Benchtop immobilisé par chromatographie d’affinité métallique, Reconstitution et analyse d’un Polyhistidine tag métalloenzyme pour le laboratoire d’études de premier cycle

Cette méthode permet aux étudiants de premier cycle de purifier rapidement les métalloenzymes liant le fer, puis d’utiliser cette protéine pour répondre à des questions clés sur la structure et la fonction, le tout dans les limites du laboratoire d’enseignement. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est applicable aux enzymes de liaison au fer non hémiques. Il est accessible aux étudiants de premier cycle et il est facilement mis en œuvre dans le laboratoire d’enseignement.

Pour commencer cette procédure, procurez-vous une colonne de 1,5 x 20 centimètres équipée d’une sortie Luer Lock, d’un capuchon supérieur qui contient également un raccord Luer Lock et d’un support de lit inférieur pour retenir les particules de résine. Montez le raccord Luer Lock inférieur avec un robinet d’arrêt pour contrôler le débit. Ensuite, procurez-vous une bouteille contenant 50 % de résine d’acide nitriloacétique liée au nickel dans de l’éthanol à 20 % qui était auparavant stockée à quatre degrés Celsius.

Faites tourner doucement la bouteille pour remettre uniformément la résine en suspension. En travaillant à température ambiante, utilisez une pipette graduée pour prélever deux millimètres de la boue et la transférer sur la colonne. Une fois que l’excès de solution de stockage s’est écoulé de la résine, utilisez une pipette Pasteur pour ajouter soigneusement au moins 30 millilitres de tampon de liaison de lyse réfrigéré, en veillant à ne pas perturber la surface de la résine.

Faites passer le tampon le long des parois de la colonne pour éviter les éclaboussures. Équilibrez la résine en laissant le tampon s’écouler lentement de la colonne par gravité dans un bécher collecteur. Pour commencer, préparez la colonne de nickel-NTA pour l’ajout des extraits bruts acellulaires en ouvrant le robinet d’arrêt et en laissant le tampon de liaison à la lyse restant s’écouler par gravité à travers la résine de nickel-NTA.

Lorsque le tampon s’est complètement vidé et que la surface de la résine est exposée, fermez le robinet d’arrêt. Ensuite, à l’aide d’une pipette Pasteur, pipetez soigneusement les extraits bruts acellulaires sur la résine, en prenant soin de ne pas perturber la surface. Faites couler les extraits bruts le long de la paroi de la colonne pour éviter les éclaboussures.

Une fois que tous les extraits bruts ont été transférés dans la colonne, ouvrez le robinet d’arrêt afin que la colonne puisse s’écouler par gravité. Prélever 100 microlitres de l’écoulement pour une analyse ultérieure. Utilisez un tube en plastique de courte longueur pour connecter une seringue Luer Lock de 10 millilitres au capuchon de la colonne.

Retirez le piston de la seringue, puis remplissez fermement le capuchon de la colonne sur le dessus de la colonne. Comprimez doucement le piston tout en recueillant l’éluant dans un cylindre gradué pour évaluer manuellement le débit. Les débits entre un et deux millilitres par minute sont compatibles avec la résine et le dispositif expérimental.

Augmentez doucement la compression du piston de la seringue à mesure que le débit ralentit. Lorsque le ménisque du liquide appliqué atteint cinq à 10 millilitres au-dessus du lit de résine, retirez le capuchon de la colonne et la pompe à main attachée pour éviter l’introduction d’air dans la résine. Laissez le volume restant s’écouler par gravité.

Une fois que les extraits bruts ont fini de s’égoutter et que la surface de la résine est à nouveau exposée, utilisez une pipette Pasteur pour ajouter soigneusement environ 30 millilitres de tampon de lavage réfrigéré dans la colonne, en prenant soin de ne pas perturber la surface de la résine. Ouvrez le robinet d’arrêt et laissez le tampon de lavage s’écouler à travers la colonne. Pendant que la colonne se vide, étiquetez 16 tubes de microcentrifugation pour la collecte des fractions.

Lorsque le tampon s’est complètement vidé et que la surface de la résine est à nouveau exposée, fermez le robinet d’arrêt. À l’aide d’une pipette Pasteur, ajoutez soigneusement environ 30 millilitres de tampon d’élution réfrigéré dans la colonne, en prenant soin de ne pas perturber la surface de la résine. Ensuite, ouvrez lentement le robinet d’arrêt pour permettre au tampon d’élution d’éluer la protéine marquée à la polyhistidine de la colonne.

Prélever un millilitre d’éluant dans chacun des tubes de microcentrifugation marqués. Après avoir testé les protéines, combinez les fractions contenant des protéines dans un tube conique propre. Procédez à une reconstitution du cofacteur d’ions métalliques, ou congelez la protéine dans des aliquotes de trois millilitres à moins 80 degrés Celsius.

Pour commencer la reconstitution du métal, mettez une aliquote de trois millilitres de l’enzyme purifiée, en suspension dans un tampon d’élution, sur de la glace. À l’aide du volume de protéines dans le tube, calculez la quantité d’ascorbate de sodium et de dithiothréitol nécessaire pour que la concentration finale de chacun soit de 12,5 millimolaires dans l’échantillon. Ajoutez l’ascorbate de sodium solide et le dithiothréitol, et mélangez doucement mais soigneusement pour dissoudre complètement.

Tapotez quelques granules d’un millilitre de sulfate de fer solide heptahydraté sur un morceau de papier de pesée. Pliez le papier sur le granulé et écrasez-le avec le côté plat d’une spatule métallique. Ajoutez un grain de la poudre obtenue dans le tube contenant la solution protéique.

Vortex pour mélanger, ce qui donne une couleur rose-rose. Boucher le tube et incuber la solution rose sur de la glace pendant 10 à 30 minutes. La couleur rose s’estompera avec le temps.

Pour la filtration sur gel, utilisez une colonne de filtration en gel remplie de 10 millilitres de gel polyacrylamide sphérique dans une colonne de 1,5 x 12 centimètres, qui est également équipée d’un réservoir de 10 millilitres. Ensuite, équilibrez la colonne comme indiqué dans le protocole de texte. Lorsque le tampon s’est écoulé de la colonne et que le support supérieur du lit est exposé, fermez le robinet d’arrêt.

Pipetez la solution de trois millilitres de métalloenzyme de fer reconstitué sur le support supérieur exposé. Ouvrez le robinet d’arrêt et laissez l’échantillon entier de trois millilitres entrer dans la colonne par gravité. Jetez les trois premiers millilitres d’éluant.

Toute couleur rose qui se forme lors de la manipulation de la solution sera piégée en haut de la colonne. Lorsque la colonne a cessé de couler et que le support supérieur du lit est exposé, ajoutez quatre millilitres de tampon de filtration en gel et collectez quatre millilitres d’éluant sur des fractions de 8,5 millilitres. Après avoir combiné des fractions contenant des protéines, procéder au dosage ou à l’entreposage de l’échantillon comme indiqué dans le protocole textuel.

Dans cette étude, les étudiants ont purifié puis reconstitué une dioxygénase non héminique liant le fer marquée à la polyhistidine. L’analyse SDS-PAGE montre que la protéine marquée est efficacement purifiée. Les données d’activité recueillies par les étudiants sur l’action enzymatique de la L-dopa dioxygénase purifiée après reconstitution avec du fer deux et filtration ultérieure sur gel sont présentées ici.

Le décalage de cinq secondes avant le début de la collecte des données est typique des étudiants qui exécutent cette technique pour la première fois. Le test à l’état stationnaire indique que les paramètres cinétiques, tels que déterminés par l’ajustement des courbes de progression, sont cohérents avec les résultats publiés. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que plus de fer n’est pas mieux, car trop de fer entraînera une précipitation des protéines.

Les concentrations en fer dans l’excès de trois à cinq molaires de la protéine sont suffisantes. À la suite de cette procédure, les étudiants peuvent effectuer des expériences supplémentaires pour mesurer la structure de la solution, examiner la chimie dépendante des enzymes ou du substrat, le tout pour répondre à des questions supplémentaires sur le mécanisme de réaction.