Analyse transcriptomique unicellulaire de cellules endocrines pancréatiques de souris

Cette méthode peut avoir répondre aux questions clés dans le champ pancréatique d’îlot au sujet de la différenciation pancréatique de lignée d’îlot, de la maturation, et de la régénération. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet la collecte de cellules d’îlot pancréatique unique pour la génération de données de séquençage à ARN unique de haute qualité. L’application de cette technique s’étend vers la thérapie du diabète et les autres maladies endocriniennes pancréatiques connexes par l’analyse transcriptomique des cellules individuelles endocriniennes pancréatiques sur les conditions pathologiques.

La démonstration visuelle de cette méthode est critique car l’insertion de l’aiguille dans le canal biliaire étroit du pancréas pour la perfusion peut être délicate. Pour le jour embryonnaire 17,5 embryons. Après avoir ouvert la cavité abdominale, utilisez des pinces à épiler pour transférer le tissu viscéral dans un plat noir de fond de six centimètres contenant du PBS froid.

Utilisez des forceps pour détacher le pancréas du tissu viscéral. Et placez le tissu pancréatique dans un flacon de 20 millilitres contenant cinq millilitres de solution froide de collagène. Pour la journée postnatale zéro à 15 souris, disséquer soigneusement tous les lobes du pancréas avant de placer le tissu dans la collagène.

Pour le jour postnatal 18 à 60 souris, retirez d’abord le xiphoïde et extrayez l’intestin sur le côté droit de la cavité abdominale. Poussez les lobes médials gauche et droit du foie de chaque côté pour exposer la vésicule biliaire et le canal biliaire commun. Et serrez le dudénocumum avec une paire de pinces de petit navire aux positions supérieures et inférieures pour flanquer le site où le canal biliaire entre dans le dudéno.

Ensuite, chargez une seringue de 5 millilitres équipée d’une aiguille de calibre 30 avec solution de collagène froid. Et utilisez le microscope pour insérer la pointe de l’aiguille dans la vésicule biliaire. Manipuler soigneusement et en douceur l’aiguille à travers le canal biliaire commun.

Et déprimez le piston pour parcourir le pancréas avec un à cinq millilitres de la solution de collagène selon la taille de la souris. Lorsque toute la solution a été perfusée, utilisez des forceps pour transférer immédiatement le pancréas dans un flacon de 20 millilitres contenant cinq millilitres de solution de collagène froid frais. Lorsque tout le tissu pancréatique a été recueilli, placez le flacon dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant trois minutes, suivi de trois à cinq minutes de secousses douces.

Filtrez ensuite le produit digéré à travers une passoire en nylon de 0,25 millimètre dans un nouveau tube de centrifugeuse de 50 millilitres. Et utilisez une seringue de 20 millilitres contenant du PBS glacé pour bien laver la passoire. Pour le jour postnatal 18 à 60 pancréata, centrifugez l’échantillon filtré et résuspendez le tissu en 30 millilitres de PBS froid.

Puis décanter la suspension tissulaire dans un plat de fond noir de six centimètres, et utiliser une pipette de 200 microlitres et un microscope dissection pour ramasser les îlots pour le transfert dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre contenant un petit volume de PBS froid. Pour le jour embryonnaire 17.5 post natal jour 15 pancréata, centrifugeuse le tissu pancréatique filtré et resuspendre la pastille dans la solution trypsine-EDTA pour une incubation de quatre minutes dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, essayez doucement d’évaluer la pastille pendant une minute avec une pipette de 200 microlitres, suivie de l’ajout de 0,5 fois le volume de sérum bovin fœtal froid avec un léger vortex pour arrêter la digestion.

Puis recueillir le digest par centrifugation et résuspendre les cellules dans 200 microlitres de tampon FACS dans un tube FACS de 5 millilitres pour le tri par cytométrie d’écoulement. Pour la cueillette et la lyse à cellule unique, aliquot tampon de lyse cellulaire fraîchement préparé en huit tubes DE PCR bande, et transférer une seule cellule dans chacun. Vortex les échantillons pour lyse les cellules pour la libération de l’ARN, suivie d’une centrifugation pendant 30 secondes à quatre degrés Celsius, et le stockage immédiat sur la glace.

Pour la transcription inversée, incuber les lysates pendant trois minutes à 72 degrés Celsius suivies d’une minute sur la glace. Centrifugez brièvement les échantillons pendant 30 secondes à quatre degrés Celsius et ajoutez 5,7 microlitres de mélange de transcription inverse à chaque échantillon pour porter le volume total à 10 microlitres pour chaque échantillon. Après un léger vortex et centrifugation, chargez les échantillons dans un thermocycleur et démarrez le programme de transcription inverse.

Pour la préamplification de la réaction en chaîne de polymélas, ou PCR, ajoutez 15 microlitres de mélange PCR à chaque échantillon contenant les premières réactions de brin, suivies d’un léger vortex et centrifugation. Chargez ensuite les échantillons dans le thermocycleur et démarrez le programme PCR. Pour la purification pcr, ajouter 25 microlitres de perles de purification de l’ADN résuspendues à chaque échantillon, et bien mélanger par vortex.

Puis faites tourner rapidement les échantillons à température ambiante pour recueillir le liquide tout en évitant le règlement des perles. Après cinq minutes à température ambiante, placez les échantillons sur un support magnétique approprié, en enlevant soigneusement et en jetant le supernatant lorsque la solution est claire. Lavez les perles avec deux lavages de 30 secondes dans 200 microlitres de 80 % d’éthanol fraîchement préparé par lavage.

Et jeter le reste de l’éthanol après le deuxième lavage. Lorsque les perles ont séché l’air, ajouter 11 microlitres d’eau sans nucléase pour élucider la cible d’ADN des perles, suivie d’un vortex. Ensuite, centrifugez rapidement les échantillons, retournez les échantillons au support magnétique jusqu’à ce que la solution soit claire et transférez 10 microlitres de chaque échantillon dans un nouveau tube PCR.

L’ADND amplifié avec succès devrait avoir une longueur totale supérieure à 500 paires de base et être enrichie de paires de base de 1,5 à 2 kilos. En outre, il y a habituellement un enrichissement de paire de base de 500 à 600 cDNA observé dans l’insuline un RFP plus des cellules, qui peuvent représenter les transcriptions d’insuline. Cependant, les fragments de cDNA près de 100 paires de base sont des dimers d’amorce, qui sont habituellement provoqués par des amorces excessives et qui doivent être enlevés en répétant l’étape de purification d’ADN.

Les fragments de l’ADNC entre 100 et 500 paires de base représentent habituellement une ADND dégradée, qui est causée par un mauvais état cellulaire ou des problèmes de région, tels que la contamination par la RNase et devraient être exclus. Après la purification des bibliothèques cDNA pour le séquençage, cDNA allant de 250 à 450 paires de base peuvent être obtenus grâce à l’ajout de perles de purification de l’ADN à la première et deuxième ronde de purification. Après purification de perle d’ADN, le score de qualité de séquençage devrait être supérieur à 30 pendant l’évaluation de qualité de séquençage.

Pour obtenir des cellules de haute qualité pour les analyses en aval, les cellules de moins de 0,5 million de lecture cartographiées ou contenant moins de 4 000 gènes détectés sont exclues, ce qui facilite la caractérisation de différents groupes de cellules et l’identification de gènes qui sont exprimés hétérogènement en différents groupes après l’analyse des composants principaux et le regroupement hiérarchique. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de perfuser le pancréas rapidement avant la digestion de collagène pour éviter l’îlot au-dessus de la digestion et pour maintenir l’environnement libre de RNase pendant les procédures de cellule simple. Après cette procédure, d’autres méthodes comme l’imagerie et la culture des îlots peuvent être effectuées pour faciliter la visualisation de la structure de l’îlot et pour examiner les réponses cellulaires et la stimulation des médicaments.

Après le développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de la recherche pancréatique pour explorer les mécanismes du développement et de la régénération de la lignée des îlots, ainsi que la progression du diabète chez les mammifères.