Name: Amplification de près de provirus pleine longueur de VIH-1 pour l’ordonnancement de prochaine génération (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Découvrez la méthode FLIPS pour amplifier et séquencer des provirus VIH-1 complets à partir de cellules infectées individuelles. Cette technique haut débit permet d'identifier les provirus génétiquement intacts et potentiellement réplication compétents.

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Ce travail a été soutenu le Delaney AIDS Research Enterprise (DARE) de trouver un remède (1U19AI096109 et 1UM1AI126611-01) ; l’amfAR Consortium de recherche sur l’éradication du VIH (ARCHE) subvention de recherche concertée de la Foundation for AIDS Research (amfAR 108074-50-RGRL) ; Centre australien pour le VIH et l’hépatite Virology Research (ACH2) ; GIVI-UCSF Center for AIDS Research (P30 AI027763) ; et l’Australian National Health and Medical Research Council (AAP1061681). Nous tenons à remercier m. Joey Lai, directeur des installations génomique à l’Institut de Westmead pour la recherche médicale pour sa formation en préparation de la bibliothèque et l’utilisation de ses installations et Ramaciotti Centre for Genomics (Université de New South Wales, Sydney, Australie) pour la conduite de séquençage. Nous reconnaissons avec gratitude les participants qui ont donné des échantillons pour cette étude.

<ol><li>Bruner, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+proviruses+rapidly+accumulate+during+acute+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Defective proviruses rapidly accumulate during acute HIV-1 infection.</a> Nature Medicine. 22 (9), 1043-1049 (2016).</li>
<li>Hiener, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Genetically+Intact+HIV-1+Proviruses+in+Specific+CD4%28%2B%29+T+Cells+from+Effectively+Treated+Participants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of Genetically Intact HIV-1 Proviruses in Specific CD4(+) T Cells from Effectively Treated Participants.</a> Cell Reports. 21 (3), 813-822 (2017).</li>
<li>Abram, M. E., Ferris, A. L., Shao, W., Alvord, W. G., Hughes, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature%2C+position%2C+and+frequency+of+mutations+made+in+a+single+cycle+of+HIV-1+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Nature, position, and frequency of mutations made in a single cycle of HIV-1 replication.</a> Journal of Virology. 84 (19), 9864-9878 (2010).</li>
<li>Ho, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-competent+noninduced+proviruses+in+the+latent+reservoir+increase+barrier+to+HIV-1+cure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Replication-competent noninduced proviruses in the latent reservoir increase barrier to HIV-1 cure.</a> Cell. 155 (3), 540-551 (2013).</li>
<li>Harris, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+deamination+mediates+innate+immunity+to+retroviral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA deamination mediates innate immunity to retroviral infection.</a> Cell. 113 (6), 803-809 (2003).</li>
<li>Lecossier, D., Bouchonnet, F., Clavel, F., Hance, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypermutation+of+HIV-1+DNA+in+the+absence+of+the+Vif+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hypermutation of HIV-1 DNA in the absence of the Vif protein.</a> Science. 300 (5622), 1112(2003).</li>
<li>Chun, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rebound+of+plasma+viremia+following+cessation+of+antiretroviral+therapy+despite+profoundly+low+levels+of+HIV+reservoir%3A+implications+for+eradication%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Rebound of plasma viremia following cessation of antiretroviral therapy despite profoundly low levels of HIV reservoir: implications for eradication.</a> AIDS. 24 (18), 2803-2808 (2010).</li>
<li>Chomont, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+reservoir+size+and+persistence+are+driven+by+T+cell+survival+and+homeostatic+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">HIV reservoir size and persistence are driven by T cell survival and homeostatic proliferation.</a> Nature Medicine. 15 (8), 893-900 (2009).</li>
<li>Soriano-Sarabia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+replication-competent+HIV-1+in+populations+of+resting+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Quantitation of replication-competent HIV-1 in populations of resting CD4+ T cells.</a> Journal of Virology. 88 (24), 14070-14077 (2014).</li>
<li>Josefsson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+reservoir+in+eight+patients+on+long-term+suppressive+antiretroviral+therapy+is+stable+with+few+genetic+changes+over+time%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 reservoir in eight patients on long-term suppressive antiretroviral therapy is stable with few genetic changes over time.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 110 (51), E4987-E4996 (2013).</li>
<li>Evering, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+HIV-1+evolution+in+the+gut-associated+lymphoid+tissue+from+patients+on+combination+antiviral+therapy+initiated+during+primary+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Absence of HIV-1 evolution in the gut-associated lymphoid tissue from patients on combination antiviral therapy initiated during primary infection.</a> Public Library of Science Pathogens. 8 (2), e1002506(2012).</li>
<li>von Stockenstrom, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+Genetic+Characterization+Reveals+That+Cell+Proliferation+Maintains+a+Persistent+HIV+Type+1+DNA+Pool+During+Effective+HIV+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Longitudinal Genetic Characterization Reveals That Cell Proliferation Maintains a Persistent HIV Type 1 DNA Pool During Effective HIV Therapy.</a> Journal of Infectious Diseases. 212 (4), 596-607 (2015).</li>
<li>Palmer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple%2C+linked+human+immunodeficiency+virus+type+1+drug+resistance+mutations+in+treatment-experienced+patients+are+missed+by+standard+genotype+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Multiple, linked human immunodeficiency virus type 1 drug resistance mutations in treatment-experienced patients are missed by standard genotype analysis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43 (1), 406-413 (2005).</li>
<li>Qiagen. CLC Genomics Version 10. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.qiagenbioinformatics.com/products/clc-genomics-workbench ">https://www.qiagenbioinformatics.com/products/clc-genomics-workbench </a> (2018).</li>
<li>Andrews, S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2010).</li>
<li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimmomatic%3A+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), (2011).</li>
<li>Magoc, T., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLASH%3A+fast+length+adjustment+of+short+reads+to+improve+genome+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies.</a> Bioinformatics. 27 (21), 2957-2963 (2011).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Bankevich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPAdes%3A+a+new+genome+assembly+algorithm+and+its+applications+to+single-cell+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing.</a> Journal of Computational Biology. 19 (5), 455-477 (2012).</li>
<li>Kumar, S., Stecher, G., Tamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEGA7%3A+Molecular+Evolutionary+Genetics+Analysis+Version+7.0+for+Bigger+Datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets.</a> Molecular Biology and Evolution. 33 (7), 1870-1874 (2016).</li>
<li>Katoh, K., Standley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAFFT+multiple+sequence+alignment+software+version+7%3A+improvements+in+performance+and+usability%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">MAFFT multiple sequence alignment software version 7: improvements in performance and usability.</a> Molecular Biology and Evolution. 30 (4), 772-780 (2013).</li>
<li>Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Gene Cutter tool. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/GENE_CUTTER/cutter.html ">https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/GENE_CUTTER/cutter.html </a> (2018).</li>
<li>Foster, J. L., Garcia, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Nef+in+HIV-1+replication+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Role of Nef in HIV-1 replication and pathogenesis.</a> Advances in Pharmacology. 55, 389-409 (2007).</li>
<li>Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Consensus Maker tool. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/CONSENSUS/consensus.html">https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/CONSENSUS/consensus.html</a> (2018).</li>
<li>Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Hypermut tool. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HYPERMUT/hypermut.html">https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HYPERMUT/hypermut.html</a> (2018).</li>
<li>Yu, G., Smith, D. K., Zhu, H., Guan, Y., Lam, T. T. Y. <a target="_blank" href="https://besjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/2041-210X.12628">ggtree: an r package for visualization and annotation of phylogenetic trees with their covariates and other associated data.</a> Methods in Ecology and Evolution. , (2016).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L’essai de FLIPS est une méthode efficace et haut-débit pour amplification et séquençage simple, proche du VIH-1 provirus. Divers facteurs et des étapes cruciales dans le protocole qui influent sur le nombre et la qualité des séquences obtenues ont été identifiés. Tout d’abord, le nombre de cellules et la fréquence de l’infection VIH-1 de la population cellulaire influencent le nombre de provirus amplifié. Par exemple, dans une publication précédente, environ la moitié des séquences autant ont été obtenues depuis le même nombre de naïve CD4+ T par rapport à la mémoire de l’effecteur CD4 des cellules+ T des cellules. C’est parce que les cellules naïves ont généralement une plus faible fréquence d’infection que de cellules effectrices mémoire2. Deuxièmement, la lyse cellulaire est préférable à des méthodes d’extraction basée sur les colonnes pour obtenir l’ADN génomique, comme il n’y a aucun risque de perdre l’ADN dans le processus d’extraction. Enfin, comme pour n’importe quel test d’amplification PCR, empêchant la contamination est essentielle. Régions non séparées devraient être désignées pour la préparation de mélanges maîtres, manipulation de l’ADN génomique, ajout de contrôles positifs, purification d’ADN et la quantification et préparation de la bibliothèque. Ceci est particulièrement important pour la simple copie des tests comme celui présenté ici.
Mise en œuvre de l’essai de FLIPS devrait inclure tout d’abord un témoin positif comme les plasmides pNL4-3 plutôt que des échantillons de participants en cours d’exécution. Cela permettra de n’importe quel dépannage avant l’utilisation des cellules positives VIH-1, comme les séquences obtenues peuvent être comparés à des séquences de référence disponibles pour ces plasmides. Lors de l’utilisation des cellules positives VIH-1, il est important de considérer le sous-type du VIH-1 (amorces pour FLIPS sont spécifiques de sous-type B) et la fréquence de l’infection de la population cellulaire si peu à aucune provirus est amplifié. Séquences d’amorces peuvent être modifiés/redessiné pour faire correspondre les autres sous-types. En outre, une cupule contenant un contrôle positif devrait figurer dans chaque PCR réalisée.
FLIPS a surmonter les limitations de précédents essais de séquençage, y compris SPS. Grâce à l’amplification et le séquençage près du VIH-1 provirus, FLIPS peuvent déterminer la réplication-compétence potentielle de provirus VIH-1. Ce n’était pas possible à l’aide de SPS, qui séquencé seulement des régions sub-génomiques et donc sélectionné pour les séquences avec les sites de liaison apprêt intact. En outre, FLIPS surmonte les limites associées utilisant plusieurs amplification et amorces de séquençage, était employé par le précédent séquençage de longs essais1,4. Par le biais de deux cycles de PCR ciblant les régions LTR du VIH-1 combinées avec NGS, FLIPS diminue le nombre et la complexité des amorces requis. FLIPS est donc moins sensible aux conséquences de l’inadéquation de l’amorce, à savoir l’identification erronée des provirus défectueux et une incapacité à amplifier certains provirus au sein d’une population. Le protocole de FLIPS est également plus efficace et permet un débit plus élevé du séquençage que les méthodes précédentes.
De toute évidence, FLIPS offre des avantages par rapport aux méthodes actuelles qui déterminent la composition génétique du VIH-1 provirus. Cependant, il est important de reconnaître les limites des FLIPS. Tout d’abord, l’essai de FLIPS n’a pas été développé comme un outil pour mesurer la taille du réservoir du VIH-1 latente, comme des analyses pour déterminer si les FLIPS amplifie chaque provirus HIV-1 présents dans une population de cellules n’ont pas été accomplies. FLIPS est plutôt utile pour faire des comparaisons relatives de la composition du réservoir entre des populations de cellules différentes2. Deuxièmement, la réplication-compétence de provirus intacts de VIH-1 ne peut être déterminée avec certitude sans en vivo analyses, telles que celles effectuées par Ho et al. 4. Troisièmement, FLIPS n’est pas conçu pour déterminer le site d’intégration du VIH-1 provirus.
Les variations mineures au protocole FLIPS peuvent augmenter sa demande. Par exemple, changements dans l’amorce peuvent permettre à des séquences différentes et plusieurs sous-types du VIH-1 d’être amplifié et séquencé. Le séquençage des virions de VIH-1 plasmatique est possible grâce à l’ajout de synthèse de cDNA avant PCR nichée. L’utilisation future des méthodes de séquençage de molécule unique éliminera le besoin pour l’assemblage de novo .
Séquençage génétique de provirus intégrées de VIH-1 a augmenté notre compréhension du VIH-1 réservoir latent. FLIPS est un outil important pour les futures études élucider la composition et la distribution du réservoir latent. Toutefois, l’application des FLIPS peut déborder le réservoir. Les études à venir pourraient utiliser FLIPS pour déterminer des cibles pour la technologie CRISPR-Cas particuliers ou d’aider à l’identification du codage et régions non codantes qui rendre le virus plus sensible aux latence inversion des agents. La recombinaison virale peut être mieux comprise en regardant les sites de jonction des délétions internes importantes.

Caractérisation génétique du VIH-1 réservoir latent, qui persiste chez les personnes sous traitement antirétroviral à long terme (ART), a été essentielle pour comprendre que la majorité des provirus intégrés sont défectueux et réplique-incompétents1 , 2. au cours du processus de transcription inverse, les erreurs sont introduites dans la séquence provirale intégrée. Certains mécanismes qui génèrent des séquences proviral défectueux comprennent les erreurs d’enzyme transcriptase inverse du VIH-13, modèle de commutation4et/ou hypermutation somatique induite par APOBEC5,6. Deux études récentes ont montré qu’environ 5 % du VIH-1 provirus isolées de particuliers sur l’ART à long terme sont génétiquement intactes et potentiellement aptes à la réplication et peuvent contribuer à la reprise rapide du VIH-1 plasmatique à la cessation de l’ART 1 , 2 , 7. des études antérieures ont identifié qu’aptes à la réplication du VIH-1 provirus persistent dans le naïf et repos mémoire CD4+ T cell sous-ensembles (y compris la centrale, transitoire et les cellules de mémoire T effectrices), indiquant l’importance de ciblant ces cellules à l’avenir l’éradication des stratégies2,8,9.
Premiers aperçus de la distribution, la dynamique et l’entretien du réservoir latent du VIH-1 ont été obtenus par l’utilisation de méthodes de séquençage simple-proviral (SPS) qui caractérisent génétiquement des régions sub-génomiques du génome du VIH-110 ,11,12,13. SPS est un outil polyvalent, capable de séquencer un provirus unique de VIH-1 de dans une seule cellule infectée. Toutefois, le SPS est incapable de déterminer la compétence de la réplication de provirus, car il seulement séquences génomiques void provirus régions et de justesse qui contiennent des grandes délétions au sein des sites de liaison d’amorce. Une étude antérieure a montré que le SPS surestime la taille du réservoir aptes à la réplication de 13 à 17 fois par séquençage sélectivement intact régions génomiques sub2.
Pour pallier les lacunes du SPS, Ho et al. 4 et Bruner et al. 1 mis au point des épreuves pour la séquence près de provirus pleine longueur de VIH-1. Cela a permis la fréquence de génétiquement intactes et potentiellement aptes à la réplication, provirus VIH-1 chez les sujets sur l’ART à long terme à déterminer. Ces dosages amplifié et séquencé (par l’intermédiaire de Sanger séquençage) des régions sub-génomiques qui étaient ensuite assemblées pour obtenir un provirus du VIH-1 séquence du (intactes ou défectueux). Trois limites de cette approche sont : 1) l’utilisation de plusieurs amorces de séquençage augmente le risque d’introduire involontairement des défauts dans la séquence provirale, apprêt 2) incompatibilités peuvent empêcher l’amplification de provirus particulières et 3) souvent la toute la séquence provirale ne peut être résolue en raison de la technicité de ces méthodes.
Pour surmonter les limitations existant essais de séquençage proviral du VIH-1 pleine longueur, nous avons développé le Full -Longueur j’individuel Proviral Sequencing (FLIPS) test. FLIPS est un nouvelle génération séquençage (NGS)-fonction test qui amplifie et séquences près de provirus pleine longueur de VIH-1 (intactes ou défectueux) d’une manière efficace et haut débit. FLIPS fournit des avantages par rapport aux essais antérieurs, qu’il limite le nombre d’amorces utilisées ; par conséquent, elle diminue la chance d’apprêt décalages, qui pourraient limiter la population de provirus capturé ou introduisent involontairement des défauts dans une séquence virale. FLIPS est également moins techniquement difficile que les tests précédents et comprend 6 grandes étapes : cellules 1) lyse des infectés par le VIH-1, 2) amplification du seul provirus VIH-1 par PCR nichée effectué à limiter la dilution à l’aide d’amorces spécifiques pour la hautement conservée HIV-1 5' et 3' U5 LTR région (Figure 1 a), 3) purification et la quantification des produits amplifiés, 4) préparation de la bibliothèque de provirus amplifiés pour NGS, 5) NGS et 6) montage de novo de provirus séquencées pour obtenir des contigs de chacun provirus individuels.
Séquences générées par FLIPS peuvent subir un processus rigoureux d’élimination pour identifier ceux qui sont génétiquement intacte et potentiellement aptes à la réplication (Figure 1)2. Provirus génétiquement intactes n’ont pas tous les défauts connus résultant dans la génération d’un provirus réplique-incompétents. Ces défauts incluent : séquences d’inversion, grandes délétions internes, les codons stop hypermutation somatique/délétères, déphasages ou mutations dans la conditionnement de signaux ou à grande échelle 5' splice site donneur (MSD).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig1.jpg"> Figure 1 : les étapes essentielles dans l’analyse du séquençage proviral individuels (FLIPS). (A) génome d’ARN du VIH-1 avec les sites de liaison d’amorce dans les régions 5' et 3' de U5 LTR utilisées par FLIPS pour amplifier près de pleine longueur (défectueux et intacts) VIH-1 provirus via PCR nichée. (B) mise en page d’une plaque PCR 96 puits contenant 80 puits d’échantillons (20 puits pour chaque dilution) et 4 puits de contrôle négatif, 1 contrôle positif bien. (C) le processus d’élimination utilisée pour identifier génétiquement intactes et potentiellement aptes à la réplication, le VIH-1 provirus. Ce chiffre a été modifié par Hiener et al. 2 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

<table><tbody><tr><td>UltraPure 1 M Tris-HCI, pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15568025</td><td>Diluer à 5 mM pour PCR imbriquée</td></tr><tr><td>Nonidet P 40 Solution de substitution</td><td>Sigma</td><td>98379</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Solution de protéinase K (20 mg/mL)</td><td>Promega</td><td>AM2548</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycleur</td><td></td><td></td> à 96 puits <td>N’importe quel thermocycleur à 96 puits peut être utilisé</td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA polymérase Haute Fidélité</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>10x Tampon Haute Fidélité [600 mM Tris-SO4 (pH 8,9), 180 mM (NH4)2SO4]</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>50 mM MgSO4</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>Mélange de nucléotides PCR, 10 mM</td><td>Promega</td><td>C1141</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure H2O</td><td>Invitrogen</td><td>10977023</td><td></td></tr><tr><td>Amorces</td><td></td><td></td> PCR1 et PCR2 <td>dessalées. Diluer à (100 & micro ; M) avec H2O</td></tr><tr><td>Plaque PCR 96 puits, demi-jupe, coin à encoche unique, transparent</td><td>Axygen</td><td>PCR-96M2-HS-C</td><td></td></tr><tr><td>Microseal 'B' Adhesive Seals</td><td>BioRad</td><td>MSB1001</td><td>Requis pour sceller 96 plaques PCR</td></tr><tr><td>HIV-1 NL4-3 Clone moléculaire infectieux (pNL4-3)</td><td>Le réactif suivant a été obtenu par le biais du programme de réactifs du NIH sur le sida, Division du sida, du NIAID, du NIH : HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) du Dr Malcolm Martin (Cat# 114).</td><td></td><td>Dilué à 105 copies/mL et utilisé comme</td></tr><tr><td>témoin positif PCR plaque centrifuge ou centrifugeuse</td><td></td><td></td><td></td>de paillasse</tr><tr><td>E-GEL 48 1 % Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>G800801</td><td>Gels d’agarose préfabriqués à 1 % (deux gels utilisés par plaque à 96 puits). N’importe quel gel d’agarose à 1 % peut être substitué. Contient du bromure d’éthidium.</td></tr><tr><td>Marqueur d’ADN DirectLoad Wide Range</td><td>Sigma</td><td>D7058</td><td>Toute échelle d’une portée allant jusqu’à 10 kb peut être remplacée</td></tr><tr><td>Dispositif Mother E-Base</td><td>Invitrogen</td><td>EBM03</td><td>Requis pour le fonctionnement de gels d’agarose préfabriqués à 48 puits à 1 %</td></tr><tr><td>Gel Doc EZ Système de documentation</td><td>BioRad</td><td>1708270</td><td>Tout système de visualisation pour le bromure d’éthidium contenant des gels d’agarose peut être utilisé</td></tr><tr><td>PlateMax Peelable Heat Sealing</td><td>Axygen</td><td>HS-200</td><td>Film thermoscellable pour stockage à long terme</td></tr><tr><td>Plaque de stockage 96 puits 0,8 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AB0765</td><td>0,8 mL Plaque 96 puits requise pour la purification PCR à base de billes magnétiques</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP (kit de purification PCR)</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>Kit de purification PCR à base de billes magnétiques. D’autres kits de purification PCR peuvent être remplacés ici ( par exemple QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen Cat#28106)</td></tr><tr><td>Alcool éthylique, pur. 200 proof, pour la biologie moléculaire</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Stand-96</td><td>Invitrogen</td><td>AM10027</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur</td><td></td><td></td> de microplaques <td>Tampon optionnel</td></tr><tr><td>EB</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td>Tampon d’élution</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen Kit de dosage de l’ADNdb</td><td>Invitrogen</td><td>P11496</td><td>Une coloration à base de fluorescence pour la mesure de la concentration d’ADNdb</td></tr><tr><td>Lecteur</td><td></td><td></td><td></td>de microplaques</tr><tr><td>Nextera XT Kit de préparation de la bibliothèque d’ADN</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1096</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT Index Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-131-2001</td><td></td></tr><tr><td>Plaques PCR à coque dure 96 puits</td><td>Biorad</td><td>HSP9601</td><td>Requis pour le kit de préparation de banque d’ADN Nextera XT</td></tr><tr><td>Kit de quantification de bibliothèque - Illumina/Universal</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4824</td><td>D’autres kits de quantification de bibliothèque peuvent être remplacés (par exemple Quantification de la bibliothèque d’ADN JetSeq Kit Lo-Rox (Bioline Cat#BIO-68029)</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyseur</td><td>Technologie Agilent</td><td></td><td>Système d’électrophorèse automatisé . À utiliser en conjonction avec un kit ADN haute sensibilité</td></tr><tr><td>Kit ADN haute sensibilité</td><td>Technologie Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Illumina MiSeq</td><td>Platform Illumina</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

amplification de près de provirus pleine longueur de vih-1 pour l’ordonnancement de prochaine génération

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

L’essai de séquençage pleine longueur Proviral individuels (FLIPS) est une méthode efficace et haut débit conçue pour amplifier et séquence unique, près de pleine longueur (intacts et défectueux), le VIH-1 provirus. FLIPS permet la détermination de la composition génétique du VIH-1 intégré au sein d’une population cellulaire. Grâce à l’identification des défauts dans les séquences proviral du VIH-1 qui se posent au cours de la transcriptase inverse, comme les grandes délétions internes, arrêt délétères codons/hypermutation somatique, mutations de déphasage et mutations/suppressions en cis en qualité d’éléments requis pour la maturation du virion, FLIPS peuvent identifier incapable de réplication intégrées provirus. Le dosage de FLIPS peut être utilisé pour identifier des provirus VIH-1 qui n’ont pas ces défauts et sont donc potentiellement aptes à la réplication. Le protocole de FLIPS implique : la lyse des cellules infectés par le VIH-1, nested PCR de près de provirus pleine longueur de VIH-1 (en utilisant des amorces ciblés le VIH-1 5' et 3' LTR), purification d’ADN et la quantification, préparation pour la prochaine génération séquençage (NGS), NGS, de la bibliothèque de novo Assemblée des contigs proviral, un simple processus d’élimination pour identifier le provirus aptes à la réplication. FLIPS fournit des avantages par rapport aux méthodes traditionnelles conçues pour séquence intégrée provirus VIH-1, tels que le séquençage simple-proviral. FLIPS amplifie et séquences près de provirus pleine longueur permettant aux compétences de réplication à déterminer et utilise également des amorces d’amplification moins, prévenir les conséquences d’apprêt incompatibilités. FLIPS est un outil utile pour comprendre le paysage génétique d’intégré provirus VIH-1, en particulier dans le réservoir latent, cependant, son utilisation peut s’étendre à toutes les applications pour lesquelles la composition génétique du VIH-1 intégrée est nécessaire.

Le test de FLIPS amplifie et séquences simple, près de provirus pleine longueur de VIH-1. Le protocole comporte 6 étapes pour obtenir près de séquences proviral pleine longueur. Ces étapes comprennent : la lyse des cellules, PCR nichée de provirus pleine longueur de VIH-1 (intactes ou défectueux), purification d’ADN et quantification, séquençage de préparation de la bibliothèque, NGS, infectées et de novo Assemblée de séquencé provirus. La fin de chaque étape peut être considéré comme un point de contrôle dont la qualité du produit (p. ex. amplifiés d’ADN, ADN purifié, bibliothèque de séquençage ou séquence) peut être évaluée avant la prochaine étape. Un aperçu de l’évaluation effectuée à la fin de chaque étape et les résultats attendus sont énoncés ci-dessous.
Suite à la PCR nichée, les produits d’amplification sont exécutés sur un gel d’agarose à 1 % (Figure 3). La qualité initiale de la PCR peut être déterminée par l’inspection des témoins négatifs et positifs. Puits de contrôle négatif contenant du produit amplifié indiquent la contamination et puits de contrôle positif en l’absence du produit amplifié amplification insuffisante. Ensuite, puits contenant des produits amplifiés sont sélectionnés pour l’ordonnancement. Pour éviter les puits contenant des mélanges de plusieurs provirus amplifiés, seulement les puits contenant du produit amplifié à dilution point final sont considérés pour le séquençage. Selon la distribution de Poisson, la dilution point final se trouve quand 30 % des puits sont positifs pour produit amplifié. À cette dilution, il y a un 80 % chance ces puits contiennent un provirus amplifié unique. En outre, puits contenant plusieurs provirus amplifiés de différentes longueurs peuvent être visualisées à ce stade que les bandes multiples apparaîtra sur le gel. Ces puits ne doivent pas être sélectionnés de séquençage (Figure 3).
Après la purification des provirus amplifiés sélectionné pour le séquençage, quantification assure qu'aucun ADN proviral n’est perdue au cours de l’étape de purification. Si la concentration de l’ADN d’un provirus amplifié est &lt; 0,2 ng/µL, l’échantillon restant dans le PCR2 plaque peut être épuré. Un point de contrôle similaire survient après préparation de bibliothèque, dans laquelle chaque bibliothèque est quantifiée. Ceci assure provirus individuels ont été convenablement fragmentés, tag et amplifiés avant séquençage. Chaque bibliothèque proviral est regroupé dans des quantités équimolaires à une concentration finale de bibliothèque de 4 nM (ou tel que spécifié par le fournisseur de séquençage). Si la concentration d’une bibliothèque individuelle provirale est trop faible, il peut être exclu du pool de bibliothèque de séquençage, ou la bibliothèque individuelle établi à nouveau. Une dernière vérification de la concentration de la bibliothèque de mise en commun est effectuée avant de séquençage ainsi que de confirmer la longueur moyenne de fragment.
Étapes de contrôle qualité avant l’étape de l’Assemblée de novo assure la qualité des lectures utilisées pour assembler le contig proviral final. Ces étapes incluent : suppression de séquences de l’adaptateur, règlage de 5' et 3' nucléotides, une limite de qualité très strictes et en ignorant les courtes lectures. CLC Genomics Workbench peut fournir des rapports de contrôle de la qualité qui peuvent être utilisés avant d’évaluer la qualité initiale des lectures et des paramètres de coupe guide, puis après pour déterminer si la compensation était suffisante pour supprimer les régions de basse qualité. En outre, pour l’assemblage de novo , la qualité de l’assemblé contigs peut être évaluée à une profondeur suffisante (&gt; 1000 X) et une bonne uniformité de la couverture (Figure 4 a). Une population mixte peut également être identifiée à ce stade. Mélanges de plusieurs provirus pleine longueur (~ 9 kb) sont identifiés par la présence de multiples SNP avec une fréquence de plus de 40 %, alors que les mélanges du short (contenant une grande délétion interne) et du provirus pleine longueur peuvent être identifiés par l’inégale lire la couverture après le mappage à un album de référence du même participant (Figure 4 b).
Selon l’application, l’alignement final peut être visualisé en utilisant des outils comme ggtree disponible comme paquet dans « R: A langage et un environnement de calcul statistique »27. Dans une étude récente, FLIPS servait à provirus séquence VIH-1 de la mémoire naïve, centrale, transitoire et effectrices CD4+ T les cellules isolées de particuliers sur l’ART à long terme, dans le but d’identifier les sous-ensembles de cellule particulière a montré plus haut proportions de génétiquement intacte et potentiellement aptes à la réplication du VIH-12. Représentation visuelle des séquences isolées d’un des participants de cette étude (participant 2026) est présentée ici, (Figure 5). Ce participant, la majorité (97 %) des séquences était défectueuse, avec des séquences intactes trouvés à effecteur et mémoire transitoire CD4+ T des cellules. Cet outil de visualisation est utile pour afficher le nombre de séquences avec des grandes délétions internes et leur position dans le génome. Elle peut être annotée plus loin pour indiquer les séquences avec les codons stop délétères, mutations de déphasage et destructions/mutations dans le site MSD et/ou le signal de l’emballage.
Une application du dosage FLIPS est d’identifier génétiquement intactes et potentiellement aptes à la réplication du VIH-1 provirus. Dans une étude récente de 531 séquences isolées de CD4 des cellules de 6 participants sur l’ART à long terme,+ T 26 provirus de HIV-1 génétiquement intactes (5 %) ont été identifiés2. Les provirus défectueux restants comprenaient ceux renfermant des séquences d’inversion (6 %), grandes délétions internes (68 %), arrêt délétères codons/hypermutation somatique (9 %), mutations de déphasage (1 %) et de défauts dans le signal de l’emballage et/ou les mutations dans le site MSD (11 %) .
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig2.jpg"> Figure 2 : Vue d’ensemble du flux de travail pour l’assemblage de novo de provirus VIH-1. Les principales étapes du flux de travail incluent : séquence 1) lire le contrôle de la qualité, 2) fusion des paires qui se chevauchent, 3) Assemblée de novo et 4) remappage et création d’un consensus ont été couleur rouge, bleu, vert et orange, respectivement. Ce chiffre a été modifié par Hiener et al. 2 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig3.jpg"> Figure 3 : gel d’agarose exemple de PCR amplifiés provirus VIH-1. Puits 1, 2, 3, 6, 9 et 10 contiennent amplifiés provirus VIH-1. Bien 10 contient un provirus avec une grande délétion interne, 2 puits contient co amplification de deux provirus VIH-1 de différentes longueurs (mélange) et 12 puits contient le contrôle positif. Noter le pourcentage de puits contenant du produit amplifié est 60 %, ce qui est supérieure au pourcentage requis pour isoler les modèles simples. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig4.jpg"> Figure 4 : exemple de sortie de cartographie lire. (A) exemple démontrant la même couverture en raison de l’amplification d’un provirus unique de HIV-1 pleine longueur. Suite de novo Assemblée, toutes les lectures sont mappées à la contig assemblé pour produire une séquence consensus. La plate-forme logicielle permet les lectures mappés à inspecter pour une couverture suffisante et même. (B) exemple démontrant l’amplification Co de deux provirus VIH-1 de différentes longueurs (mélange). Pour déterminer les mélanges, lectures sont mappées à une séquence de référence pleine longueur (~ 9 kb) depuis le même participant et lire cartographie inspectée. La présence de couverture inégale indique un mélange. Cette figure est reproduite avec la permission de Qiagen14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig5.jpg"> Figure 5 : Visualisation d’exemple de séquences proviral du VIH-1 isolé de CD4+ T cell sous-ensembles d’un individu sur l’ART à long terme. Séquences proviral individuels du VIH-1 sont représentées par des traits horizontaux. Ce chiffre a été modifié par Hiener et al. 2 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Pleine longueur séquençage proviral individuel (FLIPS) fournit une méthode efficace et haut débit pour l’amplification et le séquençage d’unique, près de provirus pleine longueur de VIH-1 (intactes ou défectueux) et permettant la détermination de leur potentiel réplication-compétences. FLIPS surmonte les limites des tests précédents conçus pour séquencer le réservoir latent de VIH-1.

Amplification de près de provirus pleine longueur de VIH-1 pour l’ordonnancement de prochaine génération

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du VIH, telles que la détermination de la composition génétique des provirus vih et des différents types de cellules. En particulier l’identification de ceux qui sont génétiquement intacts et potentiellement la réplication compétente. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle nous permet d’amplifier des provirus VIH presque pleine longueur à partir de cellules infectées par le VIH unique, puis de les séquencer par séquençage de prochaine génération.Pour commencer, préparez tous les tampons tels qu’ils sont décrits dans le protocole de texte. Obtenez une pastille cellulaire et ajoutez une centaine de microlitres de tampon de lyse par million de cellules. Mélanger en pipetant de haut en bas.Lyse les cellules en couveant dans un cycleur thermique à 55 degrés Celsius pendant une heure, puis ajouter 85 degrés Celsius pendant 15 minutes. Pour commencer à amplifier les provirus de l’ADN vih-1, mélanger les réacollants pour le PCR du premier tour comme indiqué dans le tableau un du protocole de texte. Ajouter 38 microlitres à 85 puits dans une plaque PCR de 96 puits et étiqueter cette plaque comme PCR 1.Après cela, déplacez la plaque PCR 1 vers une zone claire désignée pour l’ajout d’ADN génomique. L’utilisation du trichlorure dilue périodiquement l’ADN génomique d’un rapport de un à trois pour un rapport de un à 81 en s’assurant de préparer 45 microlitres de chaque dilution. Ajouter deux microlitres d’ADN génomique dilué à chaque puits d’échantillon et deux microlitres d’hydrochlorure de tris à chaque puits de contrôle négatif.Sceller toute la plaque à l’exception du puits de contrôle positif. Ensuite, déplacez-vous vers une zone désignée pour l’ajout du contrôle positif. Ajouter deux microlitres du contrôle positif au puits correspondant, puis sceller complètement la plaque.Utilisez une essoreuse à plaques PCR pour faire tourner brièvement la plaque PRC 1 et retirer tout contenu résiduel des côtés des puits. Exécutez la plaque PCR 1 dans le cycleur thermique tel que décrit dans le protocole de texte. Ensuite, mélangez les reagents pour le deuxième tour de PCR comme indiqué dans le tableau un.Ajouter 28 microlitres de ce mélange PCR 2 à 85 puits d’une nouvelle plaque PCR bien 96. Étiquetez cette plaque comme PCR 2. À l’aide d’une essoreuse à plaques, faites tourner brièvement la plaque PCR 1 pour retirer tout contenu résiduel des côtés des puits.Ajouter 80 microlitres d’hydrochlorure tris à chaque puits de cette plaque. Après cela, utilisez une pipette mutli-canal pour transférer deux microlitres de chaque puits de la plaque PCR 1 aux puits correspondants dans la plaque PCR 2. Sceller la plaque PCR 2 avec une enveloppe adhésive claire.Faites tourner brièvement la plaque PCR 2 dans la essoreuse de plaque. Pendant ce temps, sceller la plaque PCR 1 avec un film d’étanchéité à la chaleur pour un stockage à long terme à moins 20 degrés Celsius. Exécutez la plaque PCR 2 dans un cycleur thermique tel que décrit dans le protocole de texte.Ensuite, tournez brièvement la plaque PCR 2 pour retirer tout contenu résiduel des côtés des puits. À l’aide d’une pipette multicanal, ajouter 60 microlitres d’hydrochlorure de tris à chaque puits. Ensuite, exécutez 15 microlitres de chaque puits sur deux 48 gels d’agarose préfabricés de 48 puits qui contiennent du bromure d’éthidium.Identifiez les puits contenant le produit amplifié et leurs tailles approximatives et enregistrez l’image du gel. Après cela, déterminer la dilution à laquelle pas plus de 30 pour cent des puits sont positifs pour le produit amplifié. Tout d’abord, utilisez une essoreuse à plaques pour faire tourner brièvement la plaque PCR 2 et retirer tout contenu résiduel des côtés des puits.Transférer 40 microlitres des puits contenant du produit amplifié vers les puits correspondants d’une nouvelle plaque midi de 96 puits. Ensuite, établissez un kit de purification à base d’alimentation magnétique en vous assurant d’amener les perles magnétiques à température ambiante et de préparer une nouvelle solution de 80 pour cent d’éthanol. Une fois que les perles atteignent la température ambiante vortex pour s’assurer qu’ils sont complètement résuspendus.À l’aide d’une pipette multicanal, ajouter 40 microlitres de perles aux 40 microlitres de produits amplifiés dans chaque puits de la plaque midi. Mélanger en faisant glisser doucement de haut en bas 10 fois. Incuber à température ambiante pendant cinq minutes.Ensuite, transférez la plaque sur un support magnétique et laissez-la reposer pendant deux minutes. Après cela, retirez et jetez le surnatant. Avec la plaque encore sur le stand, laver les perles en ajoutant deux cents microlitres de la solution éthanol à 80 pour cent à chaque puits.Incuber à température ambiante pendant 30 secondes, puis retirer et jeter le surnatant. Répétez ce processus de lavage une fois, de l’ajout de l’éthanol au rejet du surnatant. À l’aide d’une pipette multicanal, éliminer tout excès d’éthanol.Laisser sécher l’air des perles pendant 15 minutes. Après cela, retirez la plaque du support. Ajouter 30 microlitres de tampon d’élitution à chaque puits et mélanger en pipetting doucement de haut en bas 10 fois.Incuber à température ambiante pendant deux minutes. Remettre la plaque sur le support magnétique et laisser reposer pendant deux minutes. À l’aide d’une pipette multicanal, transférer 25 microlitres du supernatant aux puits correspondants d’une nouvelle plaque PCR de puits 96.Ensuite, utilisez un photomètre spectra pour déterminer et enregistrer la concentration approximative de chaque produit d’ADN amplifié. Mettez en place une double trousse de quantification de l’ADN échouée et diluez le tampon à une fois dans de l’eau stérile sans ADN. Ajouter 99 microlitres du tampon à un nombre approprié de puits vides dans une plaque de culture de tissu à fond plat.Ensuite, ajoutez une centaine de microlitres de tampon à trois puits vierges. Pour chaque produit amplifié à mesurer ajouter un microlitre d’ADN purifié en triplicate à chaque tampon contenant bien. Diluer l’ADN double brin lambda 10 fois de deux nanogrammes par microlitre au point zéro nanogrammes par microlitre pour préparer les normes.Ajouter une centaine de microlitres de chaque norme d’ADN à double brin à trois puits. Diluer le colorant de florescence d’un à deux cents avec tampon. Ajoutez rapidement une centaine de microlitres à chaque puits qui contient un échantillon, blanc ou standard et mélangez en pipetting de haut en bas.Après cela, couvrir la plaque de papier d’aluminium pour éviter tout contact avec la lumière. À l’aide d’un lecteur de microplaque, enregistrez l’émission de florescence. Utilisez les mesures enregistrées pour déterminer la concentration d’ADN double brin dans chaque échantillon.Ensuite, diluer chaque produit purifié avec de l’eau à une concentration de zéro point deux nanogrammes par microlitre. Après pcr imbriqué, les produits amplifiés sont exécutés sur un gel d’agarose d’un pour cent. La qualité initiale du PCR peut être déterminée en inspectant les commandes.Comme les contrôles négatifs contenant des produits amplifiés indiquent une contamination et que les contrôles positifs sans produit amplifié indiquent une amplification insuffisante. Seuls les puits fonctionnent à la dilution du point final qui contiennent des provirus amplifiés simples sont considérés pour le séquençage. Bien que les puits contenant plusieurs provirus amplifiés de différentes longueurs puissent être visualisés à ce stade, ils ne devraient pas être sélectionnés pour le séquençage.Pour l’assemblage de novo, la qualité des contigs assemblés peut être évaluée pour une profondeur et une evenness suffisantes de couverture. Les populations mixtes peuvent également être identifiées à ce stade par la présence d’une couverture inégale. La représentation visuelle des séquences isolées d’un participant révèle que 97 p. 100 de leurs séquences sont défectueuses.Avec des séquences intactes trouvées dans l’effecteur et la mémoire transitoire CD4 cellules T positives. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler que seuls les produits amplifiés obtenus à la dilution limitative, c’est-à-dire là où pas plus de 30 pour cent des puits sont positifs, contiennent un seul provirus. À la suite de cette procédure, des produits amplifiés peuvent être séquencés pour déterminer la composition génétique des provirus anti-VIH.Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine du VIH pour explorer la distribution de provirus génétiquement intacts du VIH et de différents types de cellules chez les patients sous traitement afin de déterminer où se cachent les provirus génétiquement intacts et potentiellement réplicateurs compétents. N’oubliez pas que le travail avec les cellules infectées par le VIH peut être dangereux et que des précautions telles que le port d’équipement de protection individuelle approprié et le travail d’un laboratoire certifié doivent toujours être prises pendant l’exécution de cette procédure.

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Genetics

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