Caenorhabditis Tamis : Un Instrument rudimentaire et une méthodologie pour le tri des petits organismes multicellulaires
4 juillet 2018
Le protocole actuel comprend une méthodologie pour le tri et le nettoyage des populations appariés selon l’âge de elegans de Caenorhabditis. Il utilise un simple, peu coûteux et un outil sur mesure efficace pour obtenir une grande population expérimentale de nématodes pour la recherche.
Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie moléculaire, impliquant des tests qui nécessitent des stades de développement spécifiques de C. elegans. Comme des dosages des niveaux d’expression des gènes et des protéines. L’avantage de cette technique est qu’elle permet une sélection précise et efficace d’un grand nombre de C. elegans en fonction de leur taille, ce qui facilite l’utilisation d’essais qui seraient normalement prohibitifs en termes de temps et d’argent.
En général, les personnes qui débutent dans cette méthode auront du mal parce qu’elles ne peuvent pas effectuer l’étape de rotation arquée ou qu’elles ne maintiennent pas le flux de solution au centre du maillage. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes de lavage et de retournement sont difficiles à apprendre. Certains peuvent avoir de la difficulté à interpréter et à visualiser des mouvements spécifiques dans le texte.
Pour commencer, procurez-vous deux tubes coniques de 50 ml avec couvercles, puis utilisez un foret étagé pour retirer le centre de la lèvre intérieure des couvercles. Si nécessaire, utilisez une lime, du papier de verre ou un outil rotatif pour nettoyer et poncer les bords et le dessus des couvercles. Découpez ensuite un disque de maille tissée en monofilament de nylon, légèrement plus petit que le diamètre du couvercle.
Texturez les surfaces supérieures des couvercles et nettoyez-les avec de l’éthanol. Après avoir laissé sécher les couvercles, appliquez de la colle cyanoacrylate sur les surfaces supérieures des deux couvercles. Ensuite, posez le disque à mailles monofilament sur un couvercle collé.
Retournez le deuxième couvercle sur le dessus du filet et appuyez fermement les couvercles ensemble. Une fois la première couche de colle sèche, appliquez un généreux anneau de colle cyanoacrylate autour de l’espace extérieur entre les couvercles. Ensuite, étiquetez le filtre avec la taille de ses pores de maille respectifs.
Tout d’abord, placez le tamis sur un tube conique de 50 ml étiqueté. Ensuite, pipetez la solution saline à travers le centre du tamis jusqu’à ce qu’une gouttelette se forme, fusionne et s’égoutte du centre du filtre. À l’aide du tampon M9, lavez une population de C. elegans d’une plaque de tarière, puis utilisez une pipette pasteur en verre pour transférer le tampon contenant les vers sur la face supérieure du treillis monofilament.
En opérant au centre de la maille, rincez le filtre avec un tampon M9, répétez cette étape de rinçage au besoin pour faire passer toutes les bactéries et les petits vers à travers la maille. Ensuite, fixez un nouveau tube conique de 50 ml sur le dessus du tamis, les vers précédemment collectés plus gros que les pores du filet feront face à l’intérieur du nouveau tube. Retirez le tube à déchets et retournez rapidement le tamis.
Rincez ensuite le grillage avec un tampon M9 dans le nouveau tube de collecte. Laissez les vers collectés se déposer pendant environ une minute, puis aspirez soigneusement la solution tampon loin de la pastille de vers. À l’aide d’une pipette pasteur en verre, créez des gouttelettes de vers sur une plaque NGM et laissez-les sécher.
Enfin, rincez le tamis avec de l’eau d’osmose inverse et de l’éthanol. Une fois le tamis sec, rangez-le dans un récipient propre pour une utilisation future. Jetez le tamis lorsqu’il développe un aspect affaissé.
Dans ce protocole, un tamis a été construit pour trier et nettoyer les populations de C. elegans appariées selon l’âge. Les animaux du groupe traité par tamis ont présenté des mouvements normaux et spontanés tout au long de l’âge adulte. De plus, les groupes de pioche et de tamis n’ont montré aucune différence significative dans le taux de pompe pharyngée.
Les animaux du groupe tamisé ont également réagi normalement à un stimulus mécanique antérieur ou postérieur par rapport à tous les groupes de traitement lors de l’un des jours d’essai. Enfin, la fécondité des groupes de traitement a été comparée ; L’utilisation du tamis n’a pas eu d’impact significatif sur le nombre de descendants par rapport au groupe de traitement Pick. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de dix minutes.
Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier d’opérer au centre de la zone du grillage. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’assembler et d’utiliser correctement un tamis Caenorhabditis pour trier les vers par taille corporelle.
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Aperçu
Ce protocole décrit une méthodologie pour trier et nettoyer des populations appariées par âge de Caenorhabditis elegans à l'aide d'un outil sur mesure. Il permet aux chercheurs d'obtenir efficacement et à moindre coût une population expérimentale importante.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie moléculaire
- Biologie du développement
Contexte
- Des stades de développement spécifiques de C.elegans sont cruciaux pour divers dosages.
- Les dosages peuvent impliquer des niveaux d'expression des gènes et des protéines.
- Les méthodes traditionnelles peuvent être longues et coûteuses.
- Des démonstrations visuelles sont essentielles pour comprendre la méthodologie.
Objectif de l'étude
- Offrir une méthode efficace pour sélectionner des C.elegans selon la taille du corps.
- Faciliter les tests nécessitant des stades de développement spécifiques.
- Améliorer l'accessibilité pour les chercheurs novices dans cette technique.
Méthodes utilisées
- Outil sur mesure pour le tri des nématodes.
- Étape de retournement incurvée pour un lavage efficace.
- Préservation du flux de solution au centre de la maille.
- Démonstrations visuelles pour faciliter l'apprentissage.
Résultats principaux
- Sélection précise d'un grand nombre de C.elegans réalisée.
- La méthode réduit le temps et le coût des essais de biologie moléculaire.
- Compréhension améliorée de mouvements spécifiques grâce à des aides visuelles.
- Accessibilité accrue pour les chercheurs peu familiers avec la méthode.
Conclusions
- Le protocole propose une méthode fiable pour le tri de C.elegans.
- Les supports visuels sont essentiels pour un apprentissage efficace de la technique.
- Cette méthodologie peut grandement bénéficier à la recherche en biologie moléculaire.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les professionnels
Dans la recherche et le développement en biopharmacie, l'obtention de populations synchronisées d'organismes modèles comme C. elegans est essentielle pour des criblages phénotypiques reproductibles et des tests de validation de cibles. Le Caenorhabditis Sieve permet un tri rapide et économique selon la taille corporelle, réduisant ainsi le temps et la charge des ressources dans les flux de travail de la phase initiale de découverte. Cela renforce la fiabilité prédictive de la préparation des tests et du tri des portefeuilles en assurant des entrées biologiques uniformes.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en utilisant des populations de vers âgés de manière comparable pour des lectures phénotypiques cohérentes.
- Valeur opérationnelle : Offre une méthode peu coûteuse et facilement reproductible pour générer des cohortes synchronisées sans équipement spécialisé.
- Valeur prédictive : Réduit la variabilité biologique dans les tests, améliorant la fiabilité des données pour l'atténuation des risques liés à la cible.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Prépare des systèmes biologiques validés pour le criblage de composés en aval en isolant des stades de développement spécifiques.
- Valeur opérationnelle : Standardise la préparation des vers, améliorant la reproductibilité entre les plaques d'essai et les campagnes de criblage.
- Évolutivité : Répond aux besoins de haut débit grâce à un traitement rapide de grandes populations de vers en moins de dix minutes.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Préserve la fidélité phénotypique du stade de découverte à la validation préclinique en maintenant les marqueurs de mobilité, de réponse au stress et de fécondité.
- Dérisquage mécanistique : Permet une évaluation fiable des niveaux d'expression génique et protéique dans des populations synchronisées, soutenant l'alignement des biomarqueurs.
- Avancement ajusté au risque : Facilite les décisions d'aller/non-aller en fournissant des données de modèle systématique cohérentes pour le profil d'efficacité et de toxicité.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Le Caenorhabditis Sieve s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la découverte précoce à l'identification de candidats, en soutenant spécifiquement la préparation des tests et la reproductibilité des criblages pour les écrans phénotypiques basés sur C. elegans.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses en fournissant des populations de vers uniformes pour l'élucidation des voies biologiques et le criblage fonctionnel.
- Criblage : Permet la préparation des tests grâce au tri par taille, assurant une taille et un stade larvaire constants des vers pour une évaluation fiable des composés.
- Analytique : Produit des résultats quantitatifs séparés par taille, permettant aux équipes de comparer les conditions à différents stades de développement avec un bruit réduit.
- Recherche translationnelle : Assure la continuité préclinique en maintenant des marqueurs clés de santé (motilité, réponse au stress, fécondité) après le tri, renforçant ainsi la validité des biomarqueurs.
- Réutilisation en entreprise : Fonctionne comme un outil réutilisable et peu exigeant en maintenance, partagé entre différentes équipes et projets, favorisant la standardisation dans la manipulation des organismes modèles.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive grâce à une ambiguïté mécanistique réduite dans les tests phénotypiques.
- Valeur opérationnelle : Normalisation, reproductibilité et évolutivité des protocoles de préparation des vers.
- Valeur stratégique : Meilleures décisions d'aller/arrêt, efficacité du capital et réduction des risques biologiques en phase avancée grâce à une détection précoce des risques.
- Impact sur le portefeuille : Priorisation et prise de décisions d'avancement ajustées au risque, fondées sur des données fiables provenant de systèmes modèles spécifiques à chaque étape.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Requiert des compétences de base en laboratoire pour le montage des tamis et la manipulation des solutions.
- Nécessite un accès à des tubes coniques, des mailles en nylon, de la colle cyanoacrylate et des tampons standards (M9, solution saline).
- Exige une formation transversale sur les opérations centrées sur la maille et la technique de retournement afin d’assurer une cohérence.
- Les considérations d’adaptation incluent le choix de la taille des pores de la maille selon les stades de vers ciblés, ainsi que la compatibilité avec divers systèmes de culture en milieu NGM ou en milieu liquide.
- Les limites pratiques comprennent un affaissement potentiel de la maille avec le temps, nécessitant un remplacement périodique pour maintenir la précision du tri.
