Incorporation de ribonucléotide Experimentation : Strand spécifiques détection des ribonucléotides dans le génome de la levure et mutagénèse induite par la ribonucléotide de mesure

Cette méthode peut aider à répondre à des questions telles que le nombre de ribonucléotides incorporés dans l’ADN naissant, principal et retardé du génome. Bien que cette méthode puisse fournir des informations quantitatives et qualitatives sur la densité des ribonucléotides dans le génome de la levure, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes tels que les génomes de mammifères. L’électrophorèse sur gel alcalin fournit une vue semi-quantitative de l’incorporation des ribonucléotides dans l’ensemble du génome et le transfert Southern spécifique au brin permet une plus grande sensibilité et une meilleure quantification à un locus génomique spécifique.

Pour commencer cette procédure, ajoutez six microlitres d’hydroxyde de potassium molaire à chaque échantillon d’ADN génomique de levure fraîchement préparé et incubez à 55 degrés Celsius pendant deux heures. Après deux heures, incubez les échantillons sur de la glace pendant cinq minutes. Ajoutez ensuite à chaque échantillon quatre microlitres de 6-6 tampons de charge d’ADN alcalin.

Coulez un gel alcalin composé d’un pour cent d’agarose, de 50 millimolaires d’hydroxyde de sodium et d’un millimolaire d’EDTA pH huit avec un peigne qui permet de charger 24 microlitres d’échantillon d’ADN par voie. Faites tourner brièvement les tubes d’échantillons. Chargez les 24 microlitres de chaque échantillon dans le gel d’agarose alcalin.

Incluez un marqueur de taille d’ADN approprié. Électrophorèse à 30 volts pendant 30 minutes. Baissez ensuite la tension à 10 volts et électrophorèse pendant 18 à 20 heures.

Le lendemain, neutralisez le gel. Plongez le gel dans le tampon de neutralisation un et incubez à température ambiante en agitant doucement pendant 45 minutes. Remplacez le mélange de tampon de neutralisation par un tampon frais.

Et incubez encore 45 minutes. Pour colorer l’ADN, trempez le gel neutralisé dans 200 millilitres d’eau contenant une dilution de un à 10000 de colorant à l’or sybr à température ambiante avec une légère agitation pendant deux heures. Visualisez l’ADN à l’aide d’un transilluminateur UV.

L’ADN du gel alcalin sera transféré à une membrane de nylon chargée positivement par capillarité. Faites d’abord tremper le gel alcalin à température ambiante pendant 15 minutes dans un tampon de transfert alcalin. Ensuite, mouillez brièvement la membrane en nylon avec de l’eau et trempez-la dans un tampon de transfert alcalin pendant cinq minutes.

Installez la plate-forme de transfert en inversant trois béchers en verre de 100 millilitres dans un plat de cuisson en verre légèrement plus grand que la taille du gel d’agarose. Placez une plaque de verre sur les béchers en verre. Drapez deux grands morceaux de trois feuilles de papier de chromatographie MMCHR sur la plaque de verre.

Versez le tampon de transfert alcalin sur le papier de chromatographie et remplissez à moitié le plat en verre. Lissez les bulles à l’aide d’une pipette en verre de cinq millilitres. Placez le gel d’agarose sur le dessus.

Encore une fois, il s’agit de lisser les bulles. Entourez tous les bords du gel avec du parafilm. Versez une petite quantité de tampon de transfert alcalin sur le gel.

Placez la membrane en nylon pré-trempée sur le gel et lissez les bulles. Mettez deux morceaux de papier de chromatographie coupés à la taille du gel d’agarose. Placez-les sur le dessus de la membrane et lissez les bulles.

Placez une grande pile d’essuie-tout sur le sandwich de transfert et placez soigneusement une assiette en verre sur les essuie-tout. Ajoutez un objet lesté sur le dessus et laissez le transfert se poursuivre à température ambiante pendant la nuit. Le lendemain, démontez soigneusement la pile de transfert.

Faites tremper la membrane à température ambiante dans le tampon de neutralisation deux pendant 15 minutes. Réticulation de l’ADN à la membrane de nylon chargée à l’aide d’un réticulant UV. Utilisez le paramètre de liaison croisée automatique.

Avant de commencer la procédure d’hybridation, préparez la sonde radiomarquée comme décrit dans le protocole texte. Roulez la membrane mouillée dans un tube d’hybridation et ajoutez 25 millilitres de tampon d’hybridation fraîchement préparé. Incuber à 65 degrés Celsius avec rotation dans un four d’hybridation pendant une à deux heures.

Versez délicatement la solution et ajoutez 25 millilitres de tampon d’hybridation plus la sonde. Incuber à 65 degrés Celsius pendant 16 à 18 heures avec rotation. Ensuite, versez la solution dans un conteneur de déchets radioactifs.

Ajouter la solution de lavage de phosphate STS dans le tube d’hybridation et tourner à température ambiante pendant cinq minutes. De cette manière, effectuez cinq lavages de cinq minutes chacun avec une solution de lavage de phosphate STS. Après le cinquième lavage avec la solution de lavage au phosphate STS, lavez la membrane deux fois avec la solution de lavage au phosphate STS deux fois pendant 15 minutes, à chaque fois à 65 degrés Celsius avec rotation.

À l’aide d’une pince à épiler, retirez la membrane du tube d’hybridation et placez-la dans un protecteur de manchon en plastique ouvert. Couvrir et exposer à une plaque d’imagerie. Si nécessaire, dénudez et sondez à nouveau le tampon avec une sonde différente.

Pour décaper, couvrez la membrane avec 25 millilitres d’une solution de formamide 2XSSPE à 50 % et incubez à 65 degrés Celsius pendant deux heures. Versez la solution dans un récipient à déchets radioactifs. Ajoutez la solution de lavage de phosphate STS deux dans le tube d’hybridation et tournez à 65 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Vérifiez la membrane avec un compteur geiger pour confirmer l’absence de signal avant d’effectuer la préhybridation et l’hybridation comme démontré précédemment. Ces images de gel ont de l’ADN génomique de levure traité avec ou sans hydroxyde de potassium et montrent que les cellules dépourvues de RNH2 conservent plus de ribonucléotides dans le génome. La variante M644L de la polymérase 2 réduit la capacité d’incorporer des ribonucléotides tandis que le mutant M644G incorpore plus de ribonucléotides que la polymérase de type sauvage.

Un gel d’agarose alcalin peut être sondé davantage par une analyse par transfert de Southern spécifique au brin. Dans cet exemple, les sondes recuit sur le brin d’ADN principal naissant dans le gène rapporteur URA3 qui a été inséré près d’ARS306 dans deux orientations opposées. Les résultats représentatifs du transfert de Southern à l’aide des sondes spécifiques du brin principal naissant montrent un modèle de fragmentation de l’ADN causé par le clivage alcalin au niveau des ribonucléotides et de l’ADN des brins principaux naissants dans une souche de type sauvage et dans des souches exprimant les variantes des polymérases alpha, delta et epsilon qui sont de mœurs légères pour l’incorporation de ribonucléotides.

Ce graphique montre la quantification du signal radioactif par fraction du total dans chaque voie à partir du transfert sud. Lors de la tentative de la procédure, il est important de se rappeler de toujours utiliser de l’ADN fraîchement isolé à partir de cellules faciales de serrure. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la réparation de l’ADN pour quantifier la densité et le brin dans lequel les ribonucléotides ont été incorporés par les ADN polymérases réplicatives.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que le séquençage hydrolated end ou HydEn-seq, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que l’emplacement des ribonucléotides dans le génome. N’oubliez pas que travailler avec des matières radioactives peut être extrêmement dangereux et que des précautions doivent toujours être prises pour éviter de contaminer l’établi et l’équipement lors de l’exécution de cette procédure.