Name: Extraction rapide, sûre et Simple acide nucléique chevet manuelle pour la détection des Virus dans des échantillons de sang total (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Apprenez une méthode d'extraction d'acides nucléiques viraux à partir de sang total inactivé, réalisable sans équipement de laboratoire ni électricité. Cette technique manuelle permet des diagnostics rapides sur le terrain et dans les hôpitaux de campagne.

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Nous remercions Susanne Lopes Rasmussen et Solvej Kolbjørn Jensen pour leur assistance technique et pour manipuler les échantillons cliniques. Ce projet fait partie du consortium EbolaMoDRAD, qui a reçu un financement de l’innovants médecine Initiative 2 entreprise commune au titre de la subvention contrat N ° 115843. Cette entreprise commune bénéficie du soutien de la recherche Horizon 2020 de l’Union européenne et l’EFPIA et programme d’innovation.

Le Comité sur l’éthique de la recherche biomédicale, région de la capitale a donné un consentement éclairé, et toutes les méthodes décrites ici ont été exemptés de l’examen par le système des comités éthiques, conformément à la loi danoise sur les projets de développement de test.
1. préparation des Tubes sous vide de prélèvement sanguin pour l’Inactivation des Virus et Extraction rapide de NA
ATTENTION : La mémoire tampon utilisée pour ce protocole contient guanidinium thiocyanate (GITC) et un agent tensio-actif non ionique, qui sont irritants. Prendre des mesures de sécurité de laboratoire appropriés, utiliser une hotte à flux et porter des gants pour manipuler. Éviter toute peau et contact avec les yeux. Si la mémoire tampon a été renversé, la surface contaminée ne doit jamais être désinfectée directement avec la chloramine ou hypochlorite de sodium (les ingrédients actifs de « bleach ») parce que ce mélange peut conduire à la formation de cyanure toxique. Tout d’abord, enlever le tampon déversé avec du papier absorbant. Ensuite, nettoyez la surface avec l’éthanol à 70 %, puis avec de l’eau et pour finir, utilisez chloramine ou hypochlorite de sodium.
<ol><li>Pour préparer les tubes sous vide de prélèvement sanguin, injecter 1,6 mL de tampon lyse commerciale spécifique dans un tube à vide 4 mL EDTA en perforant le couvercle du tube à l’aide d’une aiguille de 25 x 1 et une seringue de 3 mL. Remarque : Ne pas retirer le couvercle du tube. Le vide doit être maintenu.</li>
	<li>Stocker les tubes à vide contenant le tampon à la température ambiante jusqu'à utilisation. NOTE : Les tubes sont stables pendant au moins 1 an après leur préparation.</li>
</ol>2. préparation des tampons pour l’Extraction de NA
<ol><li>Pour préparer les tampons pour une extraction de NA, placer deux 1,8 mL, deux 4,5 mL et un 3,6 mL tubes dans un rack.</li>
	<li>Ajouter par pipetage, 960 µL de particules de verre magnétique (POP) à un tube propre 1,8 mL et étiquette avec pop.. remettre en suspension la suspension du projet gazier Mackenzie complètement avant de pipetage il. NOTE : Les POP ont tendance à recueillir rapidement au fond du tube.</li>
	<li>Ajouter, en pipettant également, 4 mL de tampon de lavage j’ai dans un tube propre 4,5 mL et l’étiquette en tant que WB-1. ATTENTION : Tampon de lavage j’ai contient du chlorure guanidinium, qui est irritant. Prendre des mesures de sécurité de laboratoire appropriés, utiliser une hotte à flux et porter des gants pour manipuler. Éviter toute peau et contact avec les yeux.</li>
	<li>Ajouter, par pipetage, 1,5 mL de tampon de lavage II dans un tube propre 3,6 mL et étiquetez-le comme WB-2.</li>
	<li>Ajouter, en pipettant également, 3 mL de tampon de lavage III dans un tube propre 4,5 mL et l’étiquette que WB-3.</li>
	<li>Ajouter, en pipettant également, 100 µL de tampon d’élution dans un tube propre 1,8 mL et étiquetez-le comme EB.</li>
	<li>Conserver les tampons aliquotés à température ambiante jusqu'à l’utilisation. NOTE : Les tubes sont stables pendant au moins 1 mois après leur préparation.</li>
</ol>3. Blood Collection provenant de Patients présentant des signes et symptômes d’une infection par le Virus
ATTENTION : Prendre des mesures de sécurité de laboratoire appropriées lors de la collecte de sang du patient. Porter des gants et des lunettes. Si le patient est en isolement, s’il vous plaît suivre les procédures de sécurité biologique niveau 4.
<ol><li>Pour collecter par voie intraveineuse du sang du patient, utiliser une aiguille à ailettes avec tube de rallonge de petit calibre et un tube vide de prélèvement contenant un tampon de lyse/liaison. Reposer le bras du patient dans une position à la baisse et positionner le tube de prélèvement inférieur à l’aiguille à ailettes. Insérer l’aiguille à ailettes dans la veine du patient et attacher le tube de prélèvement sous vide à l’extension de petit calibre. Remarque : Cela évitera les reflux.</li>
	<li>Après la collecte de sang, mélanger le contenu du tube en renversant le tube de 5 à 10 fois. Remarque : En raison de la dépression reste dans le tube de prélèvement de sang contenant 1,6 mL de tampon de lyse/liaison, le volume de l’échantillon prélevé sera automatiquement 1,6 mL.</li>
	<li>Désinfecter l’extérieur du tube à l’aide d’éthanol à 70 %.</li>
	<li>Incuber les tubes pendant 20 min à température ambiante. Remarque : Le protocole peut être suspendu ici et les tubes de prélèvement de sang peuvent être conservés à-20 ° C, 5 ° C, 25 ° C ou 37 ° C pendant au moins 1 mois7.</li>
	<li>Passez directement à la méthode d’extraction NA simplifiée.</li>
</ol>4. simplifier l’Extraction NA germains
<ol><li>Pour purifier les NA de la lyse/liaison inactivés par tampon sang, mélange le contenu du tube en faisant basculer l’aspirateur tube à la main 5-10 x.</li>
	<li>Retirez le couvercle du tube délicatement et décharger le couvercle.</li>
	<li>Versez l’aliquote préparé de pop. (1 mL) directement dans le tube de prélèvement de sang.</li>
	<li>Placer un nouveau couvercle d’un tube de prélèvement de sang non utilisé sur le tube contenant l’échantillon.</li>
	<li>Placer un doigt sur le couvercle afin d’assurer que le tube est bien fermé et mélanger le contenu du tube en renversant le tube de prélèvement de sang à la main 5 - 10 fois.</li>
	<li>Placer le tube dans le support magnétique et garder un doigt sur le couvercle afin d’assurer que le tube est bien fermé.</li>
	<li>Retourner le support magnétique avec le tube quelques fois à la main pour s’assurer que tous les pop est collectés sur le côté du tube avec l’aimant. NOTE : Le support magnétique peut être remplacé par un aimant allongé et un élastique.</li>
	<li>Retirez le couvercle du tube et jeter le contenu du tube à l’aide d’une pipette à usage unique ou simplement en versant le contenu dans un tube de prélèvement de 50 mL. Remarque : Éviter les aérosols provenant du tube de prélèvement de 50 mL en fermant le tube avec un couvercle.</li>
	<li>Verser l’aliquote préparé de WB-1 (4 mL) directement dans le tube de prélèvement de sang.</li>
	<li>Placez le couvercle sur le tube et placer un doigt sur le couvercle afin d’assurer que le tube est bien fermé.</li>
	<li>Retirez le tube du Magnet holder, garder le couvercle bien serré avec un doigt. Remarque : Si vous utilisez un aimant et un élastique, supprimez simplement l’élastique et l’aimant du tube.</li>
	<li>Resuspendre le pop en retournant le tube de prélèvement de sang à la main 5 - 10 fois.</li>
	<li>Répétez les étapes 4,6 et 4,8.</li>
	<li>Verser l’aliquote préparé de WB-2 (1,5 mL) directement dans le tube de prélèvement de sang.</li>
	<li>Placez le couvercle sur le tube et retirez le tube du support magnétique. Remarque : Si vous utilisez un aimant et un élastique, supprimez simplement l’élastique et l’aimant du tube.</li>
	<li>Placer un doigt sur le couvercle afin d’assurer que le tube est bien fermé.</li>
	<li>Remettre en suspension le pop en renversant le tube de prélèvement sanguin pendant quelques secondes à la main.</li>
	<li>Répétez l’étape 4,6 et 4,8.</li>
	<li>Verser l’aliquote préparé de WB-3 (3 mL) directement dans le tube de prélèvement de sang.</li>
	<li>Placez le couvercle sur le tube et retirez le tube du support magnétique. Remarque : Si vous utilisez un aimant et un élastique, supprimez simplement l’élastique et l’aimant du tube.</li>
	<li>Placer un doigt sur le couvercle afin d’assurer que le tube est bien fermé.</li>
	<li>Resuspendre le pop en retournant le tube de prélèvement de sang à la main 5 - 10 fois.</li>
	<li>Répétez les étapes 4,6 et 4,8.</li>
	<li>Versez l’aliquote préparé d’EB (100 µL) directement dans le tube de prélèvement de sang.</li>
	<li>Placez le couvercle sur le tube et retirez le tube du support magnétique. Remarque : Si vous utilisez un aimant et un élastique, supprimez simplement l’élastique et l’aimant du tube.</li>
	<li>Resuspendre le pop dans l’EB en tapant sur le tube de prélèvement de sang 5 - 10 fois avec un doigt. Remarque : Le protocole peut être suspendu ici, et les tubes peuvent être conservés à-20 ° C.</li>
	<li>Transférer une gouttelette (5-8 µL) de suspension pop au mélange en aval de réaction d’amplification de NA à l’aide d’une pipette à usage unique 1,5 mL (toute amplification en aval de NA diagnostique assay tels que lampe/RT-lampe ou qPCR/RT-qPCR dosages peuvent être utilisés). Remarque : Le NAs va s’en tenir à la pop, alors n’oubliez pas d’utiliser le pop dans la réaction d’amplification en aval de NA. Mélanger la suspension du projet gazier Mackenzie avant utilisation. Après avoir mélangé, pop recueillera au fond du tube.</li>
</ol>

<ol><li>Lee, D., Shin, Y., Chung, S., Hwang, K. S., Yoon, D. S., Lee, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+Highly+Sensitive+Molecular+Diagnosis+of+Zika+Virus+by+Lateral+Flow+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays.</a> Analytical Chemistry. 88, 12272-12278 (2016).</li>
<li>Benzine, J. W., Brown, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Diagnostic+Field+Test+for+Point-of-Care+Detection+of+Ebola+Virus+Directly+from+Blood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Molecular Diagnostic Field Test for Point-of-Care Detection of Ebola Virus Directly from Blood.</a> Journal of Infectious Diseases. 214 (Suppl 3), S234-S242 (2016).</li>
<li>Faye, O., Faye, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+deployment+of+a+rapid+recombinase+polymerase+amplification+Ebola+virus+detection+assay+in+Guinea+in+2015%5BTitle%5D)+AND+%22Euro+Surveillance%22%5BJournal%5D)">Development and deployment of a rapid recombinase polymerase amplification Ebola virus detection assay in Guinea in 2015.</a> Euro Surveillance. 20 (44), 10-18 (2015).</li>
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<li>Smither, S. J., Weller, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Buffer+AVL+alone+does+not+inactivate+Ebola+virus+in+a+representative+clinical+sample+type%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Buffer AVL alone does not inactivate Ebola virus in a representative clinical sample type.</a> Journal of Clinical Microbiology. 53 (10), 3148-3154 (2015).</li>
<li>Byrnes, S., Fan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Portable%2C+Pressure+Driven%2C+Room+Temperature+Nucleic+Acid+Extraction+and+Storage+System+for+Point+of+Care+Molecular+Diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Methods%22%5BJournal%5D)">A Portable, Pressure Driven, Room Temperature Nucleic Acid Extraction and Storage System for Point of Care Molecular Diagnostics.</a> Analytical Methods. 5 (13), 3177-3184 (2013).</li>
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<li>Schmitz, H., Köhler, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+clinical+and+laboratory+data+in+two+cases+of+imported+Lassa+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Monitoring of clinical and laboratory data in two cases of imported Lassa fever.</a> Microbes and Infection. 4 (1), 43-50 (2002).</li>
<li>De La Vega, M. A., Caleo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ebola+viral+load+at+diagnosis+associates+with+patient+outcome+and+outbreak+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Ebola viral load at diagnosis associates with patient outcome and outbreak evolution.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4421-4428 (2015).</li>
<li>Hasanoglu, I., Guner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+viral+load+in+Crimean+Congo+hemorrhagic+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of viral load in Crimean Congo hemorrhagic fever.</a> Journal of Medical Virology. 90 (4), 639-643 (2017).</li>
<li>Biava, M., Colavita, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+rapid+and+sensitive+RT-qPCR+assay+for+the+detection+of+Ebola+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a rapid and sensitive RT-qPCR assay for the detection of Ebola Virus.</a> Journal of Virological Methods. 252, 70-74 (2018).</li>
<li>Fernández-Carballo, B. L., McBeth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous-flow%2C+microfluidic%2C+qRT-PCR+system+for+RNA+virus+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Continuous-flow, microfluidic, qRT-PCR system for RNA virus detection.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (1), 33-43 (2017).</li>
<li>Weller, S. A., Bailey, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+Biofire+FilmArray+Biothreat+E-test+%28v2.5%29+for+rapid+identification+of+Ebola+virus+disease+in+heat-treated+blood+samples+obtained+in+Sierra+Leone+and+United+Kingdom%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the Biofire FilmArray Biothreat E-test (v2.5) for rapid identification of Ebola virus disease in heat-treated blood samples obtained in Sierra Leone and United Kingdom.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (1), 114-119 (2015).</li>
<li>Semper, A. E., Broadhurst, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+the+GeneXpert+Ebola+Assay+for+Diagnosis+of+Ebola+Virus+Disease+in+Sierra+Leone%3A+A+Field+Evaluation+Study%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Medicine%22%5BJournal%5D)">Performance of the GeneXpert Ebola Assay for Diagnosis of Ebola Virus Disease in Sierra Leone: A Field Evaluation Study.</a> PLoS Medicine. 13 (3), e1001980(2016).</li>
<li>Biocartis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Instructions+for+Use%3A+Idylla+TM+Ebola+Virus+Triage+Test%22">Instructions for Use: Idylla TM Ebola Virus Triage Test</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/downloads/MedicalDevices/Safety/EmergencySituations/UCM503944.pdf">https://www.fda.gov/downloads/MedicalDevices/Safety/EmergencySituations/UCM503944.pdf</a> (2016).</li>
<li>MPLC. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Total+Nucleic+Acid+Isolation+Kit.+Safety+data+sheet+version+1.7%22">Total Nucleic Acid Isolation Kit. Safety data sheet version 1.7</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://pim-eservices.roche.com/DownloadDocument/SDS/DE/en/03038505001">https://pim-eservices.roche.com/DownloadDocument/SDS/DE/en/03038505001</a> (2015).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans ce rapport, nous décrivons une sûre, rapide et simple chevet NA extraction méthode manuelle pour la détection moléculaire en aval d’un virus dans le sang d’entier inactivé tampon lyse/liaison. La méthode d’extraction NA décrite a été développée pour être effectuée directement sur des échantillons de sang prélevés dans les tubes de prélèvement sanguin sous vide contenant la lyse/fixation tampon (Table des matières)7. Cet mémoire tampon spécifique inactive EBOV<sup class="xref"...

En cas d’épidémie de virus, lorsque les patients sont confinés à l’hôpital d’isolement ou lorsqu’un diagnostic rapide est nécessaire, un diagnostic moléculaire précis, simple et sûr de point-of-care est impératif pour le confinement des soins et risque patient. Les deux récentes éclosions virales, du virus Ebola (EBOV) en Afrique de l’Ouest (2013) et le virus Zika en Amérique du Sud (2015), ont augmenté l’intérêt pour l’amélioration point-of-care moléculaires tests diagnostiques, comme isotherme boucle-négociée de transcription inverse amplification (RT-lampe)1,2 et recombinase polymérase amplification (RPA)3,4. RT-lampe tant l’APR sont des tests moléculaires rapides, sensibles et spécifiques qui peuvent être effectuées sur les préparatifs de l’exemple simplifié. Pour le virus Zika, RT-lampe a été combinée avec un essai d’écoulement latéral (LFA), qui peut détecter des virus Zika dans des échantillons de sang total non épurées dans 30 min1; Toutefois, pour EBOV, qui est classé comme un pathogène de groupe 4 risque et est extrêmement contagieuse, les échantillons doivent être gérées en vertu de la biosécurité de niveau 4 (BSL-4) les conditions et inactivés avant toute procédure de diagnostic sûr puisse être exécutée.
Méthodes d’inactivation simplifiée pour EBOV, telles que l’ajout de tampons de la lyse de l’échantillon2,3,4,5, ont été utilisés lors de l’épidémie ; Cependant, ces méthodes nécessitent un traitement dans des conditions de BSL-4 avec matériel de laboratoire, tels que BSL-3 armoires de biosécurité, centrifugeuses, blocs de chauffage et pipettes, au minimum. Cet équipement n’est pas normalement présent dans les quartiers d’isolement ou dans des hôpitaux de campagne. Pour relever ce défi, a tenté d’effectuer des diagnostics de valises3et plusieurs appareils portables et les machines ont été développées [par exemple, un appareil portatif pour l’extraction des acides nucléiques (NA)]6. Toutefois, les échantillons positifs EBOV encore besoin être inactif avant que ces dispositifs peuvent être utilisés.
Nous avons déjà rapporté une méthode d’inactivation des virus chevet rapide pour le EBOV7, virus de la vaccine et Cowpox virus8 par addition d’un tampon de lyse/liaison commerciale pour les tubes de prélèvement sanguin sous vide ordinaire, permettant le direct transfert de sang du patient dans l’inactivation tampon7. Cette inactivation directe et immédiate dans un système fermé élimine le besoin de manipuler les échantillons à l’aide de n’importe quel un confinement rigoureux, tels que BSL-4 conditions7, et les échantillons peuvent être traités dans des conditions normales de BSL-2. Cette méthode d’inactivation est compatible avec plusieurs systèmes d’extraction de la NA, tels que les robots et main purification kits7; Cependant, ces méthodes nécessitent des équipements de laboratoire, tels que les robots, centrifugeuses et l’électricité, qui ne sont pas toujours présents sur le terrain ou à l’intérieur de l’hôpital d’isolement.
Dans ce rapport, nous décrivons une sûre, rapide et simplifiée NA extraction méthode manuelle pour la détection moléculaire ultérieure d’un virus dans le sang d’entier inactivé tampon lyse/liaison. La méthode d’extraction de NA ne nécessite pas un équipement autre qu’un magnet/Magnet holder. Aucun centrifugeuses, blocs, ou électricité de chauffage ne sont nécessaires pour l’extraction de NA. Par conséquent, cette méthode ne dépend pas des installations de laboratoire et peut facilement être utilisé n’importe où (par exemple, dans des hôpitaux de campagne, dans les salles d’hôpital d’isolement, ou avec faibles ressources). La méthode d’extraction de NA est rapide et simple et peut être utilisée directement dans les tests de NA en aval, comme qPCR, RT-qPCR, lampe ou RT-lampe. Cette méthode d’extraction de NA est associé à la lampe et un instrument portable isotherme axée sur la batterie, un chevet diagnostic puisse être obtenu dans 40 min de la collecte de sang.

<table><tbody><tr><td>Vacutainer K2 Tubes EDTA (4 mL)</td><td>Becton Dickinson</td><td>368861</td><td></td></tr><tr><td>Plus Blood Collection</td><td>Becton Dickinson</td><td>362725</td><td></td></tr><tr><td>23G x 1 aiguille</td><td>Becton Dickinson</td><td>300800</td><td></td></tr><tr><td>Luer LOK seringue (3 mL)</td><td>Becton Dickinson</td><td>309658</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille papillon avec tube d’extension de petit calibre</td><td>J&oslash ; rgen Kruuse A/S</td><td>121714</td><td></td></tr><tr><td>1 % Virkon</td><td>Nomeco A/S</td><td>849265</td><td></td></tr><tr><td>MagNA Pure LC Kit d’isolement d’ADN I - Tampon de lyse/liaison - Recharge</td><td>Roche Diagnostics A/S</td><td>03246752001</td><td></td></tr><tr><td>MagNA Pure LC Kit d’isolement d’acide nucléique total</td><td>Roche Diagnostics A/S</td><td>3038505001</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&trade ; Tubes cryogéniques pour biobanques et cultures cellulaires (1,8 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>375418</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&trade ; Tubes cryogéniques pour biobanques et cultures cellulaires (3,6 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>379189</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&trade ; Tubes cryogéniques pour biobanques et culture cellulaire (4,5 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>379146</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag&trade ;-5 Magnet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12303D</td><td></td></tr><tr><td>Pipette de transfert (3,5 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1171.010</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&trade ; Samco&commerce ; Pipettes de transfert à pointe fine (1,5 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>231</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&trade ; Nunc&commerce ; Tubes à centrifuger coniques stériles en polypropylène de 50 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr></tbody></table>

extraction rapide, sûre et simple acide nucléique chevet manuelle pour la détection des virus dans des échantillons de sang total

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

Le diagnostic rapide d’une infection est essentiel pour la gestion des épidémies, le confinement de risque et les soins aux patients. Nous avons déjà montré une méthode pour l’inactivation rapide chevet du virus Ebola lors des prélèvements sanguins pour les tests de sécurité d’acide nucléique (NA) en ajoutant un tampon de lyse/liaison commerciale directement dans les tubes de prélèvement sanguin sous vide. Avec cette approche de chevet inactivation, nous avons développé une sûre, rapide et simplifiée chevet NA méthode d’extraction pour la détection ultérieure d’un virus dans le sang d’entier inactivé tampon lyse/liaison. L’extraction de la NA est effectuée directement dans les tubes de prélèvement sanguin et ne nécessite aucun équipement ou l’électricité.
Après que le sang est prélevé dans le tampon de lyse/liaison, les contenus sont mélangés en retournant le tube à la main, et le mélange est incubé pendant 20 min à température ambiante. Particules de verre magnétique (POP) sont ajoutés au tube, et le contenu est mélangé en retournant le tube de prélèvement à la main. Pop est ensuite recueillies sur le côté du tube de prélèvement à l’aide d’un support magnétique ou un aimant et un élastique. Les pop est lavées trois fois, et après l’addition de tampon d’élution, directement dans le tube de prélèvement, le NAs sont prêt pour les tests de NA, comme qPCR ou amplification isotherme boucle (lampe), sans l’élimination des pop de la réaction. La méthode d’extraction de NA ne dépend pas des installations de laboratoire et peut facilement être utilisé n’importe où (par exemple, dans les hôpitaux de campagne et les salles d’hôpital isolement). Lorsque cette méthode d’extraction de NA est combinée avec lampe et un instrument portatif, un diagnostic peut être obtenu au sein de 40 min de la collecte de sang.

Le protocole présenté ici est simple et efficace et peut être largement appliqué à n’importe quel test moléculaire à être effectuées sur des échantillons de sang infectieux inactivés avec le tampon de lyse/liaison. Le flux de travail pour l’inactivation de sang et l’extraction de la NA est illustré à la Figure 1, y compris la préparation de sang collection tubes à vide7 (Figure 1 a), le sang collection<sup...

Nous présentons ici un protocole pour l’extraction des acides nucléiques virus rapide de virus inactivés Germains. L’extraction est effectuée directement dans les tubes de prélèvement sanguin et ne nécessite aucun équipement ou l’électricité. La méthode ne dépend pas des installations de laboratoire et peut être utilisé n’importe où (par exemple, dans des hôpitaux de campagne).

Extraction rapide, sûre et Simple acide nucléique chevet manuelle pour la détection des Virus dans des échantillons de sang total

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Cette méthode peut aider lors de la réalisation de diagnostics sur le lieu d’intervention, de patients présentant des signes d’infections virales. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être réalisée sans équipement de laboratoire ni électricité, et peut donc être réalisée dans un service hospitalier. Le docteur Anders Fomsgaard et le scientifique Morten Rasmussen, tous deux de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure de prélèvement sanguin.Commencez par préparer les tubes de prélèvement sanguin. Utilisez une aiguille de calibre 25 d’un pouce attachée à une seringue de 3 ml pour injecter 1,6 ml d’un tampon de lyse commercial dans un tube à vide EDTA de 4 ml. Il est essentiel de maintenir le vide dans le tube de prélèvement sanguin pour le prélèvement sanguin.Par conséquent, utilisez toujours une aiguille pour injecter le tampon de lyse dans le tube de prélèvement sanguin. Ensuite, remettez complètement en suspension un volume de 960 microlitres de particules de verre magnétiques, ou MGP, et transférez-les dans un tube étiqueté de 1,8 ML. Ensuite, pipetez 4 ml de tampon de lavage dans un tube de 4,5 ml étiqueté WB-1,5 ml de tampon de lavage deux da

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Un outil et chimiques sont décrits pour séquentiellement isoler des acides nucléiques suivie par les protéines d'un échantillon sans la nécessité de l'électricité. L'outil se compose d'un sorbant lieu au sein d'une pipette de transfert, tandis que les chimies d'isolement sont basées sur des principes d'extraction en phase solide. Les macromolécules isolées peuvent être analysées par des tests immuno-base et basée sur la PCR.

Electricité-libre, l&#39;acide nucléique et séquentielle isolement des protéines

Source: Schaeffer, J. W., Chandler, et al. Detection of Viruses from Bioaerosols Using Anion Exchange Resin. J. Vis. Exp. (2018).This video demonstrates the detection of viruses from bioaerosols using an anion exchange resin. A liquid impinger containing the resin is used to capture viruses from the air. The resin is collected and treated with a virus lysis buffer containing carrier RNA. The lysate is transferred to a microcentrifuge tube for viral RNA isolation, followed by qRT-PCR to amplify...

Anion Exchange Resin–Based Detection of Viruses from Bioaerosols

Cette vidéo présente une technique d’extraction d’acides nucléiques à partir de sang humain total à l’aide de particules de verre magnétiques (MGP) - de petites billes magnétiques recouvertes de silice. Lors de la lyse des cellules sanguines à l’aide d’un tampon de lyse, les acides nucléiques libérés se lient à la surface des MGP recouverts de silice, extrayant les molécules de l’échantillon.

Technique d’extraction d’acide nucléique du sang par des particules de verre magnétique

TruTip est une technologie d'extraction de l'acide nucléique simple au moyen duquel une matrice de liaison poreuse monolithique est insérée dans un embout de pipette. Par conséquent, le format de la préparation de l'échantillon est compatible avec les instruments de manipulation les plus liquides, et peut être utilisé pour de nombreuses applications cliniques à moyen et à haut débit et types d'échantillons.

À haut débit, l&#39;extraction automatisée de l&#39;ADN et de l&#39;ARN dans des échantillons cliniques utilisant la technologie TruTip sur des robots de manipulation de liquide commune

tests de résistance des médicaments pour le VIH-1 individus infectés échec d'un traitement antirétroviral (ART) peut guider les futurs traitements et d'améliorer les résultats du traitement. Optimisation des individus et des populations résultats pour la santé de la prévalence élevée du VIH, mais les pays à ressources limitées finira par exiger le génotypage de la résistance aux médicaments abordables et accessibles et méthodes d'interprétation.

Une méthode de surveillance abordable VIH-1 pour la résistance aux médicaments à ressources limitées

Nous décrivons une méthodologie pour le traitement du sang total afin d’obtenir une variété de composants pour une analyse plus approfondie. Nous avons optimisé un protocole rationalisé qui permet un traitement simultané rapide et à haut débit d’échantillons de sang total dans un cadre non clinique.

Fractionnement rapide et isolement de composants de sang total dans les échantillons obtenus à partir d&#39;un milieu communautaire

Nous décrivons ici un procédé d'extraction d'ADN simple et rapide à base de papier d'ADN proviral du VIH dans le sang total détecté par PCR quantitative. Ce protocole peut être étendu pour une utilisation dans la détection d'autres marqueurs génétiques ou en utilisant des méthodes d'amplification alternatives.

Filtration Isolement des acides nucléiques: Une méthode d&#39;extraction de l&#39;ADN simple et rapide

Nous présentons ici VirWaTest, qui est une méthode simple, abordable et portable pour la concentration et la détection des virus à partir d'échantillons d'eau au point d'utilisation.

VirWaTest, une méthode de point d'utilisation pour la détection des virus dans les échantillons d'eau

Un projet de science citoyenne a été conçu pour recruter des résidents de San Diego afin de recueillir des échantillons environnementaux pour le SARS-CoV-2. Une plate-forme Web multilingue a été créée pour la soumission de données à l’aide d’une interface conviviale pour les appareils mobiles. Un système de gestion de l’information de laboratoire a facilité la collecte de milliers d’échantillons géographiquement diversifiés grâce au suivi des résultats en temps réel.

Écouvillonner l’environnement urbain - Un pipeline pour l’échantillonnage et la détection du SARS-CoV-2 dans les réservoirs environnementaux

Le protocole décrit une méthode de diagnostic du SRAS-CoV-2 qui utilise l’automatisation open source pour effectuer des tests moléculaires RT-qPCR sur des échantillons de salive. Cette approche évolutive peut être appliquée à la surveillance clinique de la santé publique ainsi qu’à l’augmentation de la capacité des petits laboratoires universitaires.

Stratégie de diagnostic de la salive par PCR à transcriptase inverse quantitative efficace du SRAS-CoV-2 utilisant des robots de pipetage open source

Apprenez une méthode d'extraction d'acides nucléiques viraux à partir de sang total inactivé, réalisable sans équipement de laboratoire ni électricité. Cette technique manuelle permet des diagnostics rapides sur le terrain et dans les hôpitaux de campagne.

Extraction rapide, sûre et Simple acide nucléique chevet manuelle pour la détection des Virus dans des échantillons de sang total (Vidéo) | JoVE Journal

Extraction rapide, sûre et Simple acide nucléique chevet manuelle pour la détection des Virus dans des échantillons de sang total

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