Name: Incorporation de ribonucléotide Experimentation : Strand spécifiques détection des ribonucléotides dans le génome de la levure et mutagénèse induite par la ribonucléotide de mesure (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Découvrez la détection spécifique des brins des ribonucléotides dans l'ADN de levure par électrophorèse sur gel alcalin et Southern blot. Cette méthode permet de quantifier l'incorporation et d'évaluer la mutagénèse induite.

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Nous remercions tous les membres actuels et anciens Kunkel Lab pour leur travail et les discussions relatives au protocole et réutiliser les données présentées ici. Ce travail a été soutenu par projet Z01 ES065070 à T.A.K. de la Division de la recherche intra-muros des National Institutes of Health (NIH), National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS).

1. alcaline hydrolyse et Strand spécifiques Southern Blot (Figure 1)
<ol><li>La croissance cellulaire et l’isolement d’ADN génomique<ol>
<li>Isoler l’ADN génomique de levure à l’aide d’une levure kit de purification d’ADN suivant les instructions du fabricant. Utilisez les cultures qui se trouvent dans la phase exponentielle de croissance entre (densité optique de 0,5) et 1. Resuspendre le culot d’ADN final dans 35 mL de 1 x tampon TE (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) de 1 mM).</li>
		<li>Ajouter 1 mL de 5 mg/mL RNase A dans l’ADN et incuber 30 min à 37 ° C.</li>
		<li>Précipiter l’ADN à l’aide de volumes 0,1 M 3 d’acétate de sodium (pH 5,2) et 2,5 volumes d’éthanol à 100 % pendant 20 minutes sur la glace.</li>
		<li>Centrifuger à 16 000 x g pendant 20 min à 4 ° C. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette.</li>
		<li>Laver le culot deux fois avec 500 mL d’éthanol à 70 %. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette.</li>
		<li>Sécher le culot sur banc et resuspendre dans 35 ml de 1 x tampon TE.</li>
		<li>Quantifier l’ADN à l’aide d’un fluorimètre (Table des matières) avec le dsDNA BR trousse.</li>
		<li>5 mg de l’ADN de chaque échantillon à l’aide de volumes 0,1 d’acétate de sodium 3M, volumes de pH 5,2 et 2.5 de 100 % de précipiter EtOH pour un volume total de 200 mL (Ajouter H2O, si nécessaire, d’autres 5 mg d’ADN est requise si le contrôle de gel neutre est nécessaire). Incuber sur glace pendant 20 min.</li>
		<li>Centrifuger à 16 000 x g pendant 20 min à 4 ° C. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette.</li>
		<li>Sécher le culot sur le banc. Remettre en suspension l’ADN en 14 mL d’H2O.</li>
	</ol></li>
	<li>Électrophorèse de gel et hydrolyse alcaline<ol>
<li>Ajouter 6 mL de 1 M KOH et incuber à 55 ° C pendant 2 h.</li>
		<li>Incuber les échantillons sur la glace pendant 5 min.</li>
		<li>Ajouter 4 mL de 6 x tampon alcalin chargement d’ADN : 300 mM KOH, 6 mM EDTA, pH 8,0, 18 % polysucrose (Table des matières), 0,15 % vert de bromocrésol et 0,25 % de xylène cyanol FF.</li>
		<li>Monter un gel alcalin qui se compose de 1 % d’agarose, 50 mM NaOH, EDTA 1 mM, pH 8,0. Utilisez un peigne qui permet pour 24 mL de l’échantillon d’ADN d’être chargé par couloir.</li>
		<li>Exécutez le gel à température ambiante dans 1 x tampon d’électrophorèse alcaline : 50 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH 8,0. Inclure un marqueur de taille d’ADN approprié.</li>
		<li>Tournez en bas des tubes brièvement et charger l’échantillon entier 24 mL dans le gel d’agarose alcaline. ELECTROPHORESE pendant 30 min à 30 V, suivie de 18-20 h à 10V.</li>
		<li>Neutraliser le gel pour les 2 incubations de 45 min chacun, à température ambiante en agitant doucement dans le tampon de neutralisation I: 1 M Tris-HCl, 1,5 M de NaCl.</li>
		<li>Colorer l’ADN en trempant le gel neutralisé dans 200 mL d’eau contenant une dilution au 1/10 000 de SYBR Gold tache pendant 2 h à température ambiante avec agitant doucement.</li>
		<li>Visualiser l’ADN à l’aide d’un Transilluminateur UV. Alcali-sensibilité accrue provoque l’apparition de petits fragments d’ADN, ce qui indique une densité plus élevée des ribonucléotides non réparés à l’ADN5.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfert du Sud<ol>
<li>Transfert de l’ADN du gel alcalin à la membrane en nylon chargé positivement par capillarité10. Un exemple de comment ce transfert peut être mis en place est prévu le Sambrook et Russell manuelle10.</li>
		<li>Faire tremper le gel alcalin pendant 15 min à température ambiante dans le tampon de transfert alcalin : 0,4 M NaOH, 1 M NaCl.</li>
		<li>Mouiller la membrane en nylon (coupée à la taille du gel) brièvement avec de l’eau et puis laissez tremper pendant 5 min dans un tampon de transfert alcaline.</li>
		<li>Mettre en place la plate-forme de transfert en retournant 3 béchers en verre (100 mL) dans un verre plat allant au four. Ce plat doit être légèrement supérieur à la taille du gel d’agarose. Mettre une plaque de verre au-dessus d’eux.</li>
		<li>Drapez 2 gros morceaux de papier pour chromatographie CHR 3 MM (coupé à la taille de la largeur du gel plus les bords les plus longs qui peuvent faire passer par-dessus les bords dans le réservoir tampon) sur la plaque de verre.</li>
		<li>Versez le tampon alcalin de transférer sur le papier pour chromatographie et moitié remplir le plat en verre. Adoucissez les bulles à l’aide d’une pipette de verre de 5 mL.</li>
		<li>Poser le gel d’agarose dessus, lisser à nouveau les bulles. Entourer toutes les arêtes du gel avec parafilm. Versez une petite quantité de tampon alcalin de transférer sur le gel.</li>
		<li>Placer la membrane en nylon préalablement trempé sur le dessus du gel. Adoucissez les bulles.</li>
		<li>Mouillée 2 morceaux de papier coupé à la taille du gel d’agarose. Les placer sur le dessus de la membrane et lisser toutes les bulles.</li>
		<li>Mettez une grande pile de serviettes en papier (coupe à une taille légèrement plus grande que le gel d’agarose) sur le dessus de la "sandwich" de transfert. Placer soigneusement une plaque de verre sur le dessus de l’essuie-tout. Ajoutez un objet pondéré en haut (un livre d’une masse de 400 g fonctionne bien).</li>
		<li>Laissez le transfert aller de l’avant une nuit à température ambiante.</li>
		<li>Soigneusement démonter la pile de transfert et tremper la membrane pendant 15 min à température ambiante dans la neutralisation tampon II : 0,5 M Tris-HCl, pH 7,2, 1 M NaCl.</li>
		<li>Crosslink l’ADN à la membrane en nylon chargé à l’aide d’une RETICULATION UV. Placer la membrane dans le court et utilisez le paramètre autocrosslink.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation de la sonde du Sud Note : L’approche décrite ici pour détecter les sites alcali-sensibles dans l’attaque naissante-versus en retard-brin de brin d’ADN est basé sur un protocole publié précédemment11. Pour notre expérience, sonder est effectué au gène URA3 journaliste qui a été inséré dans l’un des deux orientations (ou 1 ou OR2) adjacentes à l’origine de réplication ARS306 sur le chromosome III (Figure 3 a). La présence de sites sensibles alcalins dans l’ADN génomique de levure est un indicateur de l’incorporation de ribonucléotide, permettant l’utilisation de ribonucléotides comme les biomarqueurs de l’ADN polymérase activité12,13,14. Cette approche, en utilisant une séquence d’ADN adjacente à l’origine de ARS306 efficace de réplication, de cible devrait être prête à d’autres sites génomiques et les gènes cibles aussi bien.<ol>
<li>Segment de paires de PCR-amplifier un 520-base du gène URA3 reporter à l’aide de la paire d’amorces suivant : URA3-F1 (5´-GCTACATATAAGGAACGTGCTGC) et URA3-R1 (5´-CTTTGTCGCTCTTCGCAATGTC).</li>
		<li>Effectuer la réaction de PCR à l’aide de 10-20 ng d’ADN génomique de la levure comme modèle, 4 μL de chaque amorce (stock de 10 μM), 10 μL de 10 x Ex le tampon Taq (Mg2 + plus), 8 μL de mélange dNTP (2,5 mM), 0,5 μL d’Ex Taq DNA polymérase (5 U/μl) et ajuster le volume final de 100 μL, avec H2O.</li>
		<li>Exécutez le programme PCR suivant : 95 ° C pendant 5 min ; 30 cycles de 95 ° C pendant 1 min, 55 ° C pendant 1 min, 72 ° C pendant 2 min ; 72 ° C pendant 10 min et maintenez à 4 ° C.</li>
		<li>Purifier le produit de la PCR à l’aide d’un kit de purification de PCR et éluer l’ADN à l’aide de 50 mL de H2O. Maintenant, cela peut être utilisé comme modèle dans la réaction radiolabeling.</li>
		<li>Utiliser les amorces suivants pour volet spécifique radiomarquage : utilisation URA3-A (5´-CTCATCCTAGTCCTGTTGCTGCC) pour visualiser l’ADN qui recuits à sonde A. Cela correspond à l’ADN de brin principal naissant lorsque URA3 est OR2 et le tnascent retard brin ADN URA3 est dans ou 1. Utilisez URA3-B (5´-CAGTACCCTTAGTATATTCTCCAG) pour visualiser l’ADN naissante qui recuits à sonde B. Cette opération correspond à l’ADN de brin principal naissant lorsque URA3 est ou 1 et en retard de développement naissant brin ADN lorsque URA3 OR2 (Figure 3).<ol>
<li>Effectuer la réaction radiolabeling à l’aide de 10-20 ng amplifié URA3 fragment en tant que modèle ADN, 2 μL d’apprêt (stock de 10 μM), 5 μL de 10 x Ex tampon Taq (Mg2 + plus), 4 μL des dNTPs 2,5 mM (moins dCTP), 5 μL (50 μCi) d’une -32P-dCTP , 0,5 μL d’ExTaq ADN polymérase (5 U/μl) et ajuster le volume final à 50 μL, avec H2O. Run programme de ce qui suit pour radiomarquage : 94 ° C pendant 5 min ; 25 cycles de 94 ° C pendant 1 min, 55 ° C pendant 30 s, 72 ° C pendant 1 minute ; 72 ° C pendant 5 min et maintenez à 4 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Utilisez une colonne G-25 pour supprimer le marqueur radioactif non constituées en société. Avant d’ajouter l’échantillon radioactif, centrifuger la colonne pendant 1 min à 720 x g et POURRETIRERLEPISTONPNEUMATIQUEETREMPL tampon de pipetage. Charger le produit de réaction radiomarquées et centrifuger pendant 2 min à 720 x g pour Éluer la sonde.</li>
		<li>Incuber à 95 ° C pendant 5 min dénaturer la sonde immédiatement avant l’hybridation. Cool brièvement sur la glace.</li>
	</ol></li>
	<li>Hybridation Southern<ol>
<li>Rouler la membrane mouillée dans un tube d’hybridation et ajouter 25 mL de tampon d’hybridation fraîchement préparé : tampon de phosphate de sodium 0,5 M, pH 7,2, 7 % dodécylsulfate de sodium (SDS), 1 % d’albumine sérique bovine (BSA). Incuber à 65 ° C pendant 1 à 2 h avec rotation dans un four à hybridation.</li>
		<li>Avec précaution, décanter la solution et ajouter 25 mL de tampon d’hybridation plus la sonde radiomarquée. Incuber à 65 ° C pendant 16-18 h avec rotation.</li>
		<li>Décanter la solution dans un conteneur de déchets radioactif. Effectuer 5 lavages de 5 min à température ambiante avec un tampon phosphate de sodium Phosphate-SDS lavage Solution i : 40 mM, pH 7,2, chacun 5 % pH de SDS, 0,5 % de BSA, 1 mM EDTA, 8.0.</li>
		<li>Effectuer 2 lavages de 15 min chacun, à 65 ° C avec la Solution de lavage Phosphate-SDS II : tampon de phosphate de sodium de 40 mM, pH 7,2, 1 % SDS, 1 mM EDTA, pH 8,0.</li>
		<li>Retirer la membrane du tube hybridation à l’aide de la pince à épiler et placer dans un protecteur de manchon en plastique ouvert. Couvrir et exposer à une plaque d’imagerie. Essayer un certain nombre d’expositions différentes périodes allant de 4 h à 4D.</li>
		<li>Si nécessaire, dépouillez et re-sonde la tache à l’aide d’une sonde différente environ 3 - 4 fois. Pour enlever, incuber la membrane pendant 2 h à 65 ° C dans 25 mL d’un 50 % formamide, 2 x SSPE solution. Remarque : 20 x SSPE solution-mère : 3 M NaCl, 0,2 M NaH2PO4, EDTA de 0,02 M, pH 7,4.</li>
		<li>Décanter la solution dans un conteneur de déchets radioactif. Effectuer 2 lavages de 15 min chacun, à 65 ° C en Solution de lavage Phosphate-SDS II.</li>
		<li>Vérifiez la membrane avec un compteur Geiger et répétez le protocole décapage si signal reste.</li>
		<li>Effectuer avant l’hybridation et l’hybridation comme décrit ci-dessus.</li>
	</ol></li>
</ol>2. mesurer le taux de Mutation et de la spécificité dans les souches de S. cerevisiae
<ol><li>Préparer la culture cellulaire<ol>
<li>Ensemencer une seule colonie (levure saine cellules prend 2 ou 3 jours à 30 ° C à la forme correcte en taille de colonies), cultivée sur gélose YPD avec l’adénine 100 mg/mL à 5 mL de bouillon YPDA additionné d’adénine de 250 mg/mL (lorsqu’il s’agit de l’adénine est nécessaire uniquement si la souche utilisée est un auxotrophe adénine). Grandir dans un incubateur shaker ou sur un rotateur à 30 ° C jusqu'à ce que la culture devient saturé (36-48 h pour une souche sans un défaut de croissance sévère).</li>
		<li>Tournez en bas les cellules à ~ 2000 x g pendant 5 min.</li>
		<li>Jeter le surnageant et laver les cellules avec 5 mL d’eau stérile.</li>
		<li>Remettre en suspension les cellules dans 500 mL d’eau stérile.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dilution de la culture cellulaire et placage<ol>
<li>Pour les contrôles de non sélection, diluer les cellules dans une plaque à 96 puits par un facteur de 1 600 000 et plaque 100 mL de chaque culture dans une assiette (COM) complete.</li>
		<li>Pour sélectionner des mutants ura3 , ensemencer 100 mL de cellules non dilués sur une plaque de 5-FOA pour une souche de type sauvage (WT). Diluer les cellules en conséquence si le taux de mutation de la souche d’intérêt devrait être plus élevé que chez une souche WT.</li>
		<li>Pour sélectionner des mutants can1 , diluer les cellules 5 fois et ensemencer 100 mL sur une plaque contenant canavanine (CAN) pour une souche WT. Le facteur de dilution est de 0,5.</li>
		<li>Incuber les plaques à 30 ° C jusqu'à ce que la forme de colonies de levures. Pour les souches sans un défaut de croissance, 2 ou 3 jours suffisent généralement pour COM et peut les plaques et 3-5 jours pour plaques 5-FOA. Pour comparer les taux de mutation entre les différentes souches, il est préférable de choisir le jour même de la croissance à dénombrer les colonies. Stocker les plaques prêtes à être comptées dans la chambre froide (~ 4 ° C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calcul du taux de mutation spontanée<ol>
<li>Dénombrer les colonies visibles sur chaque plaque et prenez note du nombre de colonies</li>
		<li>Calculer le taux de mutation à l’aide de la formule de Drake : μ = f ÷ ln (μNt). f est la fréquence de mutation calculée par nombre de mutants divisé par le nombre de cellules dans la culture finale. NT est le nombre de cellules dans la culture finale et μ est le taux de mutation. Cette équation peut être résolue par une méthode itérative telle que la méthode de Newton-Raphson. Il existe d’autres méthodes d’estimateur, incluant le test de Lea et Coulson, pour calculer le taux de mutation15.</li>
		<li>Calculer l’intervalle de confiance en supposant distribution log-normale des taux utation d’isolats individuels. L’intervalle de confiance de 95 % est plus souvent utilisé.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analyse du spectre de mutation<ol>
<li>Prélever une colonie unique sur chaque 5-FOA ou peut sur plaque et rafraîchir sur une plaque YPDA.</li>
		<li>Effectuer la colonie PCR pour amplifier le gène URA3 ou CAN1 et séquence afin de détecter des mutations en utilisant les amorces suivants : URA3-F (5'-CGCATATGTGGTGTTGAAGAA-3') et URA3-R (5'-TGTGAGTTTAGTATACATGCA-3') pour les deux l’amplification par PCR et séquençage du gène URA3 bp 800 ; CAN1-F (5'-CTTCTACTCCGTCTGCTTTC-3') et CAN1-R (5'-CAGAGTTCTTCAGACTTC-3') pour l’amplification et CAN1-AR (5'-TGAAATGTGAAGGCAGCGTT-3'), CAN1-9R (5'-CCTGCAACACCAGTGATA-3'), CAN1-10R (5'-GAGGATGTAACAGGGATGAAT-3') et CAN1-BR ( 5'-CGGTGTATGACTTATGAGGG-3') pour le séquençage du gène rapporteur 1800 bp CAN1 .</li>
		<li>Pour effectuer la PCR sur colonie, remettre en suspension une seule colonie en 5 μL de H2O et utiliser 1 μL comme modèle. Ajouter 1 μl de chacune des amorces (stock de 5 μM), 2 μL de tampon de x KAPA2G 5 (Mg2 + plus), 0,5 μL de dNTP (2,5 mM), 0,5 μL de KAPA2G Fast ADN polymérase, 12 μL de H2O.</li>
		<li>Pour l’amplification du gène URA3 , exécutez le programme PCR suivant : 95 ° C pendant 5 min ; 5 cycles de 95 ° C pendant 10 s, 61 ° C pendant 15 s, 72 ° C pendant 30 s ; 35 cycles de 95 ° C pendant 10 s, 61 ° C pendant 15 s, 72 ° C pendant 30 s ; 72 ° C pendant 2 min et maintenez à 4 ° C. Pour l’amplification du gène CAN1 , exécutez le programme PCR suivant : 95 ° C pendant 5 min ; 5 cycles de 95 ° C pendant 10 s, 61 ° C pendant 15 s, 72 ° C pendant 45 s ; 35 cycles de 95 ° C pendant 10 s, 61 ° C pendant 15 s, 72 ° C pendant 45 s ; 72 ° C pendant 2 min et maintenez à 4 ° C.</li>
		<li>Aligner les résultats de séquençage d’une séquence de référence en utilisant un programme tel que DNASTAR Seqman Pro ou Sequencher pour identifier les mutations.</li>
		<li>Compiler les données des mutations de type (Figure 4) de la mutation ou mutation emplacement (Figure 5). Calculer les taux de mutation spécifique par la fréquence d’une mutation (le nombre d’événements observés divisé par le nombre de mutants séquencé) multiplié par le taux de mutation.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Nick McElhinny, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+correction+of+lagging-strand+replication+errors+made+by+DNA+polymerases+%7Balpha%7D+and+%7Bdelta%7D%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Acaddemy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Differential correction of lagging-strand replication errors made by DNA polymerases {alpha} and {delta}.</a> Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (49), 21070-21075 (2010).</li>
<li>Clark, A. B., Lujan, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mismatch+repair-independent+tandem+repeat+sequence+instability+resulting+from+ribonucleotide+incorporation+by+DNA+polymerase+epsilon%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Mismatch repair-independent tandem repeat sequence instability resulting from ribonucleotide incorporation by DNA polymerase epsilon.</a> DNA Repair (Amst). 10 (5), 476-482 (2011).</li>
<li>Lujan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mismatch+repair+balances+leading+and+lagging+strand+DNA+replication+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mismatch repair balances leading and lagging strand DNA replication fidelity.</a> PLoS Genetics. 8 (10), e1003016(2012).</li>
<li>Reijns, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+removal+of+ribonucleotides+from+DNA+is+essential+for+mammalian+genome+integrity+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Enzymatic removal of ribonucleotides from DNA is essential for mammalian genome integrity and development.</a> Cell. 149 (5), 1008-1022 (2012).</li>
<li>Lujan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+polymerase+fidelity+and+mismatch+repair+bias+genome+variation+and+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous polymerase fidelity and mismatch repair bias genome variation and composition.</a> Genome Research. 24 (11), 1751-1764 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous décrivons ici les protocoles des deux séries d’expériences qui sont fréquemment utilisés pour analyser quantitativement semi ribonucléotides constituées au cours de la réplication de l’ADN et les effets mutagènes des ribonucléotides non réparés. Bien que ces approches impliquent l’eucaryote modèle S. cerevisiae, ces techniques peuvent être facilement adaptés à d’autres microbes et eucaryotes supérieurs même.
De détection des ribonucléotides non réparés dans l’ADN à l’aide d’alcal...

Au cours de la réplication de l’ADN nucléaire eucaryote, ribonucléotides sont incorporées dans le génome de tous les trois principaux replicases de l’ADN, ADN polymérases (PPS) α, ε et δ1,2. Réparation par excision de RNase H2-dépendante ribonucléotide (RER3) supprime la plupart de ces ribonucléotides incorporés.
Un ribonucléotide dans l’ADN est sensible à l’hydrolyse, le 2' groupe hydroxyle de la portion de sucre peut attaquer la liaison phosphodiester adjacente, libérant une extrémité avec un 2' - 3' phosphate cyclique et l’autre avec une 5'-OH4. Conditions alcalines peuvent grandement accélérer cette réaction. Ainsi, l’hydrolyse des ribonucléotides embarqués durant l’incubation dans une solution basique provoque la fragmentation de l’ADN génomique, qui peut être visualisé par alcalin-agarose électrophorèse sur5. Cet ADN peut être transféré sur une membrane et sondé par Southern blot à l’aide des sondes de brin spécifiques qui permettent l’identification des sites alcali-sensibles causés par ribonucléotides incorporés dans le naissant conduisant ou en retard de développement-brin ADN, respectivement.
Dans les cellules de levure dépourvues d’activité RNase H2, enlèvement des ribonucléotides peut être lancée lorsque la topoisomérase I (Top1) pseudos l’ADN à la ribonucléotide incorporé6,7. Toutefois, lorsque Top1 s’attache sur le côté 3' de la ribonucléotide, cela génère 5'-OH et 2' - 3' phosphate cyclique ADN extrémités qui sont réfractaires aux RELIGACIÓN. Défaut de réparation ou transformation aberrante de ces « fins Sales » peut conduire à l’instabilité génomique. En outre, si l’incision survient dans une séquence d’ADN répétée, le processus de réparation peut conduire à des mutations de suppression. Ceci est particulièrement problématique pour les répétitions en tandem, où court destructions (d’entre deux et cinq paires de bases) sont couramment observés dans les cellules déficientes en RNase H2. Les effets délétères de Top1 dépendante, en l’absence de levure RNase H2 activité sont exacerbés dans un mutant ε ADN polymérase (pol2-M644G) promiscuous pour incorporation de ribonucléotide au cours de la synthèse du brin principal naissant.
Traitement des ribonucléotides ADN conduit à des mutations spontanées et ce mutagenèse peut être détectée en utilisant les gènes appropriés et en sélectionnant le changement phénotypique qui l’accompagne. Un test de fluctuation ou l’expérience de Luria et Delbrück est une des méthodes plus couramment utilisés pour mesurer le taux de mutation spontanée à l’aide de gènes de journaliste sélectionnable8,9. Chez les levures, les gènes URA3 et CAN1 peuvent servir de reporters dans un test de mutation directe, ce qui permet une détection de tous les types de mutations qui entraînent la perte de la fonction du gène. Le taux de mutation spontanée est estimé à la médiane de celle observée pour plusieurs cultures parallèles a commencé à partir des colonies individuelles sans mutations dans le gène rapporteur de cible. Une levure RNase H2-deficient souche tels que rnh201Δ a un taux modérément élevés de mutation spontanée dans l’ensemble qui est en grande partie dû à une incidence élevée de destructions bp 2-5 en tandem Répétez les séquences. Ainsi, pour caractériser complètement les effets mutagènes des ribonucléotides dans le génome, taux de mutations spécifiques doivent être déterminées. Dans ce cas, les gènes URA3 ou CAN1 peuvent être amplifiés et séquencés pour déterminer les types et les emplacements des mutations et des taux de mutation spécifique peuvent être calculées. Compilation des mutations identifiées chez plusieurs mutants URA3 ou CAN1 indépendants peut alors servir pour générer un spectre de mutation.

<table><tbody><tr>Milieu <td></td><td></td><td>YPD</td><td>20 g de dextrose, 20 g de peptone, 10 g d’extrait de levure, en H2O désionisé jusqu’à 1 L, ajouter 20 g de gélose Bacto pour milieu solide, autoclave.</td></tr><tr><td>Plaques</td><td></td><td></td> COM <td>1,3 g de mélange de chute SC, 1,7 g de base azotée de levure sans acides aminés ou (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g de dextrose, 20 g de gélose Bacto désionisée H2O jusqu’à 1 L. Ajuster le pH à 5,8. Autoclave et 30 &ndash ; 35 ml par assiette.</td></tr><tr><td>Plaques</td><td></td><td></td> CAN <td>1,3 g de poudre de chute SC-Ura, 1,7 g de base azotée de levure sans acides aminés ou (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g de dextrose, 20 g d’agar Bacto, 25 mg d’uracile et H2O jusqu’à 1 L. Autoclave pendant 15 min à 121 &deg ; C et refroidir à 56 °C. Ajouter 6 mL de solution de sulfate de canavanine à 1 % stérilisée par filtre.</td></tr><tr><td>5-FOA en plaques</td><td></td><td></td><td>1,3 g de poudre de chute SC-Ura, 1,7 g de base azotée de levure sans acides aminés ou (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g de dextrose, 20 g de gélose Bacto, 25 mg d’uracile et H2O jusqu’à 800 mL. Autoclave pendant 15 mins à 121 &deg ; C et refroidir à 60 °C. Ajouter 200 mL de solution de 5-FOA stérilisée par filtre à 0,5 %.</td></tr><tr><td>L-Canavanine</td><td>sulfate US Biological</td><td>C1050</td><td></td></tr><tr><td>5-FOA</td><td>US Biological</td><td>F5050</td><td></td></tr><tr><td>Tube</td><td></td><td></td> de culture en verre de 20 mL <td>N’importe quelle marque</td></tr><tr><td>Rotateur de culture en 30 &deg ; Incubateur</td><td></td><td></td><td>C L’incubateur Shaker peut être utilisé à la place</td></tr><tr><td>96 plaques</td><td></td><td></td> à fond rond <td>Stérile, n’importe quelle marque</td></tr><tr><td>Perles de verre de 3 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-312A</td><td>Autoclave avant utilisation Pipettes</td></tr><tr><td></td><td></td><td>à 12 canaux</td><td>N’importe quelle marque</td></tr><tr><td>Ex Taq DNA Polymérase</td><td>TaKaRa</td><td>RR001</td><td></td></tr><tr><td>Epicentre MasterPure Yeast DNA Kit de purification</td><td>Epicenter</td><td>MPY80200</td><td></td></tr><tr><td>3 M acétate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7899</td><td></td></tr><tr><td>Fluorimètre 100 % éthanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td>Modèle plus récent disponible</td></tr><tr><td>dsDNA BR Kit de dosage</td><td>Invitrogen</td><td>Q32850</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Dot Scientific Inc.</td><td></td><td></td>DSF10400</tr><tr><td>Vert bromocrésol</td><td>Eastman</td><td>6356</td><td></td></tr><tr><td>Xylène cyanol FF</td><td>International Technologies Inc.</td><td>72120</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl (pH 8,0)</td><td>Teknova</td><td>T5080</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>Transilluminateur</td><td></td><td></td><td></td>UV</tr><tr><td>Amersham Membrane nylon Hybond-N+</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN303B</td><td></td></tr><tr><td>3 MM CHR Papier de chromotographie</td><td>Whatman</td><td>3030-392</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Caledon</td><td>7560-1</td><td></td></tr><tr><td>Stratalinker 1800</td><td>Stratagene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>G-25 spin column</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tampon phosphate de sodium (pH 7,2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NaH2PO4 (S9638) ; Na2HPO4 (S9390)</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4522</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47671</td><td></td></tr><tr><td>Compteur</td><td></td><td></td><td></td> Geiger</tr></tbody></table>

incorporation de ribonucléotide experimentation : strand spécifiques détection des ribonucléotides dans le génome de la levure et mutagénèse induite par la ribonucléotide de mesure

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

La présence des ribonucléotides dans l’ADN nucléaire s’est avérée être une source d’instabilité génomique. La mesure de l’incorporation de ribonucléotide peut être évaluée par hydrolyse alcaline et électrophorèse sur gel que l’ARN est très sensible à l’hydrolyse en milieu basique. Ceci, en combinaison avec une analyse Southern peut servir à déterminer l’emplacement et le chapelet dans les ribonucléotides qui ont été incorporés. Toutefois, cette procédure est seulement semi-quantitative et peut-être pas assez sensible pour détecter de petits changements dans le contenu de ribonucléotide, bien que le volet spécifique Southern blot sonder améliore la sensibilité. Titre de l’un des plus frappants conséquences biologiques des ribonucléotides dans l’ADN, mutagenèse spontanée peut être analysée à l’aide d’un test de mutation vers l’avant. En utilisant les gènes appropriés, des mutations rares qui entraîne la perte de fonction peuvent être sélectionné et global et taux de mutation spécifique peuvent être mesurées en combinant les données des expériences de fluctuation avec le séquençage de l’ADN du gène rapporteur. L’essai de fluctuation est il y a lieu d’examiner un large éventail de processus mutagènes dans les antécédents génétiques spécifiques ou des conditions de croissance.

Traitement d’ADN génomique à l’alcali, suivi par électrophorèse sur gel alcalin permet une détection semi-quantitative de la fragmentation de l’ADN en raison de l’abondance des ribonucléotides stablement incorporés. La figure 2 montre les images de gel de levure ADN génomique traité avec ou sans KOH5. La variante M644L de Pol2, la sous-unité catalytique de la Polε, a réduit la capacité d’incorporer des ribonucléotides tandis que le mut...

Ribonucléotides sont parmi les plus abondantes nucléotides non-canoniques incorporés dans le génome au cours de la réplication de l’ADN nucléaire eucaryote. Si pas correctement supprimé, ribonucléotides peuvent provoquer de mutagenèse et dommages à l’ADN. Nous présentons ici deux approches expérimentales qui sont utilisés pour évaluer l’abondance de l’incorporation de ribonucléotide dans l’ADN et de ses effets mutagènes.

Incorporation de ribonucléotide Experimentation : Strand spécifiques détection des ribonucléotides dans le génome de la levure et mutagénèse induite par la ribonucléotide de mesure

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions telles que le nombre de ribonucléotides incorporés dans l’ADN naissant, principal et retardé du génome. Bien que cette méthode puisse fournir des informations quantitatives et qualitatives sur la densité des ribonucléotides dans le génome de la levure, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes tels que les génomes de mammifères. L’électrophorèse sur gel alcalin fournit une vue semi-quantitative de l’incorporation des ribonucléotides dans l’ensemble du génome et le transfert Southern spécifique au brin permet une plus grande sensibilité et une meilleure quantification à un locus génomique spécifique.Pour commencer cette procédure, ajoutez six microlitres d’hydroxyde de potassium molaire à chaque échantillon d’ADN génomique de levure fraîchement préparé et incubez à 55 degrés Celsius pendant deux heures. Après deux heures, incubez les échantillons sur de la glace pendant cinq minutes. Ajoutez ensuite à chaque échantillon quatre microlitres de 6-6 tampons de charge d’ADN alcalin.Coulez un gel alcalin composé d’un pour cent d’agarose, de 50 millimolaires d’hydroxyde de sodium et d’un millimolaire d’EDTA pH huit avec un pe

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Incorporation de ribonucléotide Experimentation : Strand spécifiques détection des ribonucléotides dans le génome de la levure et mutagénèse induite par la ribonucléotide de mesure (Vidéo) | JoVE Journal

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