Extraction rapide, sûre et Simple acide nucléique chevet manuelle pour la détection des Virus dans des échantillons de sang total

Cette méthode peut aider lors de la réalisation de diagnostics sur le lieu d’intervention, de patients présentant des signes d’infections virales. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être réalisée sans équipement de laboratoire ni électricité, et peut donc être réalisée dans un service hospitalier. Le docteur Anders Fomsgaard et le scientifique Morten Rasmussen, tous deux de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure de prélèvement sanguin.

Commencez par préparer les tubes de prélèvement sanguin. Utilisez une aiguille de calibre 25 d’un pouce attachée à une seringue de 3 ml pour injecter 1,6 ml d’un tampon de lyse commercial dans un tube à vide EDTA de 4 ml. Il est essentiel de maintenir le vide dans le tube de prélèvement sanguin pour le prélèvement sanguin.

Par conséquent, utilisez toujours une aiguille pour injecter le tampon de lyse dans le tube de prélèvement sanguin. Ensuite, remettez complètement en suspension un volume de 960 microlitres de particules de verre magnétiques, ou MGP, et transférez-les dans un tube étiqueté de 1,8 ML. Ensuite, pipetez 4 ml de tampon de lavage dans un tube de 4,5 ml étiqueté WB-1,5 ml de tampon de lavage deux dans un tube de 3,6 ml étiqueté WB-2 et 3 ml de tampon de lavage trois dans un tube de 4,5 ml étiqueté WB-3.

Enfin, ajoutez 100 micro-litres de tampon d’élution dans un tube de 1,8 ML étiqueté EB, et laissez les tubes à température ambiante jusqu’à utilisation. Pour prélever du sang total intraveineux du patient, utilisez une aiguille papillon avec un tube d’extension de petit calibre et l’un des tubes à vide de prélèvement sanguin préalablement préparés contenant un tampon de lyse. Reposez le bras du patient en position basse.

Insérez l’aiguille papillon dans la veine du patient et fixez le tube à vide de prélèvement sanguin à l’extension de petit calibre. Après le prélèvement sanguin, mélangez le contenu du tube, en retournant le tube cinq à dix fois. Désinfectez l’extérieur du tube avec de l’éthanol à 70 %.

Ensuite, incubez les tubes pendant 20 minutes à température ambiante pour l’inactivation du virus. Pour purifier les acides nucléiques du sang collecté, mélangez à nouveau le contenu du tube en retournant le tube à vide à la main cinq à dix fois. Versez l’aliquote préparée de MGP directement dans le tube de prélèvement sanguin.

Placez un nouveau couvercle d’un tube de prélèvement sanguin non utilisé sur le tube contenant l’échantillon. Placez un doigt sur le couvercle pour vous assurer que le tube est bien fermé et mélangez le contenu du tube en le retournant cinq à dix fois. Placez le tube dans le support magnétique et gardez un doigt sur le couvercle, pour vous assurer que le tube est bien fermé.

Ensuite, retournez le support magnétique avec le tube plusieurs fois pour disperser les MGP avant qu’ils ne s’accumulent sur le côté du tube avec l’aimant. Retirez le couvercle du tube et jetez le contenu du tube dans un tube de collecte de 50 ml, à l’aide d’une pipette jetable. Versez l’aliquote préparée de WB-1 directement dans le tube de prélèvement sanguin et fermez le couvercle du tube.

Mélangez le contenu à la main cinq à dix fois. Récupérez ensuite les billes sur le côté du tube, à l’aide de l’aimant et retirez le liquide comme précédemment. Suspendez à nouveau les billes dans l’aliquote préparée de WB-2, puis jetez la solution et répétez la procédure avec une aliquote préparée de WB-3.

Enfin, retirez le tube du support magnétique et versez l’aliquote préparée d’EB directement dans le tube de prélèvement sanguin. Placez le couvercle sur le tube et remettez les MGP en suspension en tapotant cinq à dix fois avec un doigt. Enfin, utilisez une pipette jetable de 1,5 ml pour transférer une gouttelette des MGP remis en suspension dans le mélange réactionnel d’amplification des acides nucléiques en aval.

Assurez-vous de remettre complètement les MGP en suspension avant de ne transférer qu’une seule gouttelette dans la réaction PCR. Pour démontrer la preuve de concept, le sang total négatif a été enrichi avec des dilutions de 10 fois du virus Ebola standard, préparé à partir de la récente épidémie dans le sud de la Guinée, ou de trois concentrations différentes du virus d’Epstein Barr. Les acides nucléiques extraits ont été analysés par R2 spécifique du virus, qPCR ou qPCR.

Plus le seuil de franchissement est bas, plus le nombre de copies du génome viral est élevé. Ici, des échantillons de sang total dopés à différentes concentrations de virus Ebola ont été détectés par une lampe spécifique du virus Ebola. La concentration finale de virus dans l’échantillon de sang total enrichi est observée sur l’axe des X et le nombre de minutes jusqu’à ce que le résultat soit positif est indiqué sur l’axe des Y.

Ici, le sang total a été enrichi avec des dilutions de 10 fois d’un échantillon sérique normalisé de l’hépatite C de l’OMS, avec détection par RT qPCR spécifique du VHC. Enfin, cette image montre les résultats d’une réaction à la lampe spécifique du virus d’Epstein-Barr, sur du sang total positif au virus d’Epstein-Barr. Lors de la tentative de cette procédure, il est important d’utiliser le tampon de liaison de lyse spécifié.

Il s’agit d’une étape cruciale, et d’un réactif crucial pour la méthode. Ce tampon de liaison à la lyse inactivera le virus dans l’échantillon. En suivant cette technique, vous pouvez effectuer différentes méthodes de détection moléculaire comme la lampe et la PCR, et donc vous pouvez effectuer un diagnostic différentiel.