High-throughput Identification des séquences régulatrices du gène à l’aide de prochaine génération séquençage du Chromosome circulaire Conformation Capture (4C-seq)

Cette méthode peut répondre à des questions clés dans le domaine de la régulation transcriptionnelle, telles que le rôle des interactions chromatine. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit une capture relativement impartiale des interactions pour un lieu d’intérêt. Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu des interactions des promoteurs enhancer, elle peut également être appliquée pour identifier d’autres types d’interactions chromatine.

Généralement, les personnes nouvelles à cette méthode auront du mal parce qu’il faut plusieurs jours pour le protocole, et la conception de l’amorce nécessite essais et erreurs et l’orientation de l’amorce atypique. Pour préserver les interactions chromatineuses dans les cellules de choix, croisez-les en ajoutant 9,5 millilitres de formaldéhyde de qualité microscopie électronique de 1 % dans le PBS pour 10 millions de cellules. Incuber les cellules tout en berçant pendant 10 minutes à température ambiante.

Transférer les tubes de réaction dans la glace pour étancher la réaction de liaison croisée et ajouter de la glycine molaire froide à une concentration finale de 0,125 molaire et mélanger par inversion douce. Après centrifugage et lavage des cellules selon le protocole du texte, suspendre à nouveau la pastille dans 125 microlitres de cinq millimolaires EDTA avec 0,5% SDS et un inhibiteur de la protéase X. Incuber la suspension cellulaire sur la glace pendant 10 minutes.

Pour s’assurer que la lyse cellulaire est complète, mélangez six microlitres des cellules avec six microlitres de bleu trypan sur une lame de microscope et couvrez avec un glissement de couverture. Visualisez-le au microscope pour voir l’intérieur des cellules lysées bleues et blanches. Pour la première restriction de digestion ajouter 30 microlitres de 10 X tampon enzyme de restriction, et 27 microlitres de 20%Triton X-100 à la suspension cellulaire et ajuster le volume total à 300 microlitres avec de l’eau.

Retirez un aliquot de 15 microlitres et rangez-les à quatre degrés Celsius sous forme de commande non digérée. Au mélange de réaction restant ajouter 200 unit enzyme de restriction un. Incuber toute la nuit à la température appropriée pour l’enzyme dans un bloc chauffant secouant avec agitation de 900 RPM.

Le lendemain, ajouter 200 unités supplémentaires de l’enzyme et poursuivre cette incubation pendant la nuit. Retirer un aliquot de 15 microlitres et le conserver à quatre degrés Celsius sous forme de contrôle digéré. Pour déterminer l’efficacité de digestion ajouter 82,5 microlitres de 10 millimolaire Tris-HCl, pH 7,5, à chaque contrôle non digéré et digéré.

Ajouter 2,5 microlitres de proteinase K et incuber pendant une heure à 65 degrés Celsius pour inverser la liaison entre le formaldéhyde et le formaldéhyde. Pour isoler l’ADN digéré, ajouter 100 microlitres de chloroforme phénol au tube. Mélanger par plusieurs inversions rapides pour éliminer la contamination par les protéines résiduelles.

Centrifugeuse à 16 100 G à température ambiante pendant cinq minutes. Après centrifugation, transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube. Ajouter l’acétate de sodium, le glycogène et 100 % d’éthanol au tube et mélanger délicatement par inversion.

Incuber à moins 80 degrés Celsius pendant une heure pour précipiter l’ADN. Centrifuger le tube à 16,100 G à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Retirer le supernatant, puis ajouter 500 microlitres de 70% d’éthanol pour laver la pastille d’ADN.

Centrifugeuse à 16 100 G à température ambiante pendant cinq minutes. Après avoir enlevé l’air supernatant sécher la pastille à température ambiante pendant deux minutes pour enlever l’éthanol résiduel. Suspendre à nouveau la pastille séchée dans 50 microlitres d’eau sans nucléase et procéder à déterminer l’efficacité de digestion par QPCR tel que décrit dans le protocole de texte.

Pour se préparer à la ligature, chauffer et activer l’enzyme de restriction en incubant le tube pendant 20 minutes à 65 degrés Celsius. Transférer ensuite le contenu du tube dans un tube conique de 50 millilitres et ajouter de l’eau sans nucléase, un tampon de ligase de 10 X et une ligase d’ADN T4. Mélanger délicatement en tourbillonnant et incuber toute la nuit à 16 degrés Celsius et procéder comme décrit dans le protocole texte.

Pour inverser la liaison croisée ajouter 15 microlitres de proteinase K et incuber pendant la nuit à 65 degrés Celsius. Le lendemain, ajouter 30 microlitres de RNase A, et incuber à 45 minutes à 37 degrés Celsius. Pour continuer avec l’isolement de chromatine, ajoutez sept millilitres de chloroforme de phénol et mélangez par plusieurs inversions rapides.

Centrifuger le tube à 3300 G à température ambiante pendant 15 minutes. Après centrifugation, transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube de 50 millilitres et ajouter de l’eau sans nucléase, trois acétate de sodium molaire, du glycogène et 100 % d’éthanol. Mélanger le contenu et incuber à 80 degrés Celsius négatif pendant une heure.

Après incubation, centrifuger le tube à 3900 G à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Retirer le supernatant, puis laver la pastille avec 10 millilitres de glace froide 70% éthanol. Centrifugeuse à 3300 G à 4 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Retirer le surnatant et sécher brièvement la pastille à température ambiante. Dissoudre la pastille en 150 microlitres de 10 millimolaire Tris-HCl pH 7,5 à 37 degrés Celsius. Stockez à 20 degrés Celsius négatif ou continuez avec la digestion de deuxième restriction, la ligature, et la purification d’ADN comme décrit dans le protocole de texte.

Après la purification de l’ADN, effectuez QPCR à l’aide d’amorces PCR inverses et de dyes cyber et ROX pour déterminer le nombre de cycles d’amplification pour l’amplification inverse du PCR des séquences d’interaction inconnues décrites dans le texte. Pour préparer l’ADN au séquençage, coupez les séquences d’appâts avec une troisième digestion de restriction en digérant un microgramme de produit purifié de PCR inverse ainsi qu’un moniteur d’enzyme de restriction. Exécutez l’enzyme de restriction digérée, ou moniteur RE, sur un gel d’agarose d’une concentration appropriée pour les fragments prévus.

Une fois que l’efficacité de digestion a été déterminée par l’électrophoresis de gel, continuez avec la purification inverse de produit de PCR et la préparation de la bibliothèque de séquençage, comme décrit dans le protocole de texte. La troisième digestion de restriction est importante dans ce protocole pour le séquençage de prochaine génération de la capture circulaire de confirmation de chromosome. Cette digestion réduit les séquences d’appâts qui peuvent faciliter l’identification des attractions de chromatine.

L’électrophoresis de gel d’Agarose du moniteur digéré de RE a indiqué la digestion suffisante du produit inverse de PCR digéré en parallèle. Après avoir terminé quatre lectures de séquençage C ont été taillées et cartographiées au génome de référence humaine hg38, à l’aide d’un logiciel BWA. La majorité des lectures s’alignent sur les sites de restriction HindiIII ou CviQ1I adjacents aux sites hindiIII comme prévu.

Tout en essayant cette procédure, il est important de s’assurer que vos cellules sont lysées et la chromatine est suffisamment digérée. Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme la précipitation immuno chromatine ou CHIP, peuvent être effectuées afin de répondre à d’autres questions telles que l’identification des facteurs de transcription impliqués dans les interactions chromatine. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de la chromatine pour explorer les réseaux de régulation physique.