Extraction d’ADN de haut débit et le génotypage des larves de poisson zèbre 3dpf de découpage Fin

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine biomédical. Comme l’utilisation du poisson-zèbre pour générer des modèles génétiques de maladies. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une identification précoce des génotypes à l’aide d’une méthode simple à haut débit.

Bien que cette méthode puisse permettre des recherches approfondies à l’aide de modèles d’épilepsies génétiques de poisson-zèbre, elle peut également être appliquée à d’autres modèles de maladies génétiques et à tout type d’étude de mutation. En général, les individus qui ne connaissent pas cette méthode peuvent éprouver des difficultés, car la section de la nageoire larvaire doit être effectuée avec précision à l’intérieur de l’espace pigmentaire de la queue. Avant de commencer l’élagage des nageoires des larves de poisson-zèbre, préparez la surface de dissection.

Collez un morceau de ruban adhésif autoclave sur la surface intérieure d’un couvercle de boîte de Pétri de neuf centimètres et placez le couvercle sous un microscope stéréoscopique. Préparez une pointe de pipette P1000 pour accueillir une larve de trois dpf avec un minimum de stress, en coupant l’extrémité de la pointe de la pipette à un diamètre de deux millimètres. Placez trois à cinq jours après la fécondation, ou dpf, les larves de poisson-zèbre dans une boîte de Pétri et anesthésiez dans 1,5 millimoïne de tricaïne dans 1 milieu embryonnaire E3.

À l’aide de la micro-pipette P1000 modifiée, prélevez et anesthésiez la larve de poisson-zèbre et placez-la sur le ruban adhésif de l’autoclave positionné sur le couvercle de la boîte de Pétri. Retirez l’excès de solution de tricaïne autour de la larve. La zone doit être aussi sèche que possible pour réussir à sectionner et à ramasser la nageoire, mais encore humide pour assurer la survie.

Pour éviter les saignements et assurer la survie de la larve lors de la coupe des nageoires, la transsection doit se produire à l’intérieur de l’espace pigmentaire. Distal jusqu’à la limite de la circulation sanguine, comme indiqué sur cette image. En travaillant sous un stéréomicroscope, utilisez un micro-scalpel pour sectionner la nageoire caudale.

Pendant l’incision, appliquez une pression constante mais douce vers le bas pour éviter d’endommager la notochorde. Visualisez l’aileron sectionné au microscope et positionnez la pièce sur la pointe de la lame du micro-scalpel. Placez le micro-scalpel contenant l’aileron sur la surface d’un petit morceau de papier filtre.

En raison de la présence de mélanocytes dans le tissu transecté, la nageoire apparaît comme une petite tache noire. Pour garantir une extraction réussie de l’ADN, il est important qu’un point noir marquant l’emplacement de la nageoire soit observé sur le papier filtre avant de poursuivre le protocole. À l’aide de ciseaux et d’une pince à épiler, transférez le papier filtre contenant l’aileron dans un puits d’une plaque PCR de 96 puits contenant 25 microlitres d’une solution d’hydroxyde de sodium de 50 millimolaires.

Ensuite, préparez une plaque de culture tissulaire à fond plat de 96 puits, en numérotant les puits selon l’étiquette de la plaque PCR. À l’aide de la pipette P1000 modifiée, remplie de 200 microlitres de milieu embryonnaire e3 frais, prélevez soigneusement la larve de poisson-zèbre en exerçant une légère pression. Distribuez la larve dans la plaque de 96 puits dans le même numéro de puits que la plaque PCR.

Assurez-vous que le papier filtre contenant l’aileron est bien immergé dans la solution. Pour éviter la contamination croisée entre chaque coupe, nettoyez la lame du micro-scalpel et la pince à épiler en les trempant dans une solution à 70 % d’éthanol. Essuyez la lame avec un mouchoir en papier propre ou une lingette.

Lorsque toutes les larves ont été coupées, stockez-les dans la plaque à 96 puits à 28 degrés Celsius jusqu’à ce que leurs génotypes aient été identifiés. Commencez cette procédure en scellant la plaque PCR à 96 puits contenant les morceaux d’ailettes et en centrifugeant les échantillons à 1000 fois G pendant une minute. Pour vous assurer que tous les papiers filtres sont immergés dans la solution d’hydroxyde de sodium.

Pour la lyse tissulaire, chauffez les échantillons dans un thermocycleur à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. Suivi d’un refroidissement à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, ajoutez six microlitres de 500 millimolaires de tris-HCL pH8.0 à chaque échantillon.

Vortex les échantillons. Centrifugez brièvement la plaque à 1500 fois G pendant cinq minutes à température ambiante. Pour extraire l’ADN génomique à l’aide de cette méthode, coupez l’aileron comme démontré précédemment, mais ajoutez le papier filtre avec l’aileron coupé dans un puits d’une plaque PCR de 96 puits contenant 30 microlitres de résine chélatrice à 5 %.

Une fois que tous les morceaux d’ailettes ont été coupés, scellez la plaque PCR à 96 puits et centrifugez brièvement les échantillons pour vous assurer que tous les papiers filtres sont immergés avec la résine chélatante. Chauffez les échantillons dans un thermocycleur à 95 degrés Celsius pendant 15 minutes, puis refroidissez-les à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Centrifugez brièvement les échantillons pour granuler les billes de résine et obtenir l’ADN dans la suspension.

Un test PCR multiplex permettra de distinguer les mutants homozygotes, les hétérozygotes et les larves de type sauvage. Configurez la réaction PCR comme détaillé dans le protocole texte. Effectuez les réactions PCR dans un thermocycleur à 96 puits.

Préparez un gel d’agarose à 1 % dans un tampon de borate de sodium, coloré avec 1x gel rouge. Pour faciliter le processus, si possible, utilisez un système de gel compatible avec les pipettes multicanaux afin d’obtenir des capacités de débit plus élevées en réduisant le temps de chargement des échantillons. Faites fonctionner le gel dans 1 tampon de borate de sodium à 250 volts pendant 15 minutes.

Imagez le gel sous lumière ultraviolette pour permettre la discrimination des différents génotypes. Commencez ce test en préparant deux gels de polyacrylamide à 12 % à l’aide de la plaque d’espacement de 1,5 millimètre et des 15 peignes d’échantillons, comme décrit dans le protocole de texte. Utilisez un système d’électrophorèse vertical et 1x tampon TBE comme tampon de course.

Après avoir effectué la PCR comme décrit dans le protocole textuel, chauffez les produits PCR à 94 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis refroidissez-les à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Chargez 10 microlitres par échantillon de PCR et huit microlitres de marqueur de poids moléculaire. Faites fonctionner le gel à 150 volts pendant une heure, ou jusqu’à ce que le marqueur de poids moléculaire atteigne presque la ligne du pied de la plaque de verre.

Imagez le gel sous lumière ultraviolette pour permettre la discrimination des différents génotypes. Ce protocole a été utilisé pour génotyper la progéniture d’un croisement hétérozygote, dans lequel l’iléale mutant a une insertion de 5 paires de bases dans le premier exon d’enrobage du gène aldh7a1. Le résultat attendu de l’amplification par PCR des iléaux de type sauvage et mutants est un amplicon de 434 BP.

Une bande de 293 BP résulte de l’amplification de l’iléale mutant, et une bande de 195 BP est obtenue pour l’iléale de type sauvage. L’analyse des réactions PCR sur un gel de borate de sodium d’agarose à 1 % a permis d’identifier des génotypes de type sauvage dans les couloirs deux et six, des génotypes hétérozygotes dans les couloirs trois, quatre et cinq, et un génotype mutant homozygote dans le couloir un. Diverses mutations ont été génotypées par un test de fusion hétéroduplex.

Les iléales mutantes plpbpot101 et plpbpot102 du gène plpbp permettent chacune un décalage de cadre et un codon d’arrêt précoce. Après dénaturation et recuit, les fragments de PCR pour les animaux hétérozygotes contiendraient de l’ADN hétéroduplex et homoduplex qui sont facilement séparés et visualisés à l’aide d’électrophorèses sur gel de polyacrylamide. Des génotypes mutants hétérozygotes composés ont été identifiés dans les couloirs deux, quatre et huit, des génotypes hétérozygotes dans les couloirs trois, six, sept, neuf et dix, et un génotype de type sauvage dans le couloir cinq.

Une fois maîtrisé, le découpage des nageoires de 96 larves à l’aide de cette technique peut être effectué en moins d’une heure, s’il est effectué correctement. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, comme le regroupement de larves de poisson-zèbre du même génotype pour l’extraction de tissus, peuvent être effectuées et commandées pour répondre à des questions supplémentaires, telles que l’étude de biomarqueurs et des modèles de maladies. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à la recherche dans le domaine des modèles d’épilepsie métabolique pour explorer la physiologie du chemin de la maladie chez le poisson zèbre.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de génotyper correctement des larves de poisson-zèbre de trois jours par microdissection d’une nageoire caudale.