Name: Benchtop immobilisé par chromatographie d’affinité métallique, Reconstitution et analyse d’un Polyhistidine tag métalloenzyme pour le laboratoire d’études de premier cycle (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Apprenez la purification et la reconstitution d'une dioxygénase non-hème ferreuse marquée polyhistidine par chromatographie d'affinité métallique. Cette méthode accessible permet aux étudiants de premier cycle d'étudier la structure et la fonction enzymatique.

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Cette publication est basée sur le travail soutenu par la National Science Foundation sous le Grant No.  CHE 1708237.

1. préparation pour la Purification
<ol><li>Préparation de l’extrait brut acellulaire<ol>
<li>Obtenir un culot ~ 9-10 g d' e. coli (BL21) qui surexprimé la polyhistidine Taggé metalloprotein25 dans un tube conique de 50 mL.</li>
		<li>Ajouter 5 mL par gramme de tampon de lyse temp/identification de chambre (50 mM Phosphate, 300 mM NaCl, imidazole de 10 mM à pH 8) à environ 9-10 g de culot pour un volume total ~ 45-50 mL. Périodiquement de vortex pour encourager la dissolution. Si la pastille a été gelée, décongeler dans un bain d’eau tiède.</li>
		<li>En utilisant le bain d’eau glacée, faites refroidir la suspension cellulaire à environ 3 ° C en prévision de la lyse cellulaire. Remarque : À ce stade, la lyse cellulaire par sonication, fraisage de perle ou une autre méthode est possible. Fraisage de la perle est démontré ici parce qu’il est rapide, relativement peu coûteux et n’exige pas des protections auditives.</li>
		<li>Assembler une bille de 50 mL fraisage chambre selon les instructions du fabricant.</li>
		<li>Remplir la chambre de moulin de perle moitié plein de réfrigérés 0,1 mm perles en verre qui ont été stockés à-20 ° C.</li>
		<li>Remplir le reste de la chambre avec la suspension de cellules réfrigérées et tampon de lyse/identification de 4 ° C permet de remplir la chambre complètement.</li>
		<li>Utilisez une petite spatule pour faire tourner l’arbre de l’usine de perles et de mélanger la suspension cellulaire avec les perles.</li>
		<li>Éliminez les grandes bulles avec une pipette et puis visser le couvercle.</li>
		<li>Sec hors de la chambre de toute fuite.</li>
		<li>Ajouter environ 1 tasse de glace à la veste claire, en plastique, inverser la chambre remplie de 50 mL dans la veste de glace rempli et le visser fermé.</li>
		<li>Sécuriser la chambre de glace-chemisé sur le moteur.</li>
		<li>Tourner le moulin de perle moteur sur pendant 15 secondes à 15 800 tr/min, puis laissez pour reposer pendant 45 secondes. Répétez 8 fois.</li>
		<li>Lorsque les 8 cycles sont complétés, décanter la suspension de la lyse cellulaire tout en 50 mL ou plus grand tube conçu au centrifugation à haute vitesse (25 000 x g ou supérieur). Placer une paire de tubes équilibrés dans la centrifugeuse et un essorage à 25 000 x g pendant 40-45 minutes à 4° C pour granuler des perles de verre et de débris cellulaires. Remarque : Si 50 mL ou plus gros tubes calibrés pour la centrifugation à haute vitesse ne sont pas disponibles, retirer les perles de verre par centrifugation à 1000-2000 x g pendant 2-3 min dans un tube conique de 50 mL pour donner un plus petit volume de suspension cellulaire (~ 25 mL) qui peut être décanté dans un plus petit volum tube e convenant de centrifugation à haute vitesse.</li>
		<li>Lorsque centrifugation est terminée, décanter le clair, jaune, acellulaire, brut extrait dans un tube conique propre de 50 mL. Prendre soin de ne pas pour transférer les débris cellulaires.</li>
		<li>Recueillir un petit échantillon des extraits bruts acellulaire pour une analyse ultérieure de la purification par SDS-PAGE26.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparation de la colonne de l’IMAC<ol>
<li>Obtenir une colonne de 1,5 x 20 cm équipée d’un support de lit inférieur pour retenir les particules de résine, une prise de verrouillage Luer et un capuchon qui contient également un raccord Luer lock. Correspond à la prise de connecteur Luer-lock avec un robinet d’arrêt pour contrôler le flux.</li>
		<li>Travaillant à la paillasse, fixer la colonne sur un support de bague.</li>
		<li>Obtenir une suspension de 50 % de résine de (Ni-NTA) acide nitriloacetic nickel-bondissent dans 20 % d’éthanol qui a été stockée à 4 ° C.</li>
		<li>Doucement agiter le flacon pour remettre en suspension uniformément la résine.</li>
		<li>Travailler à température ambiante et applications, utiliser une pipette jaugée de retirer 2 mL de la solution aqueuse, qui produira 1 mL de réglé résine capable de se lier à 50-60 mg de polyhistidine protéine contenant le tag et transférer la suspension dans la colonne.</li>
		<li>Ouvrir le robinet et laisser la solution de stockage excessif s’écouler par gravité de la résine.</li>
		<li>Bien fermer le robinet d’arrêt</li>
		<li>À l’aide d’une pipette Pasteur, ajouter avec précaution le tampon de lyse réfrigérés/bind (50 mM Phosphate, 300 mM NaCl, imidazole de 10 mM à pH 8) et à la colonne de résine – au moins 30 mL. Prendre soin de ne pas pour troubler la surface de la résine. Exécutez le tampon vers le bas les murs de la colonne pour éviter les éclaboussures.</li>
		<li>Equilibrer la résine en permettant le tampon de lyse/bind s’écouler lentement de la colonne par gravité dans un bécher de collection.</li>
		<li>Lorsque le tampon de lyse/bind a principalement été vidangée, fermez le robinet d’arrêt pour arrêter le flux de mémoire tampon lorsque environ 5 mL de tampon de lyse se maintient au-dessus de la résine et laisser la colonne, montée verticalement, jusqu’au moment de procéder ou pour 1 semaine.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. purification de Polyhistidine-tag cible par IMAC
<ol><li>Préparer le tampon de lavage (50 mM 300 mM NaCl, le Phosphate, pH imidazole de 20 mM 8) et de la mémoire tampon d’élution (50 mM Phosphate, NaCl, imidazole de 250 mM, 300 mM 10 % de glycérol, pH 8). Refroidir à 4° C.</li>
	<li>Préparer la colonne Ni-NTA pour l’ajout d’extraits bruts acellulaire en ouvrant le robinet d’arrêt et permettant restant de tampon de lyse/liaison s’écouler par gravité à travers la résine Ni-NTA. Lorsque toute la mémoire tampon a été vidangée, et affleure la surface de la résine, fermer le robinet.</li>
	<li>Le brut libre de cellules à l’aide d’une pipette Pasteur, soigneusement la pipette extraits sur la résine, en prenant soin de ne pas pour troubler la surface. Exécuter les extraits bruts sur les murs de la colonne pour éviter les éclaboussures. Le volume des extraits bruts appliquée dépend du niveau d’expression de la protéine polyhistidine-étiquetée ; s’assurer que le volume total des extraits bruts contient 50 à 60 mg ou moins de la protéine cible par mL de résine Ni-NTA (voir étape 1.2.4).</li>
	<li>Lorsque tous les extraits bruts ont été transférés à la colonne, ouvrir le robinet afin que la colonne peut vider par gravité. Ce flux à travers est composé de protéines qui ne se lient pas à la résine – collecter 100 μL pour une analyse ultérieure de la purification par SDS-PAGE. 26
</li>
	<li>La viscosité des extraits bruts acellulaire peut ralentir l’écoulement par gravité de la colonne considérablement. Pour augmenter la vitesse d’écoulement, appliquer un simple « pompes » :<ol>
<li>Prenez une seringue de 10 mL Luer-lock et connectez-le à l’extrémité de la colonne à l’aide d’un petit morceau de tube en plastique et des raccords Luer-lock entre le plafond de la colonne et la seringue. Tirez le piston de la seringue et le fixer fermement le cap de la colonne sur le dessus de la colonne.</li>
		<li>Comprimer légèrement le piston de la seringue tout en évaluant manuellement le débit en recueillant l’éluant dans une éprouvette graduée ; taux de 1 à 2 mL / minute sont compatibles avec la résine et cette configuration. Doucement augmenter la compression du piston de la seringue que le débit ralentit.</li>
		<li>Pour empêcher l’introduction d’air dans la résine, enlever le capuchon de la colonne et joint pompe manuelle lorsque le ménisque du liquide appliqué atteint 5 à 10 mm au-dessus du lit de résine et permettent le volume restant s’écouler par gravité.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quand les extraits bruts libre de cellule ont fini drainant et la surface de la résine est exposée à nouveau, utilisez une pipette Pasteur pour ajouter avec précaution environ 30 mL de tampon de lavage réfrigéré à la colonne – en prenant soin de ne pas pour troubler la surface de la résine. Exécutez le tampon vers le bas les murs de la colonne pour éviter les éclaboussures.</li>
	<li>Ouvrir le robinet et laisser le tampon de lavage s’écouler à travers la colonne. Ce processus enlève protéines faiblement liés de la résine. Jeter l’éluant.</li>
	<li>Tandis que le tampon de lavage est drainante, préparer, seize ans, étiqueté, microtubes à centrifuger pour rassemblant des fractions de 1 mL.</li>
	<li>Dès que le tampon de lavage a été vidangée, et la surface de la résine est encore exposée, fermer le robinet d’arrêt. Utiliser une pipette Pasteur pour ajouter avec précaution environ 30 mL de tampon d’élution réfrigérés à la colonne – en prenant soin de ne pas pour troubler la surface de la résine. Exécutez le tampon vers le bas les murs de la colonne pour éviter les éclaboussures.</li>
	<li>Ouvrir le robinet lentement et laisser le tampon d’élution Éluer la protéine polyhistidine avec étiquette de la colonne. Collecter 1 mL de l’éluant dans chacun des tubes de microcentrifuge marqué, 1 à 16.</li>
	<li>Tester les fractions de protéine par dosage colorimétrique de protéines telles que l’analyse de Bradford ou spectroscopie UV-Visible selon des méthodes spécifiques par le réactif et/ou instrument fabricants27,28. Tel qu’illustré ici, le dosage colorimétrique à l’aide de bleu de Coomassie est réduit à un volume μL 100 pour sacrifier seulement un petit volume de chaque fraction.</li>
	<li>Mix 3 μL de chaque fraction avec 100 µL d’une protéine colorimétrique réactifs de dosage et manuellement observe la formation de n’importe quelle couleur pour indiquer la présence de protéines dans la fraction ; détection avec un spectromètre n’est pas nécessaire.</li>
	<li>Si la protéine est présente dans la fraction 16, continuer à élution de fractions de 1 mL et dosage des protéines régulièrement, jusqu'à ce que les fractions éluées ne contenant une quantité importante de protéines.</li>
	<li>Combiner des fractions protéiques dans un tube conique propre et retirer un échantillon de 100 μL pour une analyse ultérieure par SDS-PAGE26.</li>
	<li>Procéder à la reconstitution du cofacteur de l’ion métallique ou geler la protéine en aliquotes de 3 mL à-80 ° C. Veiller à ce que 10 % de glycérol est inclus dans l’élution tampon est un cryoprotecteur pour stabiliser les protéines pures au cours du gel.</li>
	<li>Lors de l’élution de la colonne de Ni-NTA est terminée, c'est-à-dire toutes les protéines sont au large de la colonne et recueillis dans les fractions, passer un autre 25 mL de tampon d’élution par le biais de la colonne et stocker la colonne à 4 ° C en environ 5 mL de tampon d’élution pour le stockage à court terme , ou le tampon de lyse/bind avec 20 % d’éthanol pour le stockage à long terme.</li>
</ol>3. la reconstitution de la protéine cible avec Fe2 +
<ol><li>Ajout de Fe2 + Remarque : Un fer non hémique (II) liaison enzyme, par exemple la dioxygénase L-DOPA dans cet exemple, nécessite un ion Fe2 + pour l’activité ; Cependant, le fer (II) s’oxyde facilement en fer (III), qui est inactif, et une fraction de la protéine purifie sans aucun fer à tous.<ol>
<li>Pour commencer la reconstitution du métal, obtenir 3 mL de l’enzyme purifiée en suspension dans le tampon d’élution. Si gelé, décongeler rapidement à l’aide d’un bain d’eau tiède et une fois décongelé, mettre la protéine sur la glace.</li>
		<li>En utilisant le volume de protéine dans le tube, calculer le montant d’ascorbate de sodium (198,1 g/mol) nécessaire pour que la concentration finale 12,5 mM dans l’échantillon. En outre, calculer le montant de dithiothréitol (DTT, 154.25 g/mol) nécessaire pour que la concentration finale 12,5 mM dans l’échantillon.</li>
		<li>Ajouter l’ascorbate de sodium solide et sur la TNT et doucement, mais complètement, mélanger pour dissoudre complètement. Prendre soin de ne pas pour provoquer la précipitation de protéines avec mélange trop agressifs. Ajouter une petite quantité de sulfate de fer (II) heptahydraté (278.01 MW g/mol) à l’échantillon de protéine.</li>
		<li>Afin d’obtenir une assez petite quantité d’eau salée, fer 1 quelques mm granules de FeSO4•7H2O solide dehors sur un morceau de peser papier, replier le papier sur le granule et l’écraser avec le côté plat d’une spatule métallique.</li>
		<li>Ajouter un grain de poudre qui en résulte dans le tube de la protéine.</li>
		<li>Vortex pour mélanger et une rose couleur rose apparaîtra dans le tube.</li>
		<li>Incuber la solution rose de protéine, plafonné, de 10 à 30 minutes sur la glace. La couleur rose disparaîtra lentement au fil du temps.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Filtration sur gel<ol>
<li>Utiliser une colonne de gel filtration emballée avec 10 mL de gel de polyacrylamide sphérique avec une limite d’exclusion de poids moléculaire d’environ 6 000 et une gamme de tailles de particules hydraté de 90 à 180 µm dans une colonne de 1.5 x 12 cm, qui est également équipée d’un réservoir de 10 mL. Assurez-vous que la colonne est équipée en bas et lit sup. prend en charge sous la forme de 30 disques um poreux polyéthylène de retenir la résine dans la colonne et éviter le lit de résine de fonctionner à sec. Monter la colonne de gel filtration à un support de bague.</li>
		<li>Si vous utilisez une colonne de filtration gel pré-packagées, enlever le bouchon et videz l’excès de tampon au-dessus du support du lit supérieur.</li>
		<li>Pour équilibrer la colonne, commencez par remplir le réservoir avec tampon compatible avec dosage ultérieur et de stockage, par exemple, 50 mM NaH2PO4, 200 mM NaCl, 10 % de glycérol à pH 8,0.</li>
		<li>Si vous utilisez une colonne de filtration gel pré-packagées, casser la pointe de bas de colonne de gel filtration pour démarrer le flux de mémoire tampon et exposer raccord Luer slip. Monter un robinet d’arrêt à l’extrémité du feuillet Luer de la colonne, mais laissez-le ouvert et laissez la colonne à s’écouler par gravité.</li>
		<li>Lorsque la mémoire tampon a vidé de la colonne et le support de la plateforme supérieure affleure, fermer le robinet et ajouter le ~ 3 mL de la métalloenzyme de Fe (II) reconstitué à la colonne en pipettant également, la solution sur le support de lit sup. exposées.</li>
		<li>Ouvrir le robinet et laisser l’échantillon entier 3,0 mL entrer dans la colonne par gravité. Jetez ces 3 premières mL d’éluant. N’importe quelle couleur rose qui se forme lors de la manipulation de la solution sera bloqué en haut de la colonne.</li>
		<li>Lorsque la colonne goutte ne s’échappe et le support de la plateforme supérieure affleure, ajouter 4 mL de tampon gel-filtration (p. ex., 50 mM NaH2PO4, 200 mM NaCl, 10 % de glycérol à pH 8,0) à la colonne. Ouvrir le robinet et recueillir l’éluant dans des tubes de microcentrifuge sur huit fractions de 0,5 mL.</li>
		<li>Tester les fractions de protéine à l’aide d’un dosage colorimétrique protéique ou UV-Vis27,28 comme décrit précédemment.</li>
		<li>Combiner des fractions protéiques.</li>
		<li>Retirer un échantillon pour analyse de SDS-PAGE26.</li>
		<li>Procéder à l’essai ou l’entreposage de l’échantillon.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont aucune divulgation.

Alors que l’ajout de balises de polyhistidine de protéines recombinantes et leur purification par IMAC est devenu pratiquement omniprésent dans la littérature biochimiques3,4,5, applications d’IMAC à purification d’enzymes dans la biochimie, laboratoire d’enseignement restent rares, et les méthodes publiées ne considèrent pas toujours les ressources limitées de l’enseignement de laboratoire20. En outre, l’utilisation de l’IMAC dans le laboratoire d’enseignement est plus efficace lorsqu’elle est associée à des expériences qui permettent d’évaluer l’activité et la pureté, rendant la purification IMAC d’une enzyme, une activité d’enseignement idéale. Afin d’étendre l’application de l’IMAC à la purification des enzymes, y compris des métalloenzymes, dans le laboratoire d’enseignement, des méthodes fiables et peu coûteux sont nécessaires. Dans ce protocole, nous démontrons benchtop IMAC à l’aide de fournitures de laboratoire facilement disponibles et peu coûteux, tout en abordant également les limitations dans l’application de l’IMAC à métalloprotéines22, en reconstituant le fer (II) dépendant métalloenzyme, L-DOPA dioxygénase, après purification. En utilisant les réactifs et les matériaux décrits, nous estimons que le coût des consommables pour huit groupes d’étudiants est entre 500 à 600 $ par semestre d’exécuter le présent protocole, y compris les étapes d’analyse décrites dans la Figure 1 et Figure 2.
En raison de la facilité avec laquelle Fe2 + peut désolidariser de ligands peptidiques24 et l’oxydation facile de Fe2 + O2 à Fe3 +, reconstitution de non hémique, acide aminé-chélaté fer (II) dans une métalloenzyme recombinante est un élément typique de la purification de l’enzyme. Lorsque chromatographie classique est utilisée, il est possible d’éviter une perte totale de fer dans certains cas32, mais plus souvent, il est ajouté le fer (II) retour en présence d’agents réducteurs33,34,35, 36 souvent sous un atomosphere anaérobie37,38,39et dans certains cas, l’excès de fer n’est pas enlevé33,34,36, ce qui complique toute analyse ultérieure. Les étapes successives de chromatographie classique et une atmosphère anaérobie ne sont pas réalistes pour le laboratoire de premier cycle, ce qui incite l’élaboration du présent protocole.
Bien que la préparation manuelle de la colonne de Ni-NTA et le traitement des échantillons en grande partie par gravité prennent plus de temps et effort lorsque comparé aux colonnes pré-packagées et automatisé des instruments de chromatographie, les étapes manuelles permettent pour Hands-on apprentissage de l’étudiant qui donnent lieu à une meilleure compréhension de la science derrière le processus. L’addition d’un sel de fer (II) dans les conditions décrites ici est particulièrement sensible aux excès dithiothréitol. Si un étudiant a tort ajoute un excès de dithiothréitol, un événement de précipitation est probable. Nous avons trouvé utile d’exiger des étudiants effectuer des calculs de quantités de réactifs avant son arrivée au laboratoire, donc temps de laboratoire peut être utilisé plus efficacement sur le banc. La purification de IMAC benchtop entier - de la lyse cellulaire à élution de protéine - peut être accomplie dans une période de 4 heures de laboratoire, suivie de la reconstitution et l’essai sur une période subséquente de laboratoire.

Les premiers rapports de la purification d’une protéine polyhistidine Taggé des extraits d’un organisme hôte à l’aide de chélation de l’étiquette histidine par un métal immobilisé entré dans la littérature en 19881,2. Depuis ce temps, l’ajout de balises de polyhistidine de protéines recombinantes et leur purification par chromatographie d’affinité métallique immobilisée (IMAC) sont devenus pratiquement omniprésent dans la littérature biochimiques3,4, 5. Méthodes de purification IMAC peuvent être implémentés sur la paillasse, chromatographie automatisé et dans des formats de colonne à centrifuger. Alors que les méthodes de purification d’affinité, notamment les IMAC, sont largement utilisés dans le laboratoire de recherche, ils sont moins fréquents dans le laboratoire d’enseignement de premier cycle. Les manuels de laboratoire plus largement utilisé pour le laboratoire de biochimie n’enseignent pas systématiquement ces méthodes, optant plutôt pour échangeuse d’ions plus traditionnel ou colorant-liaison chromatographie6,7,8 , 9. par exemple, la purification de la lactate déshydrogénase par Anderson10 utilise affinité de liaison de colorant, et la purification du lait de vache α-lactalbumine7,11 par Boyer utilise un nickel-nitriloacetic matrice de l’acide, mais aucune balise recombinant poly-histidine, comptant plutôt sur l’affinité intrinsèque de la protéine pour la résine. Certains manuels de laboratoire moderne de premier cycle et les publications implémentent chromatographie d’affinité métallique immobilisée sur poly-histidine Taggé protéines cibles tels que les protéines vertes ou rouges fluorescentes12,13, 14,15, anticorps16et certaines enzymes17,18,19,20, même certains de fonction inconnue,21. Sans doute, la purification de l’enzyme est préférable dans le laboratoire d’enseignement, parce que la cible peut être dosée pour activité dans ses sessions ultérieures, enrichir l’expérience de la « vraie science » la part de l’étudiant ; en effet, ces types d’expériences de laboratoire ont été publiés et les résultats bénéfiques sur l’apprentissage des élèves signalés17,18,20,21. Et encore, applications d’IMAC à purification d’enzymes dans la biochimie enseignement laboratoire restent rares, et les méthodes publiées peuvent présumer même accès aux instruments de chromatographie qui n’est généralement pas disponible pour utilisent en laboratoire en classe 20. il y a aussi des limitations dans l’application de l’IMAC à métalloprotéines, surtout celles qui lient l’oxydo-réduction sensible des métaux divalents qui sont essentiels à l’activité22. Fréquemment, l’ion métallique est perdue ou oxydée durant la purification produisant une enzyme inactive inadapté au laboratoire du premier cycle.
Un tiers plein d’enzymes se lier à un ion métallique23, et malgré une exigence presque universelle pour le fer dans toutes les formes de vie23, fer est sans doute parmi les ions métalliques plus problématiques en enzymologie. Non hémique Fe2 + liaison enzymes sont particulièrement sujettes à la perte et/ou l’oxydation du métal au cours de l’IMAC ; probablement en raison de l’absence d’un ligand biologique dédié comme l’hème et la facilité avec laquelle Fe2 + pouvez dissocier du acide aminé ligands24. En outre, l’oxydation par l’oxygène dépendant de Fe2 + en Fe3 + est spontanée en solution aqueuse, en raison du changement négatif d’énergie libre et la relative stabilité de Fe3 +. Souvent, ces défis sont relevés par utilisation d’anaérobie atmosphère et/ou non-IMAC méthodes chromatographiques22. Dans cet article, nous allons démontrer l’utilisation de benchtop IMAC pour purifier le Fe2 + métalloenzyme charge L-DOPA dioxygénase utilise des conduites simples et peu coûteuses de chromatographie, suivies par la reconstitution du site actif Fe2 +, et dosage enzymatique. Ces méthodes sont standards dans notre propre laboratoire de baccalauréat en biochimie des groupes d’élèves de 6 à 12 et peuvent être utilisés pour élargir le répertoire des enquêtes enzymatique au niveau du baccalauréat.

<table><tbody><tr><td>consommables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BeadBeater 0,1 mm billes de verre</td><td>BioSpec Produits</td><td>11079101</td><td>1 livre chacun</td></tr><tr><td>50 ml Tubes coniques avec bouchons à vis, stériles</td><td>VWR</td><td>21008-178</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potassium, monobasique</td><td>Acros (Fisher)</td><td>AC42420-5000</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbate de sodium</td><td>Acros (Fisher)</td><td>AC35268-1000&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>DTT (Dithiothreitol)</td><td>Lab Scientific</td><td>D-115</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de fer(II) heptahydraté</td><td>Sigmaaldrich</td><td>310077</td><td></td></tr><tr><td>HisPur NiNTA Resin&nbsp ;</td><td>Fisher (perce)</td><td>PI88221</td><td></td></tr><tr><td>Colonnes de chromatographie Econo-Column - 1,5 x 20cm</td><td>Bio-Rad</td><td>737-1522&nbsp ;</td><td>1,5 x 20 cm, 35 ml, 2 unités,</td></tr><tr><td>Robinet d’arrêt, unidirectionnel, femelle à luer mâle</td><td>Kimble</td><td>420163-0000</td><td>paquet de 50</td></tr><tr><td>seringues luer-loc BD 10mL (non stérile, sans aiguille)</td><td>VWR</td><td>301029</td><td></td></tr><tr><td>Raccord pour tubulure : 1,6 mm Barb à Luer Biorad femelle</td><td></td><td>7318222</td><td></td></tr><tr><td>Raccord pour tubulure : 1,6 mm Barbé à Luer mâle</td>Tube en silicone <td></td><td>Biorad 7318225</td><td></td></tr><tr><td>(1,6 mm de diamètre intérieur/0,8 mm de paroi, pour 0,2 à 5 ml/min sur une pompe péristaltique)</td><td>Bio-Rad</td><td>7318211</td><td>paquet de 1, 1,6 mm de diamètre intérieur/0,8 mm de paroi, 10 m, tube basse pression pour la manipulation de liquides</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Fisher (Pierce)</td><td>17904</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Plus (Bradford) Dosage des protéines</td><td>Thermo Scientitic</td><td>23236</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation, capuchon à pression, 1,5 ml</td><td>VWR</td><td>89000-028</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques jetables en polystyrène</td><td>Fisherbrand Fisher</td><td>13-676-10F</td><td></td></tr><tr><td>Pompe à pipette universelle Fiserbrand</td><td>Fisher&nbsp ;</td><td>14-955-110</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes de transfert Fisherbrand</td><td>Fisher&nbsp ;</td><td>13-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>Colonnes de dessalage Econo-Pac 10DG</td><td>Bio-Rad</td><td>732-2010</td><td>boîte de 30</td></tr><tr><td>tampons d’échantillons ExpressPlus PAGE 5x</td><td>Genscript</td><td>MB01015</td><td>5mL (Diluer 1:5 avec l’échantillon)</td></tr><tr><td>ExpressPlus PAGE Gel, 4-20 %, 12 puits</td><td>Genscript</td><td>M42012</td><td>20 gels</td></tr><tr><td>Fisherbrand Cuvettes jetables, méthyacrylate</td><td>Fisher</td><td>14-955-128&nbsp ;</td><td>Caisse de 500</td></tr><tr><td>Bouchons de cuvette carrés jetables</td><td>Fisher</td><td>14-385-999</td><td></td></tr><tr><td>L-DOPA (3,4-dihydroxyphénylalanine)</td><td>Acros</td><td>D9628-5G</td><td></td></tr><tr><td>Équipement permanent :&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chambre BeadBeater 50mL&nbsp ;</td><td>BioSpec Products</td><td>110803-50SS</td><td>1 chambre</td></tr><tr><td>BeadBeater</td><td>BioSpec Products</td><td>1107900-101</td><td>Chambre en polycarbonate de 350 ml, rotor, base du moteur, chemise de refroidissement à l’eau glacée et une livre de billes de verre.</td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger, PPCO haute vitesse, 50 ml</td><td>Fisher</td><td>3119-0050PK</td><td></td></tr><tr><td>Cellule d’électrophorèse verticale Mini-PROTEAN Tetra pour mini-gels préfabriqués, 4 gels</td><td>Bio-Rad</td><td>1658004</td><td> Système d’électrophorèse verticale à 4 gels, comprend l’ensemble d’électrodes, le module de roulement d’accompagnement, le réservoir, le couvercle avec câbles d’alimentation, le barrage tampon à mini-cellules,</td></tr><tr><td>l’alimentation PowerPac HC</td>, <td>Bio-Rad</td><td>1645052</td><td>100&ndash ; 120/220&ndash ; 240 V, alimentation pour les applications à courant élevé, avec cordon d’alimentation</td></tr><tr><td>UV-1800 avec logiciel de sonde UV</td><td>Shimadzu</td><td>UV-1800</td><td></td></tr><tr><td>Kintek Global Kinetic Explorer</td><td>Kintek Corp</td><td>version 6</td><td>https://www.kintekexplorer.com/downloads/</td></tr></tbody></table>

benchtop immobilisé par chromatographie d’affinité métallique, reconstitution et analyse d’un polyhistidine tag métalloenzyme pour le laboratoire d’études de premier cycle

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Chromatographie d’affinité métallique de benchtop immobilisé (IMAC), des protéines polyhistidine Taggé est facilement maîtrisée par les étudiants de premier cycle et est devenu la méthode de purification de protéines plus largement utilisé dans la littérature moderne. Mais, l’application de la chromatographie d’affinité pour les protéines de liaison métallique, particulièrement ceux avec des métaux redox sensibles tels que le fer, est souvent limitée aux laboratoires ayant accès à une boîte à gants - matériel qui n’est pas couramment disponible dans le premier cycle laboratoire. Dans cet article, nous montrons nos méthodes de benchtop pour isolation, IMAC reconstitution de purification et d’ions métalliques d’un poly-histidine Taggé, liaison du fer non hémique actifs en oxydoréduction extradiol dioxygénase et le dosage de la dioxygénase avec substrat varié les concentrations et la saturation d’oxygène. Ces méthodes sont exécutées par les étudiants de premier cycle et mis en œuvre dans le laboratoire de recherche et d’enseignement premier cycle avec une instrumentation qui est accessible et abordable au premier cycle institutions principalement.

Ces résultats représentatifs ont été recueillies par les étudiants de premier cycle comme ils ont exécuté ce protocole au cours de deux périodes de laboratoire du cours de BCM 341 : biochimie expérimentale au Muhlenberg College. La figure 1 montre les résultats de la purification d’un poly-histidine de 20 kDa tag métalloenzyme, L-DOPA dioxygénase, interprété par deux étudiants de premier cycle durant une période de laboratoire de 4 heures en classe et analysés par SDS-PAGE, par le même étudiants au cours d’une période ultérieure en laboratoire. La protéine de poly-histidine Taggé est effectivement purifiée (Figure 1, piste 2). Un immunoblot du gel à l’aide d’anticorps contre la balise poly-histidine indique qu’une petite quantité de la protéine cible de poly-histidine Taggé est perdue dans le cheminement (données non présentées), probablement parce que plus que la quantité de 100 mg de protéine cible dans la lysat a dépassé la capacité de liaison de la résine.
La figure 2 montre des données d’activité étudiant Collector sur la réaction enzymatique de la cible de poly-histidine étiqueté métalloenzyme, L-DOPA dioxygénase, après reconstitution avec le fer (II) et gel-filtration ultérieure telle que décrite par le protocole dans les présentes. La seconde cinq morts-temps avant la collecte des données commence est typique des étudiants l’exécution de cette technique pour la première fois. L’activité robuste de la métalloenzyme a été détectée à l’aide d’un test publié et donné stationnaire des paramètres cinétiques compatibles avec les résultats publiés,29. Équilibre des paramètres cinétiques ont été déterminées en ajustant les courbes de progression30 illustré à la Figure 2; Cependant, le montage non linéaire des moindres carrés des vitesses initiales recueillies au cours d’une série de concentrations de substrat est tout aussi possible31.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58012/58012fig1.jpg"> Figure 1. L’analyse de la SDS-PAGE26 de la poly-histidine tag protéine avant, pendant et après la purification. Voies 1 - marqueurs de poids moléculaire, poste Ni-NTA de la protéine purifiée 2 (20 kDa), 3-Ni-NTA accréditives, 4 - cellule libre des extraits bruts avant purification, 5 - cellules-débris pellet post lyse. Des échantillons ont été préparés en utilisant 5 x tampon échantillon/chargement et séparés sur gel de polyacrylamide préfabriqués en 4-20 % à l’aide d’un système d’électrophorèse de gel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58012/58012fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58012/58012fig2.jpg"> La figure 2. L’état stationnaire, dosage du fer (II) reconstitué métalloenzyme (c.-à-d., L-DOPA dioxygénase, 10µM) avec substrat (L-DOPA-5 µM (rouge), 25 µM (vert), 50 µM (bleu)) dans un tampon (50 mM Phosphate, 200 mM NaCl, pH 8). Traces illustrent la formation des produits à 414nm. Données d’absorbance ont été acquises en continu à l’aide des cuvettes de méthacrylate de 1 mL dans un faisceau balayage UV-Visible spectromètre29. Les données brutes sont propres à un modèle de Michaelis-Menten approximation de l’état d’équilibre (KM 30,8 µM ± 14,4, kchatapparente 2.3 s-1 ± 0,05)30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58012/58012fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Nous présentons ici un protocole de la purification par chromatographie AFFINITE métal benchtop immobilisé et réhydratation ultérieure d’un polyhistidine le tag, le fer non hémique liaison dioxygénase approprié pour le laboratoire d’enseignement de premier cycle.

Benchtop immobilisé par chromatographie d’affinité métallique, Reconstitution et analyse d’un Polyhistidine tag métalloenzyme pour le laboratoire d’études de premier cycle

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Cette méthode permet aux étudiants de premier cycle de purifier rapidement les métalloenzymes liant le fer, puis d’utiliser cette protéine pour répondre à des questions clés sur la structure et la fonction, le tout dans les limites du laboratoire d’enseignement. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est applicable aux enzymes de liaison au fer non hémiques. Il est accessible aux étudiants de premier cycle et il est facilement mis en œuvre dans le laboratoire d’enseignement.Pour commencer cette procédure, procurez-vous une colonne de 1,5 x 20 centimètres équipée d’une sortie Luer Lock, d’un capuchon supérieur qui contient également un raccord Luer Lock et d’un support de lit inférieur pour retenir les particules de résine. Montez le raccord Luer Lock inférieur avec un robinet d’arrêt pour contrôler le débit. Ensuite, procurez-vous une bouteille contenant 50 % de résine d’acide nitriloacétique liée au nickel dans de l’éthanol à 20 % qui était auparavant stockée à quatre degrés Celsius.Faites tourner doucement la bouteille pour remettre uniformément la résine en suspension. En travaillant à température ambiante, utilisez une pipette graduée pour prélever deux millimètres de la boue et la transférer sur la colonne. Une fois que l’excès de solution de stockage s’est écoulé de la résine, utilisez une pipette Pasteur pour ajouter soigneusement au moins 30 millilitres de tampon de liaison de lyse réfrigéré, en veillant à ne pas perturber la surface de la résine.Faites passer le tampon le long des parois de la colonne pour éviter les éclaboussures. Équilibrez la résine en laissant le tampon s’écouler lentement de la colonne par gravité dans un bécher collecteur. Pour commencer, préparez la colonne de nickel-NTA pour l’ajout des extraits bruts acellulaires en ouvrant le robinet d’arrêt et en laissant le tampon de liaison à la lyse restant s’écouler par gravité à travers la résine de nickel-NTA.Lorsque le tampon s’est complètement vidé et que la surface de la résine est exposée, fermez le robinet d’arrêt. Ensuite, à l’aide d’une pipette Pasteur, pipetez soigneusement les extraits bruts acellulaires sur la résine, en prenant soin de ne pas perturber la surface. Faites couler les extraits bruts le long de la paroi de la colonne pour éviter les éclaboussures.Une fois que tous les extraits bruts ont été transférés dans la colonne, ouvrez le robinet d’arrêt afin que la colonne puisse s’écouler par gravité. Prélever 100 microlitres de l’écoulement pour une analyse ultérieure. Utilisez un tube en plastique de courte longueur pour connecter une seringue Luer Lock de 10 millilitres au capuchon de la colonne.Retirez le piston de la seringue, puis remplissez fermement le capuchon de la colonne sur le dessus de la colonne. Comprimez doucement le piston tout en recueillant l’éluant dans un cylindre gradué pour évaluer manuellement le débit. Les débits entre un et deux millilitres par minute sont compatibles avec la résine et le dispositif expérimental.Augmentez doucement la compression du piston de la seringue à mesure que le débit ralentit. Lorsque le ménisque du liquide appliqué atteint cinq à 10 millilitres au-dessus du lit de résine, retirez le capuchon de la colonne et la pompe à main attachée pour éviter l’introduction d’air dans la résine. Laissez le volume restant s’écouler par gravité.Une fois que les extraits bruts ont fini de s’égoutter et que la surface de la résine est à nouveau exposée, utilisez une pipette Pasteur pour ajouter soigneusement environ 30 millilitres de tampon de lavage réfrigéré dans la colonne, en prenant soin de ne pas perturber la surface de la résine. Ouvrez le robinet d’arrêt et laissez le tampon de lavage s’écouler à travers la colonne. Pendant que la colonne se vide, étiquetez 16 tubes de microcentrifugation pour la collecte des fractions.Lorsque le tampon s’est complètement vidé et que la surface de la résine est à nouveau exposée, fermez le robinet d’arrêt. À l’aide d’une pipette Pasteur, ajoutez soigneusement environ 30 millilitres de tampon d’élution réfrigéré dans la colonne, en prenant soin de ne pas perturber la surface de la résine. Ensuite, ouvrez lentement le robinet d’arrêt pour permettre au tampon d’élution d’éluer la protéine marquée à la polyhistidine de la colonne.Prélever un millilitre d’éluant dans chacun des tubes de microcentrifugation marqués. Après avoir testé les protéines, combinez les fractions contenant des protéines dans un tube conique propre. Procédez à une reconstitution du cofacteur d’ions métalliques, ou congelez la protéine dans des aliquotes de trois millilitres à moins 80 degrés Celsius.Pour commencer la reconstitution du métal, mettez une aliquote de trois millilitres de l’enzyme purifiée, en suspension dans un tampon d’élution, sur de la glace. À l’aide du volume de protéines dans le tube, calculez la quantité d’ascorbate de sodium et de dithiothréitol nécessaire pour que la concentration finale de chacun soit de 12,5 millimolaires dans l’échantillon. Ajoutez l’ascorbate de sodium solide et le dithiothréitol, et mélangez doucement mais soigneusement pour dissoudre complètement.Tapotez quelques granules d’un millilitre de sulfate de fer solide heptahydraté sur un morceau de papier de pesée. Pliez le papier sur le granulé et écrasez-le avec le côté plat d’une spatule métallique. Ajoutez un grain de la poudre obtenue dans le tube contenant la solution protéique.Vortex pour mélanger, ce qui donne une couleur rose-rose. Boucher le tube et incuber la solution rose sur de la glace pendant 10 à 30 minutes. La couleur rose s’estompera avec le temps.Pour la filtration sur gel, utilisez une colonne de filtration en gel remplie de 10 millilitres de gel polyacrylamide sphérique dans une colonne de 1,5 x 12 centimètres, qui est également équipée d’un réservoir de 10 millilitres. Ensuite, équilibrez la colonne comme indiqué dans le protocole de texte. Lorsque le tampon s’est écoulé de la colonne et que le support supérieur du lit est exposé, fermez le robinet d’arrêt.Pipetez la solution de trois millilitres de métalloenzyme de fer reconstitué sur le support supérieur exposé. Ouvrez le robinet d’arrêt et laissez l’échantillon entier de trois millilitres entrer dans la colonne par gravité. Jetez les trois premiers millilitres d’éluant.Toute couleur rose qui se forme lors de la manipulation de la solution sera piégée en haut de la colonne. Lorsque la colonne a cessé de couler et que le support supérieur du lit est exposé, ajoutez quatre millilitres de tampon de filtration en gel et collectez quatre millilitres d’éluant sur des fractions de 8,5 millilitres. Après avoir combiné des fractions contenant des protéines, procéder au dosage ou à l’entreposage de l’échantillon comme indiqué dans le protocole textuel.Dans cette étude, les étudiants ont purifié puis reconstitué une dioxygénase non héminique liant le fer marquée à la polyhistidine. L’analyse SDS-PAGE montre que la protéine marquée est efficacement purifiée. Les données d’activité recueillies par les étudiants sur l’action enzymatique de la L-dopa dioxygénase purifiée après reconstitution avec du fer deux et filtration ultérieure sur gel sont présentées ici.Le décalage de cinq secondes avant le début de la collecte des données est typique des étudiants qui exécutent cette technique pour la première fois. Le test à l’état stationnaire indique que les paramètres cinétiques, tels que déterminés par l’ajustement des courbes de progression, sont cohérents avec les résultats publiés. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que plus de fer n’est pas mieux, car trop de fer entraînera une précipitation des protéines.Les concentrations en fer dans l’excès de trois à cinq molaires de la protéine sont suffisantes. À la suite de cette procédure, les étudiants peuvent effectuer des expériences supplémentaires pour mesurer la structure de la solution, examiner la chimie dépendante des enzymes ou du substrat, le tout pour répondre à des questions supplémentaires sur le mécanisme de réaction.

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Dans cette vidéo, nous démontrons la technique de chromatographie d’affinité au nickel pour purifier les enzymes pyrophosphokinases marquées à l’histidine des bactéries Clostridium difficile.

Purification de protéines basée sur la chromatographie d’affinité du nickel : une technique pour purifier des protéines recombinantes marquées à la polyhistidine à partir d’un lysat de cellules bactériennes

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Des réactifs de détection robustes sont de plus en plus nécessaires pour développer de nouveaux outils de diagnostic du paludisme. Une sonde à l’iridium(III) a été conçue pour émettre un signal luminescent de longue durée en présence d’un biomarqueur de protéine du paludisme riche en histidine. La détection de la protéine en solution ou immobilisée sur une particule magnétique offre une flexibilité d’application.

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La chromatographie d’exclusion stérique couplée à un plasma à couplage inductif - spectrométrie de masse (ICP-MS) est un outil puissant pour mesurer les changements dans l’abondance des métalloprotéines directement à partir d’échantillons biologiques. Nous décrivons ici un ensemble d’étalons métalloprotéiques utilisés pour estimer la masse moléculaire et la quantité de métal associée à des protéines inconnues.

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Nous décrivons ici une méthode pour la purification des enzymes pyrophosphokinase histidine-étiquetées et utilisant la chromatographie sur couche mince des substrats radiomarqués et produits pour le dosage de l' activité enzymatique in vitro. Le dosage de l’activité enzymatique est largement applicable aux kinase, cyclase de nucléotides ou réaction de transfert de phosphore dont le mécanisme comprend l’hydrolyse de nucléotides triphosphate.

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Nous présentons un analyse pour la quantification facile des métaux introduits aux échantillons préparés utilisant la chromatographie immobilisée d'affinité de métal. La méthode utilise le bleu hydroxynaphthol comme indicateur de métal colorimétrique et un spectrophotomètre UV-Vis comme détecteur.

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Benchtop immobilisé par chromatographie d’affinité métallique, Reconstitution et analyse d’un Polyhistidine tag métalloenzyme pour le laboratoire d’études de premier cycle (Vidéo) | JoVE Journal

Benchtop immobilisé par chromatographie d’affinité métallique, Reconstitution et analyse d’un Polyhistidine tag métalloenzyme pour le laboratoire d’études de premier cycle

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