Name: Toluidine bleu coloration des Sections enrobées dans la résine pour l’évaluation de la morphologie des nerfs périphériques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Découvrez la coloration au bleu de toluidine pour l'évaluation de la morphologie des nerfs périphériques chez le rat. Cette méthode histologique permet une visualisation haute résolution des axones et de la myélinisation.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Les auteurs désirent thankthe Jenkins Microscopy Facility à l’Université du Wyoming pour leur aide et les membres du laboratoire Bushman, Kelly Roballo, Hayden vrai, Wupu Osimanjiang et Philippe Dhunghana, pour l’assistance au soin des animaux. Cette publication a été rendue possible par une sentence de développement institutionnel (IDeA) de la National Institute of General Medical Sciences, de la National Institutes of Health sous Grant # 2P20GM103432.

Rats Sprague Dawley adultes ont été utilisées dans ce projet et toutes les procédures ont été approuvées par le Comité de l’utilisation et le soin des animaux institutionnels Université du Wyoming.
1. chirurgie et dans la Fixation du nerf Vivo
Remarque : Les informations sur le fournisseur pour tous les matériaux et équipements utilisés dans le présent protocole sont répertoriés dans la Table des matières.
NOTE : In vivo le fixation de nerf sert à préserver les tissus et réduire la dégradation structurelle qui peut survenir entre le moment de la mort et collection des nerfs. Fixation du tissu in vivo est une pratique courante pour la préparation des tissus du système nerveux pour l’histologie, où la perfusion est souvent un précurseur à cela. Le placement et la taille des nerfs périphériques autorisés pour fixation sur place. Nous ne recommandons pas de collection et la fixation des tissus après l’euthanasie en raison des risques de dégradation des tissus.
<ol><li>Préparer le rat pour l’anesthésie générale en le plaçant dans une chambre à induction avec 2-3 % isoflurane, puis placez le rat anesthésié en position couchée sur le dessus d’un tapis de dissection et maintenir à 1-2 % d’isoflurane via coiffe anesthésique. Afin d’assurer une profondeur adéquate de l’anesthésie, tester les animaux pour pédale retrait sur les pattes postérieures et vérifier l’absence de réflexes palpébrales dans les yeux en touchant le canthus médial de le œil. Remarque : L’injection intrapéritonéale de la kétamine est une alternative couramment utilisée pour inhalation isoflurane.</li>
	<li>Pour exposer le nerf sciatique, se raser les cheveux de la hind limb(s) et nettoyer les zones rasées avec l’éthanol à 70 %. Avec un scalpel ou des ciseaux, faire une incision de 2 à 3 cm dans la peau le long du membre postérieur du genou jusqu'à la grand trochanter, où palpation du fémur utilisant le scalpel stérile pour s’assurer que l’emplacement de l’incision. Le fémur se trouve proximale par rapport au segment plus accessible du nerf sciatique. Même s’il s’agit d’une chirurgie sans survie, maintenir les techniques stériles.</li>
	<li>Après avoir fait l’incision cutanée, repérer le plan entre le muscle biceps fémoral et le muscle grand fessier et à l’aide de ciseaux de microdissection séparer l’aponévrose sous-jacente et exposer les 2-3 cm du nerf sciatique soulignement. Pour exposer une section libre du nerf sciatique, utiliser un enrouleur à élargir le fossé entre les deux muscles (Figure 1 a). Avec une pince fine et ciseaux iris, soigneusement séparer le nerf entourant les tissus conjonctifs, prenant grand soin de ne pas compresser ou couper le nerf.</li>
	<li>Ajouter le fixateur de Trump suffisante (4 % de formaldéhyde, glutaraldéhyde à 1 % dans du PBS 1 x (tamponné phosphate salin) avec 1,16 g de NaH2PO4· H2O / 100 mL) dans la cavité contenant le nerf exposé pour couvrir le nerf et laisser reposer pendant 10 min. Si nécessaire, lieu gaze sous la postérieur des jambes pour améliorer l’angle afin que le fixateur plus peut être ajouté dans la cavité. Retirez le fixateur après 10 min et répéter cette étape deux fois plus.</li>
	<li>À l’aide d’un microscope à dissection, couper le nerf des deux côtés à l’aide de ciseaux de dissection fine, faire attention à ne pas étirer ou pincer le nerf sciatique et mettre immédiatement les sections nerveuses dans des tubes de 15 mL contenant le fixateur de Trump à 4 ° C pendant une semaine, changer la fixatif toutes les 48 h.</li>
	<li>N’abandonnez pas animaux au cours de n’importe quelle partie de l’intervention chirurgicale. Après l’ablation du nerf, euthanasier les animaux par dislocation cervicale sous anesthésie.</li>
</ol>2. le tétroxyde d’Osmium traitement et résine enrobage
<ol><li>Après fixation, soigneusement retirer le nerf de toute les gras et les tissus conjonctifs et utiliser un scalpel tranchant pour couper le nerf en segments environ 5 mm de longueur (nerf segments peuvent être séparés et étiquetés dans différents tubes). Préparer des frais de 2 % le tétroxyde d’osmium dilué dans une solution de fixation de Trump et garder dans un tube de verre. Immerger les segments de nerf dans le tétroxyde d’osmium 2 % pendant 2 h, ce qui peut être dans des tubes en plastique pour cette courte période de temps. Remarque : Certains tubes en plastique réagissent avec le tétroxyde d’osmium, causant un assombrissement de la solution, pour un stockage prolongé du tétroxyde d’osmium dans des tubes en plastique n’est pas recommandé.</li>
	<li>À l’aide d’un époxyde enrobage moyen kit, préparer la formule finale d’encastrement :<ol>
<li>Mélanger l’époxy enrobage moyen avec une solution DDSA (l’anhydride dodecenylsuccinic ; mélange A) et mélanger l’époxy enrobage moyen avec une solution NMA (l’anhydride methylnadic ; mélange B). Laissez les deux mélanges A et B mélangent au moins 20 min en remuant avec un agitateur magnétique.</li>
		<li>Immédiatement avant l’emploi, mélanger le mélange A et B et ajouter l’accélérateur DPM-30 (2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol) dans la proportion de 1,5 à 2,0 % du volume total du mélange. Notez que la solution de DPM-30 devrait être mesurée précisément pour empêcher le bloc de couleur foncée et cassants. Tous les produits chimiques de résine sont toxiques ; prendre des précautions supplémentaires pour éviter le contact avec la peau ou par inhalation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>À l’aide de tubes de 1,5 mL, laver les segments du nerf avec du PBS et démarrer le processus de déshydratation en plaçant les segments du nerf en acétone/distillée différents passages de l’eau : 30 %, 60 %, 90 %, des concentrations de 10 min chacun, puis dans l’acétone 100 % 3 fois pendant 10 min chaque.  Notez que l’éthanol peut être utilisé à la place de l’acétone.</li>
	<li>Pour l’infiltration de la résine, placer les segments du nerf dans un mélange de 1 partie du mélange final encastrement et 1 partie 100 % acétone pendant 30 min, puis dans un mélange de 2 parts du mélange final encastrement et 1 partie 100 % acétone pendant 30 min , et enfin lieu le nerf se segmente en finale incorporant le mélange pendant 30 min.</li>
	<li>Mettre les segments du nerf en incorporant des moules de caoutchouc de silicone (nous ont utilisé la longueur de 106 mm x 71 mm largeur x 7 mm de profondeur ; bloquer taille longueur 11 mm x 6 mm largeur x 3 mm de profondeur). Doucement, ajouter la résine sur le dessus les nerfs, en veillant à couvrir les segments du nerf ensemble et éviter les bulles d’air. Laisser le moule contenant des segments de nerf avec la résine de polymériser à 60 ° C pendant la nuit.</li>
</ol>3. sectionnement par Ultramicrotome
<ol><li>Préparer des couteaux de verre à l’aide d’un verrier de couteau (Figure 1 b) et fabriquer des couteaux de verre avec des bateaux (Figure 1), qui servent à recueillir les sections nerveuses flottant sur l’eau distillée.</li>
	<li>Placez les blocs nerveux résine intégrée dans le porte d’ultramicrotome trapézoïdale face vers le haut. À l’aide de la portée ultramicrotome, couper n’importe quel excès de résine qui entoure le tissu de nerf et réaliser le bloc face à une forme trapézoïdale et comme près de la surface longitudinale du nerf possible à l’aide d’une lame à simple tranchant, comme une lame de rasoir. Ne pénètrent pas la surface longitudinale du segment du nerf, qui est reconnaissable par sa coloration sombre par le tétroxyde d’osmium. Remarque : Suppression de l’excès de résine réduira l’aire de résine pour être sectionné et améliorer les performances de la lame et coupe dans les étapes suivantes.</li>
	<li>En utilisant l’ultramicrotome, faire plusieurs coupes suffisantes pour exposer une surface uniforme coupe transversale du tissu nerveux à l’aide d’un couteau de verre plat. Une fois cela fait, passez à un couteau de verre dont le bateau est rempli d’eau distillée à la température ambiante et ajuster l’ultramicrotome à 1-2 μm pour couper des sections minces.</li>
	<li>Transfert flottants lames minces du bateau de couteau verre à une goutte d’eau déionisée sur lame de verre à l’aide de la boucle en métal (Figure 1). Sécher les diapositives contenant des sections en passant plusieurs fois au-dessus d’une flamme pendant quelques secondes, faire attention à ne pas surchauffer les sections. Teindre des sections séchées immédiatement avec la toluidine bleu ou conserver à température ambiante pendant plusieurs jours avant la coloration. NOTE : Sections peuvent également être séchées à l’aide d’un chauffe-plat à 60 ° C pendant 15 min. Un lent processus de séchage rend les sections lisse.</li>
</ol>4. toluidine bleu coloration
<ol><li>Préparer la solution à 1 % de bleu de toluidine dissoudre 2 g de borate de sodium dans 100 mL d’eau désionisée, puis ajouter 1 g de bleu de toluidine et remuer jusqu'à dissolution. Filtrer la solution à l’aide de papier filtre (taille des pores : 11 µm) et conserver la solution dans un flacon opaque à la température ambiante jusqu'à deux semaines.</li>
	<li>À l’aide d’une pipette en plastique ou les micro pipette, ajouter une goutte de solution de bleu de toluidine sur le dessus les sections nerveuses et laisser pendant 20-30 s.</li>
	<li>Rincez toutes les solution de bleu de toluidine excès en plongeant doucement les lames dans le pot d’eau déionisée et répétez 3 ou 4 fois jusqu'à ce que les sections sont claires. Sécher les lames au moins 15 min à 60 ° C ou une nuit à température ambiante et puis recouvrir les sections d’un lamelle couvre-objet à l’aide du milieu de montage régulier. Examiner les diapositives montées immédiatement ou conserver à température ambiante.</li>
	<li>Examiner sous un microscope optique. Un objectif d’immersion 100 X oil est recommandé pour des images détaillées permettant de calculer des ratios g.</li>
</ol>

<ol><li>Zacchigna, S., Ruiz de Almodovar, C., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similarities+between+angiogenesis+and+neural+development%3A+What+small+animal+models+can+tell+us%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Similarities between angiogenesis and neural development: What small animal models can tell us.</a> Current Topics in Developmental Biology. 80, 1-55 (2008).</li>
<li>Grinsell, D., Keating, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve+reconstruction+after+injury%3A+A+review+of+clinical+and+experimental+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve reconstruction after injury: A review of clinical and experimental therapies.</a> BioMed Research International. 2014, 1-13 (2014).</li>
<li>Chen, M. B., Zhang, F., Lineaweaver, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminal+fillers+in+nerve+conduits+for+peripheral+nerve+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Plastic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Luminal fillers in nerve conduits for peripheral nerve repair.</a> Annals of Plastic Surgery. 57 (4), 462-471 (2006).</li>
<li>Scipio, F., Raimondo, S., Tos, P., Geuna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+protocol+for+paraffin-embedded+myelin+sheath+staining+with+osmium+tetroxide+for+light+microscope+observation%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">A simple protocol for paraffin-embedded myelin sheath staining with osmium tetroxide for light microscope observation.</a> Microscopy Research and Technique. 71, 497-502 (2008).</li>
<li>Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+5%3A+Methods+and+protocols+in+peripheral+nerve+regeneration+experimental+research%3A+part+II-morphological+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Neurobioly%22%5BJournal%5D)">Chapter 5: Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: part II-morphological techniques.</a> International Review of Neurobioly. 87, 81-103 (2009).</li>
<li>Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Campos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+myelin+sheath+and+collagen+reorganization+pattern+in+a+model+of+peripheral+nerve+regeneration+using+an+integrated+histochemical+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of myelin sheath and collagen reorganization pattern in a model of peripheral nerve regeneration using an integrated histochemical approach.</a> Histochemistry and Cell Biology. , 709-717 (2011).</li>
<li>Sridharan, G., Shankar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toluidine+blue%3A+A+review+of+its+chemistry+and+clinical+utility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+and+Maxillofacial+Pathology%22%5BJournal%5D)">Toluidine blue: A review of its chemistry and clinical utility.</a> Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16, 251-255 (2012).</li>
<li>Epstein, J. B., Scully, C., Spinelli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toluidine+blue+and+Lugol%27s+iodine+application+in+the+assessment+of+oral+malignant+disease+and+lesions+at+risk+of+malignancy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+Pathology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Toluidine blue and Lugol's iodine application in the assessment of oral malignant disease and lesions at risk of malignancy.</a> Journal of Oral Pathology & Medicine. 21, 160-163 (1992).</li>
<li>Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Cornelissen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+assessment+in+peripheral+nerve+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regeneration+Research%22%5BJournal%5D)">Histological assessment in peripheral nerve tissue engineering.</a> Neural Regeneration Research. 9, 1657-1660 (2014).</li>
<li>Dykstra, M. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDykstra%2C+MJ+%22A+manual+of+applied+techniques+for+biological+electron+microscopy%22">A manual of applied techniques for biological electron microscopy</a>. , Plenum. New York. 257(1993).</li>
<li>Vleggeert-Lankamp, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+evaluation+methods+in+the+assessment+of+peripheral+nerve+regeneration+through+synthetic+conduits%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">The role of evaluation methods in the assessment of peripheral nerve regeneration through synthetic conduits: A systematic review.</a> Journal of Neurosurgery. 107 (6), 1168-1189 (2007).</li>
<li>Williams, P., Wendell-Smith, C. P., Finch, A., Stevens, G. <a target="_blank" href="http://jcs.biologists.org/content/joces/s3-105/69/99.full.pdf">Further uses and methods of processing of fresh frozen sections of peripheral nerve.</a> Journal of Cell Science. 3 (69), 99-105 (1964).</li>
<li>Castro, J., Negredo, P., Avendaño, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+composition+of+the+rat+sciatic+nerve+and+its+modification+during+regeneration+through+a+sieve+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research%22%5BJournal%5D)">Fiber composition of the rat sciatic nerve and its modification during regeneration through a sieve electrode.</a> Brain research. , 65-77 (2008).</li>
<li>Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+and+protocols+in+peripheral+nerve+regeneration+experimental+research%3A+Part+II-morphological+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22International+review+of+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: Part II-morphological techniques.</a> International review of neurobiology. 87, 81-103 (2009).</li>
<li>Bozkurt, A., Lassner, F., O'Dey, D., Deumens, R., Böcker, A., Schwendt, T., Janzen, C., Suschek, C. V., Tolba, R., Kobayashi, E., Sellhaus, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microstructured+and+interconnected+pore+channels+in+a+collagen-based+nerve+guide+on+axonal+regeneration+in+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The role of microstructured and interconnected pore channels in a collagen-based nerve guide on axonal regeneration in peripheral nerves.</a> Biomaterials. 33 (5), 1363-1375 (2012).</li>
<li>Weis, J., Brandner, S., Lammens, M., Sommer, C., Vallat, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+nerve+biopsies%3A+A+practical+guide+for+neuropathologists%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Neuropathology%22%5BJournal%5D)">Processing of nerve biopsies: A practical guide for neuropathologists.</a> Clinical Neuropathology. 31 (1), 7-23 (2012).</li>
<li>Battiston, B., Tos, P., Geuna, S., Giacobini-Robecchi, M. G., Guglielmone, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+repair+by+means+of+vein+filled+with+muscle+grafts.+II.+Morphological+analysis+of+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Microsurgery%22%5BJournal%5D)">Nerve repair by means of vein filled with muscle grafts. II. Morphological analysis of regeneration.</a> Microsurgery. 20 (1), 37-41 (2000).</li>
<li>Bhattacharyya, T. K., Thomas, J. R. <a target="_blank" href="https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1179/his.2004.27.3.161">Comparison of staining methods for resin-embedded peripheral nerve.</a> Journal of Histotechnology. 27, 161-164 (2004).</li>
<li>Zbaeren, J., Zbaeren-Colbourn, D., Haeberli, A. <a target="_blank" href="https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1179/his.2007.30.1.27">High-resolution immunohistochemistry on improved glycol methacrylate-resin sections.</a> Journal of Histotechnology. 30 (1), 27-33 (2007).</li>
<li>Alturkistani, H. A., Tashkandi, F. M., Mohammedsaleh, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+stains%3A+A+literature+review+and+case+study%5BTitle%5D)+AND+%22Global+Journal+of+Health+Science%22%5BJournal%5D)">Histological stains: A literature review and case study.</a> Global Journal of Health Science. 8 (3), 72-79 (2016).</li>
<li>Ezra, M., Bushman, J., Shreiber, D., Schachner, M., Kohn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porous+and+nonporous+nerve+conduits%3A+the+effects+of+a+hydrogel+luminal+filler+with+and+without+a+neurite-promoting+moiety%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Porous and nonporous nerve conduits: the effects of a hydrogel luminal filler with and without a neurite-promoting moiety.</a> Tissue Engineering Part A. (9-10), 818-826 (2016).</li>
<li>Bhatnagar, D., Bushman, J. S., Murthy, N. S., Merolli, A., Kaplan, H. M., Kohn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+glue+as+a+stabilization+strategy+in+peripheral+nerve+repair+when+using+porous+nerve+guidance+conduits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Science%3A+Materials+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fibrin glue as a stabilization strategy in peripheral nerve repair when using porous nerve guidance conduits.</a> Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 28 (5), 79(2017).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêt.

Examens des structures morphologiques des lésions du nerf périphérique et la régénération sont fréquents sujets d’étude13. Dans ce protocole, nous décrivons les étapes pour obtenir des images de haute qualité pour les analyses quantitatives de données histologiques à l’aide de tissu de nerf sciatique du rat incorporés dans des blocs de résine et colorées au bleu de toluidine. Cette technique fournit une image de la morphologie de nerf dans laquelle la régénération nerveuse peut être quantifiée en ...

Nerfs périphériques s’étendent dans tout le corps, qui innervent les tissus cibles avec des axones moteurs ou sensoriels1. Nerfs périphériques congénitales causées par des troubles médicaux et les traumatismes représentent un problème majeur de santé publique et ont de grandes incidences économiques2,3. Malgré les progrès dans l’évaluation des résultats des lésions des nerfs périphériques et comprendre la régénération nerveuse, les méthodes traditionnelles comme l’histologie nerveuse et des techniques de coloration sont des outils indispensables pour évaluer qualitativement et quantitativement la santé nerveuse comme une mesure de résultat terminal dans des modèles animaux ou des tissus humains excisés. Ceci est souvent associé à des mesures électrophysiologiques de la fonction de nerf périphérique, où la morphométrie peut révéler pourquoi la régénération nerveuse fonctionnelle n’a ou n’a pas eu lieu.
Le bleu de toluidine souillant des sections de nerfs périphériques semi mince résine intégrée est une méthode spécialisée pour l’imagerie des fibres nerveuses myélinisées, de haute qualité et effacer des images détaillées de nerf structures4,5,6 . Le bleu de toluidine est un colorant métachromatique acidophile, découvert par Perkin, en 1856,7et a été utilisé dans plusieurs applications médicales8. Sections de nerfs périphériques teinté bleu de toluidine provenant de segments de nerfs enrobées dans la résine permet une visualisation claire des structures nerveuses. Visualisation de la structure de la gaine de myéline peut être améliorée par l’utilisation de tétroxyde d’osmium après fixation4,9. Le tétroxyde d’osmium est un oxydant et lipides fixateur agent toxique qui interagit avec des doubles liaisons dans les lipides, résultant dans la gaine de myéline des riches en lipides nettement défini10. Toutefois, le tétroxyde d’osmium est toxique et cher, nécessite une période d’incubation plus longue des segments du nerf et n’est pas toujours utilisée.
Méthodes alternatives de traitement et de coloration ont été développés pour la visualisation de la morphologie du nerf périphérique ; Paraffine, sectionnement cryogéniques et sectionnement de nerfs enrobées dans la résine époxy suivie par coloration au bleu de toluidine ou phénylènediamine solution a été utilisée pour quantifier les changements morphologiques des nerfs périphériques régénération 11,12 . Ces méthodes ont leurs avantages et le rendement des données essentielles sur le nombre d’axones, l’épaisseur de la myéline, diamètre de l’axone et diamètre de l’axone à fibres myélinisées diamètre (g-ratio) 11,13,14,15 .
La principale distinction le plongement de résine dans le présent protocole est qu’il facilite l’obtention de 1 à 2 μm de sections transversales épaisseur en raison de la dureté de la résine tout en conservant les qualités histologiques du nerf. Ces coupes minces, plutôt que les sections d’épaisseur 4-5 μm provenant de paraffine déguisant, fournissent des sections de nerfs périphériques avec une résolution plus élevée, ce qui permet une quantification plus précise de la myélinisation des axones, tels que le g-rapport, qui ne peut pas être obtenu à partir de sections plus épais16. Sectionnement cryogéniques peut être utilisés pour obtenir des Articles de 1 à 2 µm, il a été notre expérience qu’il est plus difficile d’obtenir des sections sans grandes de nombreuses fissures. Ces sections fissurées peuvent causer comptage inexactes des aspects de la myélinisation et le nombre d’axones.
En plus de bleu de toluidine17, une médaille d’argent de coloration méthode18 et coloration trichrome de Masson4 permet également de montrer les axones. Toutefois, à l’aide de résine enrobage des sections de nerf médian rat teinté avec l’hématoxyline et éosine ou de Masson trichrome gaines de myéline ont montré faibles et structures non reconnus, alors que le bleu de toluidine coloration a montré clairement la myéline gaine image et peut facilement être quantifiés4. Malgré quelques limitations, nerfs de coloration de résine intégrée périphérique bleu de toluidine est une technique qui peut être utilisée lorsque des images de haute résolution de morphologie de nerf sont requises.
L’inconvénient principal pour l’incorporation de la résine est qu’il prend du temps et ne permet pas d’immunomarquage du même tissu en raison de la difficulté de recherche d’antigène par rapport à la paraffine et des techniques de coupes congelées d’incorporé. Ainsi, il n’est pas généralement possible d’utiliser le même tissu pour immunostaining qui est traitée par enrobage résine pour coloration bleu de toluidine. Bien que pas utilisé ici, si vous souhaitez l’immunohistochimie en résine sections embarquées, l’utilisation de l’incorporation des résines de méthacrylate de glycol permet l’immunohistochimie sur coupes de tissus, mais c’est relativement cher19. Cela peut être quelque peu atténué en coupant les nerfs périphériques en segments distincts, certains pour enrobage résine e.a. pour immunostaining directement après fixation.
Le processus de formation de bleu de toluidine taches de résine intégrée des nerfs périphériques, comme l’analyse histopathologique plus, peut être divisé en cinq étapes, y compris la fixation, déshydratation, enrobage, sectionnement et20de coloration. Notre objectif ici est de fournir un protocole et des lignes directrices pratiques pour l’utilisation de résine teintées de sections de nerf sciatique de rat embarqués avec des images de haute qualité toluidine bleu d’acquérir.

<table><tbody><tr><td>Tampon phosphate salin Dulbecco’s Gibco</td><td></td><td>14200-075</td><td></td></tr><tr><td>Solution de glutaraldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium monobasique monohydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Bleu de toluidine O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3260</td><td></td></tr><tr><td>Tétraborate de sodium décahydraté</td><td>Acros Organics</td><td>205950010</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal</td>, <td>NDC 66794-013-25</td><td></td></tr><tr><td>Kit de milieu d’enrobage d’époxy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45359</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’hydroxyde de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72068</td><td>Pour ajuster le pH fixateur de Trump</td></tr>, <tr><td>Acétone</td><td>Fisher Chemical</td><td>170942</td><td></td></tr><tr><td>Solution de tétroxyde d’osmium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75632</td><td></td></tr><tr><td>VWR Micro Slides, Superfrost Plus</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Couvercle de microscope Verre</td><td>Fisher Scientific</td><td>12545102</td><td></td></tr><tr><td>Pelco Embedding Cast</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9671811</td><td></td></tr><tr><td>Fabricant de couteaux en verre</td><td>RMC Products</td><td>GKM-2</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotome</td><td>RMC Products</td><td>MT-XL</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tube conique</td><td>Falcon</td><td>ISO 9001</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 1,5 mL Microcentrifugeuses</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9661</td><td></td></tr><tr><td>4 mL Flacon en verre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>854190</td><td></td></tr><tr><td>Lames de rasoir</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>Pour le rognage de blocs de résine</td></tr><tr><td>Perfect Loop</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>70944</td><td>Pour ramasser de fines sections de résine</td></tr><tr><td>Bandes de couteau en verre Ultra 6,4 mm x 25 mm x 400 mm</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>71012</td><td></td></tr> Four <tr><td>100 Watt</td><td>Millipore&nbsp ;</td><td></td><td></td>6350115</tr><tr><td>Papier filtre Whatman</td><td>Pipette en plastique Sigma-Aldrich</td><td>WHA10010155</td><td></td></tr><tr><td>3 mL</td> Kit micro-chirurgical <td>Sigma-Aldrich</td><td>Z331740</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Instruments de précision mondiaux Microscope</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> à<td>fluorescence Olympus</td><td>Caméra couleur et monochrome CCD, DP80</td></tr></tbody></table>

toluidine bleu coloration des sections enrobées dans la résine pour l’évaluation de la morphologie des nerfs périphériques

Toluidine Blue Staining of Resin-Embedded Sections for Evaluation of Peripheral Nerve Morphology

Nerfs périphériques s’étendent dans tout le corps, qui innervent les tissus cibles avec les axones moteurs ou sensoriels. En raison de la généralisation, les nerfs périphériques sont souvent endommagés en raison d’un traumatisme ou d’une maladie. Méthodes et stratégies ont été développées pour évaluer les lésions des nerfs périphériques dans des modèles animaux, fonction et régénération, analysant la morphométrie des nerfs périphériques est devenue une mesure essentielle issue terminale. Points de coloration du nerf croix bleu de toluidine obtenues des sections nerveuses résine intégrée est une méthode reproductible pour les évaluations qualitatives et quantitatives des nerfs périphériques, permettant la visualisation de morphologie nombre d’axones et le degré de myélinisation. Cette technique, comme pour beaucoup d’autres méthodes histologiques, peut être difficile à apprendre et à maîtriser à l’aide de protocoles standard de l’écrits. Cette publication vise donc à accentuer des protocoles écrits pour la coloration des nerfs périphériques à la vidéographie de la méthode, à l’aide de nerfs sciatiques récoltés des rats bleu de toluidine. Dans ce protocole, nous décrivons la fixation in vivo des nerfs périphériques et collection du tissu et après fixation avec 2 % le tétroxyde d’osmium, incorporant des nerfs dans la résine époxyde et ultramicrotome sectionnement des nerfs à 2μm-1 épaisseur. Les sections nerveuses puis transféré à une lame de verre et colorées au bleu de toluidine, après quoi ils sont quantitativement et qualitativement évalués. Exemples de problèmes les plus courants sont indiqués, ainsi que des mesures pour atténuer ces problèmes.

Résine intégrée des nerfs périphériques sections colorées au toluidine bleues permettent des analyses quantitatives précises données histologiques. Un aperçu de la procédure apparaît (Figure 2). Sections de nerfs sciatiques incorporé dans le milieu de la résine et colorées au bleu de toluidine a montré clairement des images avec une résolution optimale (3 chiffres). Lésions nerveuses peuvent causer beaucoup de changements dans le nerf les str...

Nous présentons ici un protocole afin de visualiser les structures fines des nerfs périphériques en obtenant et en coloration de 1 à 2 µm sections avec toluidine bleu

Toluidine bleu coloration des Sections enrobées dans la résine pour l’évaluation de la morphologie des nerfs périphériques

Peripheral nerves extend throughout the body, innervating target tissues with motor or sensory axons. Due to widespread distribution, peripheral nerves ...

Cette méthode pourrait aider à répondre à des questions clés dans les domaines des lésions et de la régénération des nerfs périphériques, telles que la morphométrie d’un nerf périphérique, combien d’axones sont présents, quel est l’état de myélinisation et y a-t-il du tissu fibreux présent ? Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de visualiser à haute résolution les caractéristiques nerveuses. Commencez par placer un rat anesthésié en position couchée sur le dessus d’un tapis de dissection.Placez un cône nasal pour maintenir l’anesthésie avec 1-2 % d’isoflurane. Pour assurer une profondeur d’anesthésie adéquate, testez les animaux pour le retrait de la pédale et les réflexes palpébraux des pattes arrière. Une fois qu’une profondeur d’anesthésie appropriée est atteinte, rasez les poils des membres postérieurs et stérilisez les zones rasées avec de l’éthanol à 70 %.Palpez le fémur pour identifier l’emplacement approprié pour l’incision. Le fémur est situé juste à proximité du segment le plus accessible du nerf sciatique. Après avoir fait une incision de deux à trois centimètres dans la peau le long du membre postérieur, du genou jusqu’au grand trochanter, localisez le plan entre le muscle biceps fémoral et le muscle grand fessier.Ensuite, utilisez des ciseaux de microdissection pour séparer le fascia sous-jacent et exposer deux à trois centimètres du nerf sciatique sous-jacent. Utilisez un écarteur pour élargir l’espace entre les deux muscles. À l’aide d’une pince fine et de ciseaux à iris, séparez soigneusement le nerf du tissu conjonctif environnant, en prenant grand soin de ne pas comprimer ou couper le nerf.Ensuite, couvrez le nerf exposé avec le fixateur de Trump et laissez reposer pendant 10 minutes. Si nécessaire, placez de la gaze sous la patte arrière pour améliorer l’angle afin d’ajouter plus de fixateur dans la cavité. Retirez le fixateur après 10 minutes et répétez cette étape deux fois de plus.Sous le microscope de dissection, coupez le nerf sciatique des deux côtés à l’aide de ciseaux de dissection fins, en veillant à ne pas étirer ou pincer le nerf. Mettez immédiatement les sections nerveuses dans des tubes de 15 ml contenant le fixateur de Trump et fixez-les à quatre degrés Celsius pendant une semaine, en changeant le fixateur toutes les 48 heures. Après la fixation, retirez soigneusement toute graisse et tissu conjonctif restants du nerf et utilisez un scalpel bien aiguisé pour couper le nerf en segments d’environ cinq millimètres de long.Les segments nerveux peuvent être séparés en différents tubes étiquetés. Immergez les segments nerveux dans du tétroxyde d’osmium à 2 % fraîchement préparé pendant deux heures. À l’aide d’un kit d’enrobage époxy, préparez le mélange d’enrobage final.Mélangez le milieu d’enrobage époxy avec la solution DDSA et mélangez le milieu d’enrobage époxy avec la solution NMA. Mélangez les deux solutions pendant au moins 20 minutes avec un agitateur magnétique. Immédiatement avant l’utilisation, combinez le DPM de l’accélérateur à la solution B, puis combinez-le avec la solution A de sorte que la proportion finale de l’accélérateur soit comprise entre un virgule cinq et 2 % du volume total.Transférez les segments nerveux dans des tubes de cinq millilitres et après le lavage avec du PBS, commencez le processus de déshydratation en remplaçant le PBS par des concentrations croissantes d’acétone et d’eau distillée pendant 10 minutes chacun, puis dans 100 % d’acétone trois fois pendant 10 minutes chacun. Une étape critique est la déshydratation des tissus. L’eau et la résine n’interagiront pas, de sorte que l’eau restant dans le tissu ne sera pas infiltrée par la résine, laissant des trous dans la section dépourvus de qualités histologiques.Pour l’infiltration de résine, placez d’abord les segments nerveux dans un mélange individuel de mélange d’enrobage et de 100 % d’acétone pendant 30 minutes. Après 30 minutes, transférez les segments dans un mélange deux à un de mélange d’enrobage et de 100 % d’acétone pendant 30 minutes. Placez les segments nerveux dans des moules d’enrobage en caoutchouc de silicone et ajoutez doucement la résine sur les nerfs, en veillant à couvrir tout le segment nerveux tout en évitant les bulles d’air.Laissez la résine polymériser à 60 degrés Celsius pendant la nuit. Placez un bloc de résine avec nerf intégré dans le support d’ultramicrotome avec le côté trapézoïdal vers le haut. Pendant l’observation à travers l’ultramicrotome, utilisez une lame à un seul tranchant pour couper l’excès de résine entourant le tissu nerveux.Ne pas pénétrer la surface longitudinale du segment nerveux qui est reconnaissable à sa coloration foncée par le tétroxyde d’osmium. Avec un couteau en verre ordinaire sur l’ultramicrotome, faites plusieurs sections transversales pour exposer une surface de section transversale uniforme du nerf. Une fois cela fait, passez à un couteau en verre avec le bateau rempli d’eau distillée à température ambiante et ajustez l’ultramicrotome à un à deux microns pour couper des sections minces.Utilisez une boucle métallique pour transférer des sections minces flottantes du bateau à couteaux en verre à une goutte d’eau déminéralisée sur une lame de verre. Une autre étape critique est lors du transfert de la section mince du couteau en verre à la glissière. Ces lames fines sont très fragiles et peuvent se casser ou se plier.Après la section, séchez les sections sur les lames en passant une lame sur une flamme plusieurs fois, en veillant à ne pas surchauffer les sections. Les lames peuvent être stockées à température ambiante pendant plusieurs jours si elles ne sont pas immédiatement colorées au bleu de toluidine. Pour colorer les sections nerveuses, utilisez une pipette en plastique ou un micropipeteur pour ajouter une goutte de solution de bleu de toluidine sur le dessus des sections nerveuses.Après 20 à 30 secondes, rincez tout l’excès de solution de bleu de toluidine en trempant doucement les lames dans un bocal d’eau déminéralisée, en répétant trois à quatre fois jusqu’à ce que les sections soient claires. Faites sécher les lames pendant au moins 15 minutes à 60 degrés Celsius ou toute la nuit à température ambiante. Après séchage, ajoutez un support de montage régulier et recouvrez les sections d’une lamelle.Enfin, examinez les sections montées au microscope optique. Un objectif à immersion dans l’huile 100X est recommandé pour des images détaillées afin de calculer les rapports g. Des coupes de nerf sciatique intégrées dans un milieu de résine et colorées au bleu de toluidine ont montré des images claires avec une résolution optimale à l’augmentation du grossissement de 10X à 20X, 40X et 60X.Cette méthode préserve la structure nerveuse et permet une imagerie à haute résolution et à fort grossissement qui facilite la mesure de plusieurs paramètres tels que le rapport g, qui est le rapport entre le diamètre de l’axone, indiqué par la flèche étiquetée B, et le diamètre total de la fibre, étiqueté A.Une variété de facteurs peuvent conduire à des sections nerveuses périphériques moins qu’optimales, y compris la présence de fissures dans la section en raison d’une mauvaise manipulation du nerf. Des trous peuvent également se produire dans la section en raison d’une déshydratation insuffisante. Une autre erreur possible dans la procédure est le pliage des sections, qui peut être corrigée en utilisant des boucles d’inoculation pour le transfert de section sur la lame de verre.À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, comme la quantification des axones, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires telles que : quel est le degré de régénération d’un nerf régénératif ? Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’obtenir des sections de nerfs périphériques d’un à deux microns pour évaluer la morphométrie nerveuse.

toluidine-blue-staining-resin-embedded-sections-for-evaluation

Research

Recherche

JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

Une combinaison de différentes techniques pour optimiser la collecte des données à partir de tissus de la souris est présentée.

Combinant colorant lipophile, In situ</emHybridation>, immunohistochimie et l&#39;histologie

L'identification immunocytochimique de sensitive périphérique sous-types de fibres nerveuses (et de détection de l'expression des protéines qui y sont) sont essentiels à la compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents sensations périphériques. Nous décrivons ici les méthodes de préparation d'échantillons de tissus périphériques / viscérale, tels que les os de la peau et des membres, par immunomarquage spécifique des fibres nerveuses périphériques sensorielles.

Préparation des tissus et des fibres Immunocoloration souris nerveuses sensitives innervant la peau et les os du membre

Cette vidéo montre la technique de coloration de coupes nerveuses périphériques de rats enrobées de résine et traitées au tétroxyde d’osmium à l’aide de bleu de toluidine. Les sections nerveuses colorées aident à visualiser les structures fines des nerfs périphériques.

Coloration au bleu de toluidine de sections nerveuses périphériques : une technique pour colorer les fibres nerveuses myélinisées pour la visualisation de la structure nerveuse périphérique

Afin d'étudier les changements de fibres nerveuses nociceptives (intraépidermiques IENFs) dans les neuropathies douloureuses (PN), nous avons développé des protocoles qui pourraient examiner directement les modifications morphologiques tridimensionnels observés dans IENFs nociceptifs. Analyse tridimensionnelle de IENFs a le potentiel d'évaluer les changements morphologiques des IENF en PN.

L&#39;imagerie tridimensionnelle de nociceptifs fibres nerveuses intra-épidermiques dans des biopsies de peau humaine

Techniques de visualisation cytoarchitecture rétine directement adjacent aux électrodes individuelles au sein d'un stimulateur rétinien.

Techniques pour les yeux de traitement implantés avec une prothèse rétinienne pour l&#39;analyse histopathologique localisée

Cellules olfactives engainantes (OECO) sont des cellules de la crête neurale qui permettent la croissance des neurones olfactifs primaires. Cette propriété spécifique peut être utilisé pour la transplantation cellulaire. Nous présentons ici un modèle de transplantation cellulaire basé sur l'utilisation de la COE dans un modèle de lésion du nerf laryngé.

La transplantation de cellules olfactives engainantes à évaluer la récupération fonctionnelle après des nerfs périphériques blessures

Le protocole pour l'imagerie dynamique longitudinale et lésion laser sélectif de terminaisons nerveuses chez des souris transgéniques reporter est présente.

In Vivo microscopie à deux photons de terminaisons nerveuses dans la peau simples

Les maladies démyélinisantes peuvent être modélisées chez les animaux par l’application focale de lysolécithine dans le SNC. Une seule injection de lysolécithine dans la moelle épinière de la souris produit une lésion qui se répare spontanément avec le temps. L’objectif est d’étudier les facteurs impliqués dans la démyélinisation et la remyélinisation, et de tester des agents permettant d’améliorer la réparation.

Expérimental démyélinisation et la remyélinisation de la moelle épinière murin par injection focale de lysolécithine

Nous décrivons ici une nouvelle préparation pour l’imagerie des terminaisons sensorielles lancéolées en direct des terminaisons palissadiques qui innervent les follicules pileux de la peau de l’oreille de souris pendant la coloration et la décoloration avec des colorants de styrylpyridinium.

Surveillance optique de Living Nerve Terminal Marquer follicule pileux lancéolées Endings du<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Souris oreille peau

La combinaison de la microscopie électronique à transmission et transduction in utero est une approche puissante pour l’étude des changements morphologiques dans l’ultrastructure fine du système nerveux au cours du développement. Cette méthode combinée permet profond aperçu des changements dans les détails structurels qui sous-tendent la neuroplasticité en ce qui concerne leur représentation topographique.

Évaluation des paramètres de la neuroplasticité ultrastructurales après In Utero Transduction du cerveau de souris et la moelle épinière en développement

Nous décrivons des méthodes de photoactivation de fluorescence pour analyser le transport axonal des neurofilaments dans les axones myélinis simples des nerfs périphériques des souris transgéniques qui expriment une protéine de neurofilament photoactivatable.

Imagerie et analyse du transport neurofilament dans le nerf tibial de souris excisée

Découvrez la coloration au bleu de toluidine pour l'évaluation de la morphologie des nerfs périphériques chez le rat. Cette méthode histologique permet une visualisation haute résolution des axones et de la myélinisation.

Toluidine bleu coloration des Sections enrobées dans la résine pour l’évaluation de la morphologie des nerfs périphériques

Explorer plus de vidéos