Name: Isolant et en incorporant des antennes de lumière de diatomée Cyclotella Meneghiniana dans les Liposomes avec thylakoïdes des lipides (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Découvrez l'isolation des protéines FCP de la diatomée Cyclotella meneghiniana et leur incorporation dans des liposomes mimant les thylakoïdes. Cette méthode permet d'étudier le transfert d'énergie d'excitation selon les variations ioniques et de pH.

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Nous remercions Rana Adeel Ahmad d’assistance dans la purification du PCF. Prof. Claudia Büchel est reconnu pour les discussions utiles et la lecture du manuscrit. Ce travail a été soutenu par la Fondation allemande de recherche à LD (DI1956-1/1) et la Fondation Humboldt pour une bourse de Feodor-Lynen à LD

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Liposomes FCP avec composition lipidique naturel offrent un outil pratique, simple et reproductible pour étudier les propriétés spectroscopiques in vitro. L’environnement lipidique dans les liposomes FCP ressemble à la situation au sein de la membrane des thylakoïdes, donnant lieu à des résultats expérimentaux qui sont plus proches des conditions naturelles.
Il y a plusieurs avantages de l’utilisation de c. meneghiniana comme système modèle pour antenne FCP. Il pousse relativ...

Organismes photosynthétiques tels que les diatomées doivent faire face aux conditions de lumière changeantes et répondre avec des mécanismes sophistiqués d’acclimatation qui soutiennent haut rendement photosynthétique et protègent contre la photooxydation dommages causés par la lumière excessive. Un important processus de lumière protectrice chez les eucaryotes photosynthétiques est la haute énergie trempe (qE) de la lumière absorbée qui apparaît comme la principale contribution à la trempe non photochimique (QNP) sous stress léger conditions1,2 ,3. Les complexes d’antenne récolte léger (LHC) sont impliqués dans la régulation des voies de transfert énergie excitation. En réponse à la forte luminosité induite par un faible pH dans le lumen du chloroplaste, les commutateurs de système d’antenne de la récolte à l’état de désactivation de la lumière. Cet état d’énergie dissipative protège les photosystèmes (PS) et autres complexes dans la membrane des thylakoïdes de photo-oxydation. Chez les eucaryotes photosynthétiques, le qE est généralement induit par deux facteurs1,2,3. L’un des facteurs sont la lumière spécialisée protéine qui répond au faible pHde récolte. La protéine de l’OSP induit le qE dans les plantes supérieures4. LhcSRs5, modulé par l’activité de l’OSP, induire le qE dans algues vertes6. Les diatomées possèdent des protéines de type Lhcx qui structurellement apparentés aux LHCSRs7,8,9,10.
Le deuxième facteur de qE est le cycle de la xanthophylle où caroténoïdes de l’antenne sont convertis sous une forme de protection photo par de-époxydation et rétablis par époxydation. Chez les plantes et les algues vertes, violaxanthine est converti en zéaxanthine. Dans les diatomées, diadinoxanthine est converti en diatoxanthine, qui ensuite est en corrélation avec la mesure de QNP11. La lumière de diatomées récolte antenne possède quelques particularités, bien qu’il soit évolutif relative aux plantes et algues LHCs. L’interrupteur de la lumière récolte photo-protection est extrêmement rapide et la capacité de QNP est plus élevé comparée aux plantes12. Cela pourrait être une des raisons pourquoi les diatomées sont très réussies dans des niches écologiques différentes dans la manière dont ils sont responsables de jusqu'à 45 % de la production primaire nette océanique13. Diatomées légers, systèmes de récolte sont donc un objet intéressant de recherche de la photosynthèse.
Diatomées, comme les espèces centrée sur Cyclotella meneghiniana, possèdent des thylakoïdes lumière intrinsèque systèmes nommés après les pigments qu’ils se lient - fucoxanthine, chlorophylle (chl) a et c, donc lumière PCF. récolte des protéines, tels que les FCP, sont intégré dans le système de membrane de thylakoid formée de plusieurs couches de membrane. Diatomées forment des bandes de trois thylakoïdes. Ce complexe situation, il est difficile de les étudier au niveau moléculaire dans la membrane des thylakoïdes. En outre, de nombreux composants contribuent à la régulation de la lumière récolte (voir ci-dessus). Donc, dans beaucoup d’approches, les complexes ont été isolés de la membrane à l’aide d’un détergent doux, tels que n-dodécyl-β-D-maltopyranoside (β-DDM), qui solubiliser la membrane, mais préserver les complexes du PCF. Beaucoup d’études spectroscopiques ont été effectuées à l’aide du PCF solubilisé pour enquêter sur le transfert d’énergie intramoléculaire14,15,16,17. Cependant, cette première approche était limitée, étant donné que le règlement du transfert d’énergie doit être excitonique interaction avec d’autres complexes d’antenne ou les photosystèmes. Par conséquent, ces sortes d’études ne peuvent être effectués avec solubilisée complexes parce que l’interaction entre les complexes est perdue.
Une caractéristique importante dans le règlement de l’antenne est « l'encombrement moléculaire » de l’antenne et les photosystèmes dans la membrane de thylakoid18. Auparavant, une approche simple a été réalisée pour simuler cet effet in vitro. Le détergent a été supprimé, ce qui conduit à l’agrégation aléatoire des complexes d’antenne. Bien que certaines données raisonnables a été obtenues par cette approche17,19, la suppression de détergent ne reflète pas la situation in vivo et a quelques limitations, étant donné que les complexes ne sont pas interagir dans leurs tertiaires réguliers structure.
L’utilisation de liposomes surmonte plusieurs des anciennes limites. La structure tertiaire est toujours intacte. La membrane du liposome fournit un environnement quasi natif pour les complexes d’antenne. La membrane sépare l’intérieur du liposome de l’environnement extérieur. Par ces moyens, liposomes offrent deux compartiments de réaction pour les études des gradients ioniques et pH aussi bien en ce qui concerne les processus de transport. En outre, les paramètres du système expérimental peuvent être contrôlés plus facilement pour les études dans la membrane des thylakoïdes. Liposomes se sont déjà avérées être un excellent outil pour l’étude des complexes de la photosynthèse. Une préoccupation majeure dans le passé était sur plante LHC où il a été testé l’effet de la composition lipidique altéré le LHC II20. Dans les autres approches, interaction protéine-protéine entre différents LHC II ont été étudiées21. En outre, certaines études chez les algues vertes ont été réalisées qui décrivent un regroupement spontané entre LHC22. Compte tenu de l’importance des diatomées pour les écosystèmes aquatiques, relativement peu d’études ont été réalisées avec des complexes de l’antenne de diatomées. Deux études ont analysé les complexes d’antenne de la centrée sur Cyclotella meneghiniana, où le regroupement de la FCP antenne23 et la réactivité du PCF aux gradients électrochimiques24 apparaissaient. Ainsi, les liposomes sont un excellent outil pour étudier les antennes de diatomées et de leur interaction et règlement dans des conditions presque natives. Les liposomes sont versatiles depuis plusieurs conditions telles que la composition lipidique, taille de liposome, densité de protéine et la phase aqueuse environnante peut être contrôlée. En outre, la méthode nécessite de faibles quantités d’échantillons. Le système expérimental est robuste et hautement reproductible. Le cloisonnement des liposomes permet pour l’étude de pH et gradients ioniques, qui sont d’importants facteurs dans la régulation des complexes d’antenne.
Nous décrivons ici l’isolement des complexes d’antenne du PCF de c. meneghiniana et leur incorporation dans les liposomes avec composition lipidique naturel thylakoïdes. Aussi, nous fournissent des données exemplaires pour la caractérisation spectroscopique du PCF solubilisée et comparez-les avec le PCF dans les liposomes. La méthode résume les connaissances et les protocoles normalisés obtenus des améliorations de Gundermann et Büchel 201223, Natali et coll. 201622et Ahmad et Dietzel 201724.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58017/58017fig1.jpg"> Figure 1 : représentation schématique du flux de travail. (1) fait référence au paragraphe 1, qui décrit la croissance cellulaire, perturbation et l’isolement des thylakoïdes avec post-séparation FCP sur des gradients de sucrose de densité ; M. c. -Cellules deCyclotella meneghiniana . (2) préparation du mélange de lipides naturels thylakoïdes (MGDG, corentin et SQDG) décrit au paragraphe 2 et la création des micelles de lipide-détergent avec octylglycoside (OG). Une taille définie lipide-micelle est obtenue par extrusion à l’aide de membranes d’un diamètre de pore définis. FCP et lipides-micelles sont unifiés à un lipide prédéfini : ratio de protéine et les détergents OG et β-DDM sont supprimés via contrôlée dialyse formant des protéoliposomes du PCF. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58017/58017fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

<table><tbody><tr><td>Flacons centrifugeurs de 500 ml centrifugeuse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>à grande vitesse</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bead Mill VI 2</td><td>Edmund-B&uuml ; hler (edmund-buehler.de)</td><td></td><td>version plus récente : Vibrogen-Zellm&uuml ; hle Vl 6</td></tr><tr><td>Silibeads S 400 & micro ; m</td><td>Sigmund-Lindner.com</td><td>5223-7</td><td></td></tr><tr><td>Silibeads S 1,-1,3 mm</td><td>Sigmund-Lindner.com</td><td>4504</td><td></td></tr><tr><td>Entonnoir filtrant VitraPOR - por1</td><td>ROBU GmbH</td><td>21121</td><td></td></tr><tr><td>flacons d’ultracentrifuagtion en polycarbonate (30 mL) pour T-865</td><td>Beranek Laborger&auml ; te (Laborgeraete-beranek.de)</td><td>314348</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifugeuse Discovery 90SE</td><td>Sorvall</td><td>n.a.rotor</td><td></td></tr> <tr><td>T 865</td><td>ThermoFisher Scientific (thermofisher.com)</td><td>51411</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer Cell Counter Chamber (améliorée)</td><td>Carl Roth Laborbedarf (Carlroth.com)</td><td>T729.1</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Mikroskop Primostar (7)</td><td>Optik-Pro (optik-pro.de)</td><td>51428</td><td></td></tr><tr><td>cuvettes en verre optique (6040-OG)</td><td>Hellma Analytics (hellma-analytics.com)</td><td>"6040-10-10"Spectrophotomètre</td><td></td></tr> <tr><td>UV-VIS V-630 (logiciel inclus</td>)<td>Jasco (jasco.de)</td><td>V-630</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodecyl-&beta ;-D-Maltopyranoside</td><td>ANATRACE (anatrace.com)</td><td>D310LA</td><td></td></tr><tr><td>Tubes Ultra-Clear 17 ml pour AH629</td><td>Beranek Laborger&auml ; Rotor te (Laborgeraete-beranek.de)</td><td>344061</td><td></td></tr><tr><td>AH629-17-mL</td><td>ThermoFisher Scientific (thermofisher.com)</td><td>54285</td><td></td></tr><tr><td>Membrane concentrator_Centriprep coupure 30 kDa</td><td>Millipore (merckmillipore.com)</td><td>4307</td><td></td></tr><tr><td>Biometra Minigel-Twin</td><td>Analytik Jena AG (analytik-jena.de)</td><td>846-010-100</td><td></td></tr><tr><td>Silver Stain Plus Kit</td><td>Bio-Rad (bio-rad.com)</td><td></td><td></td>1610449</tr><tr><td>feuille de calcul de bureau libre</td><td>La base de documents</td><td>https://de.libreoffice.org/download/libreoffice-still/</td><td></td></tr> <tr><td>cuvettes en verre spéciales pour la fluorescence (101-0S)</td><td>Hellma Analytics (hellma-analytics.com)</td><td>101-10-20</td><td></td></tr><tr><td>Spectrofluorimètre FP-6500 (avec logiciel)</td><td>Jasco (jasco.de)</td><td>FP-6500</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de chargement SDS Roti-Load</td><td>ROTH (carlroth.com)</td><td>K929.1</td><td></td></tr><tr><td>n-octyl &beta ;-D-glucopyranoside</td><td>ANATRACE (anatrace.com)</td><td>O311</td><td></td></tr><tr><td>Monogalactosyl Diaclyglycérol (MGDG)</td><td>Larodan AB (larodan.com)</td><td>59-1300</td><td>préparer une solution mère sous forme</td></tr><tr><td>Digalactosyl Diacylglycérol (DGDG)</td><td>Larodan AB (larodan.com)</td><td>59-1310</td><td>préparer une solution mère sous forme de chloroforme</td></tr><tr><td>Sulfoquinovosyl Diacylglycérol (SQDG)</td><td>Larodan AB (larodan.com)</td><td>59-1230</td><td>préparer une solution mère sous</td></tr> forme <tr><td>de chloroforme L-alpha-Phosphatidylglycérol (PG)</td><td>Larodan AB (larodan.com)</td><td>37-0150</td><td>préparer une solution mère sous forme</td></tr><tr><td>de chloroforme L-&alpha ;-Phosphatidylcholine</td><td>Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com)</td><td>P3782 SIGMA</td><td>faire une solution mère dans un</td></tr><tr><td>bain de sonicateur de chloroforme S-50TH</td><td>Sonicor (getmedonline.com</td> Mini-Extrudeuse <td>SONICOR-S-50TH</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Avanti Polar Lipids (Avanti.com)</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Nuleopore Membrane polycarbonate</td><td>Avanti Polar Lipids (Avanti.com)</td><td>610005</td><td></td></tr><tr><td>membrane de dialyse Visking 14 kDa cutoff</td><td>ROTH (carlroth.com)</td><td>0653.1</td><td>bouillir dans de l’eau distillée avant utilisation</td></tr><tr><td>Biobeads SM2 Adsorbant</td><td>Biorad (Bio-rad.com)</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>copolymère d’épichlorhydrine de saccharose - Ficoll 400</td><td>Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com)</td><td>F4375</td><td></td></tr><tr><td>Flacons d’ultracentrifuagtion en polycarbonate (2,7 mL) pour TFT 80.4</td><td>Beranek Laborger&auml ; te (Laborgeraete-beranek.de)</td><td>252150</td><td></td></tr><tr><td>rotor TFT 80.4</td><td>Millipore (merckmillipore.com)</td><td>54356</td><td></td></tr><tr><td>material listé par ordre d’apparition </td><td></td><td></td><td>Pour des instructions de sécurité spécifiques, veuillez consulter les fiches de sécurité et les manuels correspondants. Les matériaux et substances de laboratoire standard ne sont pas répertoriés.</td></tr></tbody></table>

isolant et en incorporant des antennes de lumière de diatomée cyclotella meneghiniana dans les liposomes avec thylakoïdes des lipides

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Le rendement photosynthétique des plantes, algues et diatomées dépend fortement de la régulation rapide et efficace de la récolte et l’énergie lumineuse des processus de transfert dans la membrane des thylakoïdes des chloroplastes. La lumière récolte antenne de diatomées, qu’on appelle la fucoxanthine chlorophylle a/c les protéines liant la (PCF), sont nécessaires pour l’absorption de la lumière et un transfert efficace de la réaction photosynthétique centres aussi bien en ce qui concerne la photo-protection contre la lumière excessive. Le commutateur entre ces deux fonctions est une question de longue date de la recherche. Bon nombre de ces études ont été réalisées avec PCF dans les micelles de détergent. Pour les études sur les interactions, les détergents, qui a conduit à une agrégation imprécise des complexes du PCF, ont été supprimées. Dans cette approche, il est difficile de distinguer les objets et données physiologiquement pertinentes. On trouvera donc plus de précieuses informations sur FCP et autre liés à la membrane de lumière récolte complexes par l’étude des interactions protéine-protéine, de transfert d’énergie et d’autres caractéristiques spectroscopiques si ils sont intégrés dans leur environnement natif de lipides. Le principal avantage est que les liposomes ont une taille définie et un ratio de lipides/protéines déterminées par laquelle l’étendue de la FCP clustering est contrôlée. En outre, changements dans la composition de pH et des ions qui régulent la lumière récolte in vivo peuvent facilement être simulées. Par rapport à la membrane des thylakoïdes, les liposomes sont plus homogène et moins complexe, qui le rend plus facile à obtenir et à comprendre les données spectroscopiques. Le protocole décrit la procédure d’isolement du PCF et purification, préparation de liposome et incorporation du PCF dans les liposomes avec composition lipidique naturel. Résulte d’une application typique sont donnés et discutés.

Le protocole décrit l’isolement de la fraction totale de FCP de Cyclotella meneghiniana et incorporation dans les liposomes avec composition lipidique native. L’isolement de thylakoïdes est hautement reproductible, mais le rendement de thylakoïdes peut-être changer. Le résultat est acceptable si plus de 50 % de tous les pigments sont récupérés à l’étape 1.1.4. Plus de 80 % est optimale.
La solubilisation des thylakoïdes...

Nous présentons ici un protocole visant à isoler des protéines de liaison d’a/c du chlorophylle fucoxanthine (PCF) de diatomées et de les incorporer dans des liposomes dont la composition lipidique naturel pour étudier le transfert de l’énergie d’excitation sur les changements de composition ionique.

Isolant et en incorporant des antennes de lumière de diatomée Cyclotella Meneghiniana dans les Liposomes avec thylakoïdes des lipides

The photosynthetic performance of plants, algae and diatoms strongly depends on the fast and efficient regulation of the light harvesting and energy ...

Cette méthode peut nous aider à comprendre des questions clés dans la recherche sur la photosynthèse, telles que la disparition de l’énergie lumineuse capturée et les complexes de collecte de lumière, sa cinétique et l’efficacité du transfert. Le principal avantage de cette technique est que les liposomes fournissent un compartiment membranaire ressemblant à l’état natif d’une membrane thylakoïde, ce qui permet d’étudier les changements d’ions et de pH pendant la photosynthèse. Pour commencer le protocole, centrifugez des cellules de C. meneghiniana préalablement préparées à 4 300 fois G dans un rotor pré-refroidi à quatre degrés Celsius avec des flacons de centrifugeuse de 500 millilitres pendant 15 minutes.Remettre en suspension le tampon d’homogénéisation des granulés de cellule en agitant et en pipetant. Transférez la suspension dans un seul tube en plastique approprié et limitez le volume final à 12 millilitres. Ensuite, pré-refroidissez le moulin à billes et l’équipement pendant environ 60 minutes.Remplissez le bécher de 50 millilitres jusqu’à 75 % avec un mélange de billes de verre et ajoutez la suspension cellulaire. Remuez-le avec une spatule ou une tige de verre et ajoute

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Isolant et en incorporant des antennes de lumière de diatomée Cyclotella Meneghiniana dans les Liposomes avec thylakoïdes des lipides

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