur la colonne. Utilisez trois volumes de trois millilitres de 0,1 TFA pour laver la colonne. Appliquez ensuite deux millilitres de 40 % d’ACN 0,1 % d’AGZ pour éluer l’échantillon et prélevez deux fractions de deux millilitres dans des tubes de culture en verre.

Avec du parafilm, couvrez les tubes d’éluant et utilisez une aiguille de calibre 20 pour percer trois à cinq trous dans le couvercle avant de lyophiliser les échantillons pendant la nuit. Remettez en suspension la poudre lyophilisée avec 0,5 millilitre d’immunoprécipitation glacée ou de tampon de liaison IP dans chaque fraction. Transférez le volume de remise en suspension de 0,5 millilitre de la deuxième fraction dans le tube avec la première fraction et enregistrez la pointe de la pipette.

Utilisez encore 0,5 millilitre de tampon IP pour rincer chaque tube de lyophilisation avant de transférer le contenu dans le cryotube, puis répétez le rinçage à l’aide de deux millilitres de tampon IP. Après avoir utilisé un P200 avec une pointe coupée pour transférer le stock de 0,5 milligramme par millilitre de boue de billes d’anticorps dans le tube de microfuge, ajoutez 450 microlitres de tampon de liaison IP glacé pour laver 50 microlitres de boue de billes d’anticorps 4G10 et 25 microlitres de boue de billes d’anticorps 27 B10.4 dans un tube de microfuge. Centrifugez le tube à 100 g et quatre degrés Celsius pendant une minute.

Après avoir aspiré le surnageant, ajoutez un volume égal à celui de la boue d’origine de tampon de liaison IP pour remettre les billes en suspension. Ajoutez des billes de pY prélavées à la solution d’échantillon remise en suspension dans les cryotubes à bouchon à vis, puis incubez-les à quatre degrés Celsius sur un rotateur bout à bout pendant la nuit. Après avoir filé les billes, conservez le surnageant qui sera utilisé pour enrichir les peptides pST.

Ensuite, utilisez 300 microlitres de tampon de liaison IP pour remettre les billes en suspension et les transférer dans un tube de microcentrifugation de deux millilitres. Faites tourner les échantillons à 100 g et quatre degrés Celsius pendant une minute. Ensuite, avec 500 microlitres de tampon de liaison IP, lavez les billes trois fois.

Lavez les billes quatre fois avec 450 microlitres de bicarbonate d’ammonium de 25 millimolaires pH 7,5. Trempez une pointe de chargement de gel légèrement sous la surface de la perle et aspirez complètement le surnageant. Ajoutez quatre fois le volume de perle de 0,1 % de TFA aux billes.

Ensuite, mélangez-les bien et incubez le tube dans un thermomélangeur à 1 000 tr/min et 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Transférez la remise en suspension dans un filtre à essorage de 0,2 micromètre et centrifugez le filtre à 850 g pendant une minute. Après avoir transféré l’élution dans un tube de microcentrifugation à faible teneur en protéines, concentrez l’éluant sous vide à 40 degrés Celsius avec un temps de chaleur de 300 minutes pendant la nuit.

Pour préparer les billes d’oxyde de titane contenues dans les embouts, ajoutez 200 microlitres de 100 %ACN. Ensuite, retournez-le et effleurez l’extrémité étroite pour déplacer le liquide vers le bouchon. À l’aide d’une lame de rasoir, coupez la pointe et placez-la sur le tube de liaison à faible teneur en protéines.

Retirez ensuite le capuchon et insérez une micropipette pour plonger l’ACN restant avant de répéter le lavage. Préconditionnez deux fois le dioxyde de titane avec 500 microlitres de 100 % ACN. Ensuite, conditionnez le dioxyde de titane avec 500 microlitres de tampon de phosphate de sodium 0,2 molaire pH 7 deux fois.

Enfin, utilisez 300 microlitres de tampon d’équilibrage pour laver les billes trois fois. Ajoutez 400 microlitres de 50 % d’ACN 0,1 % d’AFT dans le tube de liaison à faible teneur en protéines. Ajoutez ensuite 84 microlitres d’acide lactique.

Transférez les phosphopeptides remis en suspension dans le tube de liaison à faible teneur en protéines et incubez-les à température ambiante à l’aide d’un rotateur bout à bout pendant une heure. Après avoir granulé les billes, utilisez 300 microlitres de tampon d’équilibrage pour les laver deux fois et les essorer. Avec 300 microlitres de tampon de rinçage, rincez les billes deux fois.

Transférez-les ensuite dans un filtre à essorage de 0,2 micromètre. Après l’essorage, transférez l’unité de filtration dans un tube de liaison propre à faible teneur en protéines de 1,5 millilitre et avec 200 microlitres d’ammonium à 0,9 % dans l’eau, éluez le contenu deux fois. Après avoir vérifié le pH, concentrez l’éluant sous vide à sec pendant la nuit pour évaporer l’ammoniac.

Pour dessaler les peptides pour l’analyse MS, reconstituez les phosphopeptides avec 15 microlitres de TFA à 0,1 %. Nettoyez l’échantillon à l’aide d’une pointe C18 d’une capacité de liaison de cinq microgrammes et suivez le protocole du fabricant. Enfin, après avoir complètement séché le volume d’élution par concentration sous vide, remettre en suspension les phosphopeptides séchés dans 12,5 microlitres de solution de spectrométrie de masse.

Ce gel de lysat prédigéré coloré à Coomassie confirme la présence de protéines tandis que la coloration du lysat post-digéré confirme la digestion complète. Pour une digestion complète, aucune bande ne doit apparaître au-dessus de 15 kilodaltons, à l’exception des bandes de 30 kilodaltons et 23,3 kilodaltons pour la lys-C et la trypsine respectivement. L’ajout de lys-C réduit également le nombre de clivages manqués.

L’immunoprécipitation pY sépare efficacement les peptides pY des peptides pST étaient en moyenne 85 % des phosphopeptides identifiés à partir de la préparation pY sont pY et plus de 99 % des phosphopeptides identifiés à partir de la préparation pST sont pST. Le dioxyde de titane est utilisé pour enrichir les phosphopeptides dans les deux préparations. Le pourcentage attendu de peptides phosphorylés dans la préparation prête à l’emploi pour la MS est compris entre 30 et 50 % et la majorité des phosphopeptides détectés ont un groupe phosphoryle simple ou double.

Après avoir effectué la spectrométrie de masse, les fichiers bruts MS sont chargés dans un logiciel d’analyse MS. Comme illustré ici, la définition d’un seuil de probabilité de localisation supérieur à 0,75 filtre environ 5 % des peptides pY et 15 % et 34 % des peptides pS et pT respectivement. Après l’application de ces filtres, le nombre prévu d’identifications de phosphopeptides à la fin de l’analyse MS est d’environ 300 peptides pY pour cinq milligrammes de la protéine de départ et d’environ 7 500 peptides pS et 640 peptides pT pour 2,5 milligrammes de la quantité de peptide de départ des préparations d’enrichissement respectives.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en six jours si les pas pY et pST sont effectués en parallèle. Cependant, pour plus de huit échantillons, effectuez les étapes dans l’ordre pour réduire les erreurs techniques sur quatre jours supplémentaires. Lors de la tentative de ces procédures, il est important de ne pas oublier de se concentrer sur les détails.

Chaque étape est importante et peut affecter la qualité des préparations finales, y compris les contrôles de qualité nécessaires. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’extraire et de digérer les protéines, suivie de l’enrichissement en phosphopeptide pour l’analyse par spectrométrie de masse afin d’étudier les changements globaux dans le phosphoprotéome.