Toluidine bleu coloration des Sections enrobées dans la résine pour l’évaluation de la morphologie des nerfs périphériques

Cette méthode pourrait aider à répondre à des questions clés dans les domaines des lésions et de la régénération des nerfs périphériques, telles que la morphométrie d’un nerf périphérique, combien d’axones sont présents, quel est l’état de myélinisation et y a-t-il du tissu fibreux présent ? Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de visualiser à haute résolution les caractéristiques nerveuses. Commencez par placer un rat anesthésié en position couchée sur le dessus d’un tapis de dissection.

Placez un cône nasal pour maintenir l’anesthésie avec 1-2 % d’isoflurane. Pour assurer une profondeur d’anesthésie adéquate, testez les animaux pour le retrait de la pédale et les réflexes palpébraux des pattes arrière. Une fois qu’une profondeur d’anesthésie appropriée est atteinte, rasez les poils des membres postérieurs et stérilisez les zones rasées avec de l’éthanol à 70 %.

Palpez le fémur pour identifier l’emplacement approprié pour l’incision. Le fémur est situé juste à proximité du segment le plus accessible du nerf sciatique. Après avoir fait une incision de deux à trois centimètres dans la peau le long du membre postérieur, du genou jusqu’au grand trochanter, localisez le plan entre le muscle biceps fémoral et le muscle grand fessier.

Ensuite, utilisez des ciseaux de microdissection pour séparer le fascia sous-jacent et exposer deux à trois centimètres du nerf sciatique sous-jacent. Utilisez un écarteur pour élargir l’espace entre les deux muscles. À l’aide d’une pince fine et de ciseaux à iris, séparez soigneusement le nerf du tissu conjonctif environnant, en prenant grand soin de ne pas comprimer ou couper le nerf.

Ensuite, couvrez le nerf exposé avec le fixateur de Trump et laissez reposer pendant 10 minutes. Si nécessaire, placez de la gaze sous la patte arrière pour améliorer l’angle afin d’ajouter plus de fixateur dans la cavité. Retirez le fixateur après 10 minutes et répétez cette étape deux fois de plus.

Sous le microscope de dissection, coupez le nerf sciatique des deux côtés à l’aide de ciseaux de dissection fins, en veillant à ne pas étirer ou pincer le nerf. Mettez immédiatement les sections nerveuses dans des tubes de 15 ml contenant le fixateur de Trump et fixez-les à quatre degrés Celsius pendant une semaine, en changeant le fixateur toutes les 48 heures. Après la fixation, retirez soigneusement toute graisse et tissu conjonctif restants du nerf et utilisez un scalpel bien aiguisé pour couper le nerf en segments d’environ cinq millimètres de long.

Les segments nerveux peuvent être séparés en différents tubes étiquetés. Immergez les segments nerveux dans du tétroxyde d’osmium à 2 % fraîchement préparé pendant deux heures. À l’aide d’un kit d’enrobage époxy, préparez le mélange d’enrobage final.

Mélangez le milieu d’enrobage époxy avec la solution DDSA et mélangez le milieu d’enrobage époxy avec la solution NMA. Mélangez les deux solutions pendant au moins 20 minutes avec un agitateur magnétique. Immédiatement avant l’utilisation, combinez le DPM de l’accélérateur à la solution B, puis combinez-le avec la solution A de sorte que la proportion finale de l’accélérateur soit comprise entre un virgule cinq et 2 % du volume total.

Transférez les segments nerveux dans des tubes de cinq millilitres et après le lavage avec du PBS, commencez le processus de déshydratation en remplaçant le PBS par des concentrations croissantes d’acétone et d’eau distillée pendant 10 minutes chacun, puis dans 100 % d’acétone trois fois pendant 10 minutes chacun. Une étape critique est la déshydratation des tissus. L’eau et la résine n’interagiront pas, de sorte que l’eau restant dans le tissu ne sera pas infiltrée par la résine, laissant des trous dans la section dépourvus de qualités histologiques.

Pour l’infiltration de résine, placez d’abord les segments nerveux dans un mélange individuel de mélange d’enrobage et de 100 % d’acétone pendant 30 minutes. Après 30 minutes, transférez les segments dans un mélange deux à un de mélange d’enrobage et de 100 % d’acétone pendant 30 minutes. Placez les segments nerveux dans des moules d’enrobage en caoutchouc de silicone et ajoutez doucement la résine sur les nerfs, en veillant à couvrir tout le segment nerveux tout en évitant les bulles d’air.

Laissez la résine polymériser à 60 degrés Celsius pendant la nuit. Placez un bloc de résine avec nerf intégré dans le support d’ultramicrotome avec le côté trapézoïdal vers le haut. Pendant l’observation à travers l’ultramicrotome, utilisez une lame à un seul tranchant pour couper l’excès de résine entourant le tissu nerveux.

Ne pas pénétrer la surface longitudinale du segment nerveux qui est reconnaissable à sa coloration foncée par le tétroxyde d’osmium. Avec un couteau en verre ordinaire sur l’ultramicrotome, faites plusieurs sections transversales pour exposer une surface de section transversale uniforme du nerf. Une fois cela fait, passez à un couteau en verre avec le bateau rempli d’eau distillée à température ambiante et ajustez l’ultramicrotome à un à deux microns pour couper des sections minces.

Utilisez une boucle métallique pour transférer des sections minces flottantes du bateau à couteaux en verre à une goutte d’eau déminéralisée sur une lame de verre. Une autre étape critique est lors du transfert de la section mince du couteau en verre à la glissière. Ces lames fines sont très fragiles et peuvent se casser ou se plier.

Après la section, séchez les sections sur les lames en passant une lame sur une flamme plusieurs fois, en veillant à ne pas surchauffer les sections. Les lames peuvent être stockées à température ambiante pendant plusieurs jours si elles ne sont pas immédiatement colorées au bleu de toluidine. Pour colorer les sections nerveuses, utilisez une pipette en plastique ou un micropipeteur pour ajouter une goutte de solution de bleu de toluidine sur le dessus des sections nerveuses.

Après 20 à 30 secondes, rincez tout l’excès de solution de bleu de toluidine en trempant doucement les lames dans un bocal d’eau déminéralisée, en répétant trois à quatre fois jusqu’à ce que les sections soient claires. Faites sécher les lames pendant au moins 15 minutes à 60 degrés Celsius ou toute la nuit à température ambiante. Après séchage, ajoutez un support de montage régulier et recouvrez les sections d’une lamelle.

Enfin, examinez les sections montées au microscope optique. Un objectif à immersion dans l’huile 100X est recommandé pour des images détaillées afin de calculer les rapports g. Des coupes de nerf sciatique intégrées dans un milieu de résine et colorées au bleu de toluidine ont montré des images claires avec une résolution optimale à l’augmentation du grossissement de 10X à 20X, 40X et 60X.

Cette méthode préserve la structure nerveuse et permet une imagerie à haute résolution et à fort grossissement qui facilite la mesure de plusieurs paramètres tels que le rapport g, qui est le rapport entre le diamètre de l’axone, indiqué par la flèche étiquetée B, et le diamètre total de la fibre, étiqueté A.Une variété de facteurs peuvent conduire à des sections nerveuses périphériques moins qu’optimales, y compris la présence de fissures dans la section en raison d’une mauvaise manipulation du nerf. Des trous peuvent également se produire dans la section en raison d’une déshydratation insuffisante. Une autre erreur possible dans la procédure est le pliage des sections, qui peut être corrigée en utilisant des boucles d’inoculation pour le transfert de section sur la lame de verre.

À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, comme la quantification des axones, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires telles que : quel est le degré de régénération d’un nerf régénératif ? Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’obtenir des sections de nerfs périphériques d’un à deux microns pour évaluer la morphométrie nerveuse.