L’utilisation des splénocytes de souris afin d’évaluer les micro-organismes pathogènes associés un motif moléculaire Influence sur l’Expression génique horloge

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de l’immunologie et de la chronobiologie, telles que la façon dont les composants microbiens modifient l’horloge moléculaire. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle est facile à réaliser, que les effets des différents composants microbiens sur l’horloge moléculaire sont évalués et qu’elle est hautement reproductible. Pour commencer le protocole, préparez le milieu de culture en ajoutant du sérum fœtal bovin à l’IPRP 1640 jusqu’à une concentration finale de 10 %Préparez 10 millilitres de milieu de provocation pour chacun des PAMPS à tester dans des tubes de 50 millilitres en ajoutant le milieu de culture PAMP indiqué.

Vaporisez une trompe de souris préalablement préparée avec de l’éthanol à 70 % et essuyez-la avec une serviette en papier. Placez la souris sur le dos, légèrement inclinée sur son côté droit. Ensuite, coupez la fourrure à l’aide de ciseaux de dissection le long du côté gauche de la souris, à peu près à mi-chemin entre les pattes avant et arrière.

À l’aide d’une pince, saisissez le péritoine et faites soigneusement une incision sans endommager la rate. Retirez la rate à l’aide d’une pince et placez-la dans un tube stérile de 50 millilitres contenant environ 10 millilitres de milieu de culture sur de la glace. Transférez ensuite la rate avec deux millilitres de milieu de culture dans une petite boîte de Pétri stérile.

Homogénéiser la rate en la broyant entre la partie givrée de deux lames givrées stériles. Une fois complètement homogénéisés, pipetez les deux millilitres de milieu de culture contenant les splénocytes à travers une passoire en nylon de 40 microns dans un tube de 50 millilitres. Ajouter huit millilitres de milieu de culture froid dans chacun des tubes de 50 millilitres contenant les splénocytes, pour un volume total de 10 millilitres par tube.

Déterminez le nombre de cellules par millilitre à l’aide d’un hémocytomètre. Ajouter environ une fois 10 à la sixième cellule par puits à des plaques de culture à six puits. Après avoir ajouté les cellules, ajoutez trois millilitres de milieu de culture ou trois millilitres de milieu de provocation aux cellules.

Ensuite, incubez les plaques à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant trois heures. Grattez les cellules du fond du puits à l’aide d’une pointe de pipette de 1 000 microlitres fixée à une micropipette P1000. Avec la même pointe de pipette, transférez le milieu contenant les cellules dans un tube de 15 millilitres.

Granulez les cellules à 167 fois g pendant cinq minutes à température ambiante. Retirez le surnageant et lavez la pastille cellulaire avec cinq millilitres de PBS. Après avoir granulé les cellules une deuxième fois à 167 fois g pendant cinq minutes, retirez le surnageant et ajoutez 600 microlitres de tampon de lyse à la pastille cellulaire.

Isolez l’ARN des splénocytes à l’aide du kit d’extraction d’ARN conformément aux instructions du fabricant et effectuez la digestion facultative de l’ADN sur colonne. Synthétisez l’ADNc pour chacun des échantillons à l’aide du kit de transcription inverse selon les instructions du fabricant. Utilisez 10 microlitres d’ARN pour chacun des échantillons dans un volume de réaction total de 20 microlitres.

Extrayez l’ARNm de quelques échantillons de contrôle dans un tube de 0,5 millilitre pour préparer l’ADNc à utiliser pour la courbe standard lors de la réalisation d’une PCR quantitative. Ajouter 10 microlitres de Master Mix à transcriptase inverse 2X. À la fin de la transcription inverse, ajoutez 10 microlitres d’eau dans le tube de réaction, qui sert de concentration de départ dans la série de dilution pour la courbe standard.

Effectuez une série de dilutions dix fois en ajoutant 45 microlitres d’eau dans quatre tubes de 0,5 millilitre désignés 10 à moins un, 10 à moins deux, 10 à moins trois et 10 à moins quatre. Ajoutez cinq microlitres de la concentration de départ dans le deuxième tube, 10 à un moins, à l’aide d’un micropipeteur P20. Mélangez en pipetant de haut en bas plusieurs fois, puis transférez cinq microlitres du tube de 10 à moins un dans le tube désigné de 10 à moins deux et mélangez.

Transférez cinq microlitres à l’aide d’une micropipette P20 du tube de 10 à moins deux dans le tube désigné de 10 à moins trois et mélangez. Enfin, transférez cinq microlitres à l’aide d’une micropipette P20 du tube de 10 à moins trois dans le tube désigné de 10 à moins quatre et mélangez. Préparez la réaction de manière à ce qu’elle contienne 0,5 microlitre de sonde d’amorce, cinq microlitres de mélange maître d’expression génique, deux microlitres d’eau et 2,5 microlitres d’ADNc.

Pipetez les échantillons d’ARN dans une plaque qPCR à 96 puits. Incuber des tests de sonde d’amorce pour divers gènes d’horloge moléculaire et inclure un test pour un contrôle endogène, et le charger dans une machine qPCR pour déterminer la quantification relative des niveaux d’ARNm. Dans le dispositif expérimental, sélectionnez la quantification, la courbe standard relative et la chimie TaqMan.

Ensuite, modifiez le volume de réaction à 10 microlitres. Entrez les informations pertinentes dans le plan de plaque. La qPCR a été réalisée sur de l’ARN isolé pour évaluer les niveaux d’expression relatifs des gènes de l’horloge moléculaire, horloge, Per2, Dbp et Rev-erb alpha.

Après le test PAMP, les niveaux d’expression de l’horloge n’étaient pas significativement différents de ceux des cellules témoins. Les niveaux d’expression de Per2 étaient significativement élevés dans les cellules soumises au LPS et à la ODN1826 par rapport aux témoins non testés. Le LPS a été le seul PAMP à modifier l’expression alpha de Rev-erb, car les niveaux d’ARNm étaient significativement plus faibles que chez les témoins non contestés.

Des taux d’ARNm significativement plus faibles ont été observés pour Dbp après une provocation avec chacun des PAMP par rapport aux témoins. À la suite de cette procédure, des molécules autres que les PAMP peuvent être utilisées pour évaluer leur influence sur l’horloge moléculaire dans les splénocytes.