Imagerie tridimensionnelle à grande échelle de l’organisation cellulaire dans le néocortex de souris

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences telles que l’analyse de la structure et de la fonction du néocortex. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut révéler la structure tridimensionnelle à grande échelle du cerveau. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu du néocortex, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes nerveux tels que la moelle épinière.

Pour injecter le traceur dans le pont des souris adultes, prélevez d’abord un microlitre de la sous-unité B de la toxine cholérique marquée par fluorescence dans une seringue Hamilton de calibre 26. Placez une pompe d’injection sur la seringue, puis placez la seringue et la pompe sur le porte-outil d’un manipulateur sur un instrument stéréotaxique. Inclinez le manipulateur de 12 degrés vers l’arrière par rapport à l’axe vertical.

Ensuite, placez la souris sur l’instrument stéréotaxique. À l’aide d’une lame de rasoir, retirez ses poils pour éviter les infections. Coupez ensuite 10 millimètres du cuir chevelu de manière à ce que le bregma et le lambda soient visibles.

Administrer 0,1 millilitre de lidocaïne à 1 % à l’aide d’une pipette. Réglez l’angle de la tête en ajustant la position verticale de l’embouchure sur l’instrument stéréotaxique de manière à ce que le bregma et le lambda aient le même niveau Z. Ensuite, ajustez la position du manipulateur en le faisant glisser sur l’instrument stéréotaxique de manière à ce que l’extrémité de la seringue soit proche du bregma.

Enregistrez la position du manipulateur. Rétractez la seringue en déplaçant le porte-outil sur le manipulateur. Déplacez ensuite le manipulateur de 5,4 millimètres vers l’arrière et de 0,4 millimètres vers le côté.

Avancez la seringue de manière à ce que l’embout soit proche du point d’entrée sur le crâne, puis rétractez la seringue et marquez le point d’entrée. À la position marquée, percez un trou d’un diamètre d’environ un millimètre. Insérez l’embout de la seringue dans le trou de sorte que la profondeur de l’embout soit supérieure de 6,9 millimètres à celle mesurée au niveau du bregma.

Ensuite, injectez un microlitre de traceurs à l’aide de la pompe à 0,2 microlitre par minute. Après l’injection, retirez la seringue du cerveau. Si nécessaire, couvrez le cerveau exposé avec de petits fragments d’hémostat microfibrillaire et d’adhésif instantané.

Essuyez le cerveau exposé avec une solution saline pour prévenir l’infection et suturer le cuir chevelu. Retirez ensuite la souris de l’instrument stéréotaxique. Laissez la souris se remettre de l’anesthésie dans un incubateur à 30 degrés Celsius pendant environ une heure.

Ne laissez pas la souris sans surveillance jusqu’à ce qu’elle ait repris une conscience suffisante pour maintenir le décubitus sternal. Remettez la souris en compagnie d’autres animaux une fois qu’elle est complètement rétablie. Pour recueillir le tissu cérébral, coupez le cuir chevelu à l’aide d’une paire de ciseaux pour exposer le crâne.

Ensuite, coupez la ligne médiane du crâne exposé à l’aide d’une paire de ciseaux. Ensuite, retirez le crâne à l’aide d’une pince. S’il est nécessaire de marquer la position du bregma et du lambda, retirez d’abord un côté du crâne.

Insérez ensuite de fines aiguilles de tungstène dans le cerveau aux positions du bregma et du lambda, puis retirez le crâne restant. Par la suite, placez l’échantillon de cerveau sur la plateforme du vibratome. Coupez les sections jusqu’à 500 micromètres d’épaisseur dans du PBS à température ambiante.

Dans cette procédure, transférez les tranches dans un tube en plastique de cinq millilitres contenant quatre millilitres de solution de tartre S0. Ensuite, incubez-les pendant 12 heures en secouant doucement à 37 degrés Celsius. Après 12 heures, retirez la solution du tube à l’aide d’une pipette et ajoutez quatre millilitres de solution de tartre A2.

Incuber les tranches pendant 36 heures en secouant doucement à 37 degrés Celsius. Après 36 heures, retirez la solution du tube et ajoutez quatre millilitres de solution de tartre B4. Incuber les tranches pendant 24 heures en secouant doucement à 37 degrés Celsius.

Après 24 heures, retirez la solution du tube et ajoutez quatre millilitres de solution de tartre A2. Incuber les tranches pendant 12 heures en les secouant doucement à 37 degrés Celsius. Après 12 heures, retirez la solution du tube et ajoutez quatre millilitres de PBS.

Incuber les tranches pendant six heures en les secouant doucement à température ambiante. Par la suite, retirez délicatement les tranches dans un tube en plastique de deux millilitres. Incuber-les avec un anticorps primaire dans un millilitre de solution AB Scale pendant 48 à 72 heures à 37 degrés Celsius en les secouant doucement.

Ensuite, retirez délicatement les tranches dans un tube en plastique de cinq millilitres. Incuber-les dans quatre millilitres de solution AB Scale pendant deux heures deux fois à température ambiante en les secouant doucement. Ensuite, retirez délicatement les tranches dans un tube en plastique de deux millilitres.

Incuber avec un anticorps secondaire marqué par fluorescence dans un millilitre de solution AB Scale pendant 48 heures à 37 degrés Celsius en agitant doucement. Retirez délicatement les tranches dans un tube en plastique de cinq millilitres contenant quatre millilitres de la solution d’anticorps Scale et incubez les tranches pendant six heures en les secouant doucement à température ambiante. Retirez la solution et ajoutez quatre millilitres de la solution AB Scale et incubez les tranches pendant deux heures, deux fois en les secouant doucement à température ambiante.

Ensuite, retirez la solution et ajoutez quatre millilitres de PFA à 4 % et incubez les tranches pendant une heure en secouant doucement à température ambiante. Ensuite, retirez la solution et ajoutez quatre millilitres de PBS et incubez les tranches pendant une heure en les secouant doucement à température ambiante. Retirez la solution et ajoutez quatre millilitres de la solution Scale S4 et incubez les tranches pendant 12 heures en secouant doucement à 37 degrés Celsius.

Ensuite, placez l’entretoise sur une lame de verre et placez les tranches dans l’entretoise et plongez les tranches dans la solution Scale S4. Scellez l’intercalaire avec un verre de protection. Mettez de l’eau sur le verre de protection et imagez les coupes à l’aide d’une microscopie confocale ou à deux photons avec un objectif à immersion dans l’eau à longue distance de travail.

Dans cette étude, les neurones de projection corticale ont été marqués en vert par l’expression de tdTomato chez les souris transgéniques Tlx3-cre AI9 et les neurones de projection sous-cérébrale en magenta ont été visualisés en injectant le traceur rétrograde CTB488 dans le pont à l’âge de sept semaines. Il s’agit de la vue de dessus pour montrer les positions approximatives des zones corticales. Voici les vues obliques de la fluorescence CTB488 montrant les neurones de projection sous-cérébrale et la fluorescence tdTomato montrant les neurones de projection corticale et voici l’image fusionnée.

Les corps cellulaires des deux types de cellules étaient visibles sur un large éventail de zones cérébrales et les coupes optiques montraient des micro-colonnes périodiques. Cette image montre les corps cellulaires et les dendrites apicales des neurones de projection sous-cérébrale exprimant l’eGFP en coupe optique d’une souris Crym-eGFP et cette image montre les cellules exprimant la parvalbumine marquées en vert et les neurones de projection sous-cérébrale marqués en magenta en injectant CTB488 dans les pons d’une souris C57 Black 6 par la méthode de l’échelle d’anticorps. Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme le traitement d’images 3D peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la caractérisation quantitative de l’organisation cérébrale.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie corticale pour explorer une nouvelle organisation modulaire dans le cerveau de la souris.