Name: Modélisation de Microcircuit synaptique avec 3D Cocultures d’Astrocytes et les neurones des cellules souches pluripotentes humaines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Découvrez comment modéliser des microcircuits synaptiques en 3D avec des cocultures d'astrocytes et de neurones dérivés de cellules souches pluripotentes humaines. Cette méthode permet d'étudier l'activité des circuits neuronaux.

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Nous tenons à remercier Dr. Erik Ullian (UCSF) pour un apport intellectuel sur la conception de ces procédures, Dr Michael Ward (NIH) pour des conseils techniques sur la différenciation des rudolfinho et Saba Barlas d’analyse d’images préliminaires.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans ce protocole, nous décrivons une méthode systématique pour la production des sphères 3D des cocultures neuronales. Les sphères sont composées des astrocytes et les neurones, qui sont dérivées de manière indépendante de hPSCs. Bien que pas l’objectif du présent protocole, la génération des populations pures des astrocytes du hPSCs28 est une étape cruciale et peut être techniquement difficile si effectuée sans expérience préalable. Cette première étape de la génération de ces microcircuits syna...

Avec une variété de responsabilités fonctionnelles au-delà de soutien structurel, les astrocytes sont un type de cellules gliales très abondante dans le système nerveux central (CNS). Par le biais de la sécrétion de facteurs solubles synaptogenic et constituants de la matrice extracellulaire (ECM), astrocytes aident à la mise en place et le regroupement des synapses matures au cours du développement1. Ils jouent un rôle essentiel dans le maintien de la santé et la plasticité des synapses à extracellulaire signalisation2,3,4,5aussi et contribuent à la stabilité à long terme de l’homéostasie environnements en régulant le potassium extracellulaire et glutamate, ainsi que la sécrétion de substrats énergétiques et ATP6,7,8. Enfin, ils peuvent contribuer à la neurotransmission en influant sur les courants extrasynaptic9et peuvent influencer indirectement l’activité à travers d’autres types de cellules, telles que la promotion de la myélinisation10. Ce qui est important, car l’anomalie ou dysfonctionnement des astrocytes peut conduire à de nombreux syndromes neurodéveloppementaux et neuropathologie adulte, il y a un besoin évident d’inclure aux côtés de neurones dans l’ingénierie réseaux de neurones, les astrocytes dans l’ordre pour une meilleure modèle de l’environnement de cerveau endogène. Une caractéristique intégrale des astrocytes est leur capacité à forme dynamique des interactions avec les synapses neuronales1,11,12. En l’absence des cellules gliales, les neurones forment un nombre limité de synapses, ce qui en général aussi le manque de maturité fonctionnelle13.
Astrocytes humains présentent des caractéristiques morphologiques, transcriptionnelles et fonctionnels, tels que l’augmentation de la taille et la complexité du branchements, ainsi que des gènes — qui ne sont pas récapitulée dans rongeurs12,14, 15. Ainsi, des études utilisant les cellules souches pluripotentes humaines (hPSC)-des cellules neuronales dérivées sont largement acceptés comme un moyen d’examiner les maladies liées à la CNS in vitro tout en développant de nouveaux traitements, modèles de lésion et paradigmes de la culture16 ,,17. En outre, hPSCs permettre l’étude de la formation des synapses humaines et de la fonction sans la nécessité pour le tissu principal18,19.
Une barrière à la compréhension de comment les divers types de cellules et signaux contribuent au fonctionnement synaptique est le manque de modèles appropriés du cerveau humain. Il y a un besoin pour une plate-forme appropriée récapituler ses réseaux synaptiques avec haute fidélité et de la reproductibilité. Récemment, l’intérêt a émergé dans la production de systèmes de culture 3D (généralement connu comme « organoids », « sphéroïdes », ou « mini cerveaux »)20 pour modéliser le complexe en trois dimensions (3D) structures au niveau cellulaire et macro. Systèmes de culture 3D conservent des interactions ECM et les cellules qui sont normalement absents ou limités au cours de la co-culture 2D typique paradigmes21,22. Une abondance de techniques existent pour la culture des sphéroïdes neurale 3D23,24,25; Cependant, beaucoup exigent des périodes de culture longue (mois à années) pour le développement spontané et préservation de la couche, avec l’utilisateur présentant très peu de contrôle sur la sortie.
Ici, nous illustrons une méthode systématique pour rapidement et constamment des interactions neuronales bioingénieur parmi plusieurs types de cellules (différenciée des neurones et les astrocytes) dérivé de hPSCs en assemblant des cellules dans les cocultures sphère (« astéroïdes »)26 qui récapitulent les complexités morphologiques spécifiques à l’humain en 3D. Ce système neural haute densité génère des sous-types neurales-répartie qui prennent matures propriétés au fil du temps et peuvent être projetés ou dosés de manière à haut débit. Nous montrons pour la première fois que les astrocytes humains induisent réseau synaptique rafale activité dans ces cocultures 3D. En outre, le présent protocole est facilement adaptable pour générer des sphères de différentes tailles, d’utiliser des cellules spécifiées à différentes identités régionales du SNC et pour étudier les interactions de plusieurs autres types de cellules comme vous le souhaitez.

<table><tbody><tr><td>Plaque à 6 puits</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>Tubes coniques de 15 mL</td><td>Olympus Plastics</td><td>28-101</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma</td><td>A6964-100ML</td><td>Solution de détachement</td></tr><tr><td>Plaque AggreWell</td><td>Stemcell Technologies</td><td>34850</td><td></td></tr><tr><td>Solution de rinçage anti-adhérence</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7010</td><td>Prevent cell adhérence aux plaques de micropuits</td></tr><tr><td>Anti/anti</td><td>Thermofisher</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Thermofisher</td><td>17504044</td><td>Media Supplément</td></tr><tr><td>Milieu neuronal BrainPhys</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5790</td><td>Alternative au milieu basal neurophysiologique</td></tr><tr><td>Lamelles de verre circulaires</td><td>Neuvitro</td><td>GG-12-oz</td><td></td></tr><tr><td>Cryostor CS10</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7930</td><td>Milieu de cryoconservation avec 10 % de DMSO</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermofisher</td><td>10565-042</td><td>Avec supplément de GlutaMAX</td></tr><tr><td>DMH-1</td><td>Stemcell Technologies</td><td>73634</td><td>DANGER : Toxique en cas d’ingestion. Concentration de travail : 2 &mu ; M</td></tr><tr><td>Sérum d’âne</td><td>Lampire Biological Laboratories</td><td>7332100</td><td>Concentration de travail : 5 % dans le tampon de blocage primaire, 1 % dans le tampon de blocage secondaire</td></tr><tr><td>Chlorhydrate de doxycycline (Dox)</td><td>Sigma</td><td>D3072-1ml</td><td>DANGER : Toxique pour les femmes enceintes. Concentration de travail : 2 &mu ; g/mL</td></tr><tr><td>Facteur de croissance épidermique (EGF)</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>Concentration de travail : 10 ng/mL</td></tr><tr><td>Facteur de croissance des fibroblastes-2 (FGF)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Concentration de travail : 10 ng/mL</td></tr><tr><td>Solution de montage Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Lames de verre</td><td>Fisherbrand</td><td>22-037-246</td><td></td></tr><tr><td>Sérum</td> <td>de chèvreLampire Biological Laboratories</td><td>7332500</td><td>Concentration de travail : 5 % dans le tampon de blocage primaire, 1 % dans le tampon de blocage secondaire</td></tr><tr><td>Hémacytomètre ou compteur automatique de cellules</td><td>Life Technologies</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H3149-50KU</td><td>Concentration de travail : 2 mg/mL</td></tr><tr><td>Plaque magnétique</td><td>DLAB</td><td>8030170200</td><td></td></tr><tr><td>Matrice membranaire Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Solution de revêtement ECM. Concentration de travail : 80 &mu ; g/ml. Préparez-le sur de la glace et assurez-vous que les pipettes, les tubes et les supports sont pré-refroidis.</td></tr><tr><td>Système MEA 2100</td><td>Systèmes multicanaux</td><td>MEA2100</td><td></td></tr><tr><td>Solution</td><td></td><td></td><td></td>de montage</tr><tr><td>N2</td><td>Thermofisher</td><td>17502048</td><td>Media Supplement</td></tr><tr><td>OCT</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td>Solution d’enrobage tissulaire pour la cryosection</td></tr><tr><td>Pap Pen (Aqua Hold)</td><td>Laboratoire de dispositifs scientifiques</td><td>9804-02</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde ( PFA)</td><td>Acros Organics</td><td>169650025</td><td>DANGER : Toxique en cas d’inhalation. Concentration de travail : 4 % dans une</td></tr><tr><td>solution saline tamponnée au phosphate PBS (PBS)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>CA008-300</td><td></td></tr><tr><td>Poly-l-ornithine (PLO)</td><td>Sigma</td><td>P3655-100MG</td><td>Concentration de travail : 0,5 mg/mL</td></tr><tr><td>Couvercles rectangulaires en verre</td><td>Fisherfinest Premium Superslip</td><td>12-545-88</td><td></td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5872</td><td>Détachement et passage réactif</td></tr><tr><td>Inhibiteur de la rho-kinase Y27632- (Y)</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>Concentration de travail : 10 uM</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Stemcell Technologies</td><td>72234</td><td>Concentration de travail : 2 &mu ; M</td></tr><tr><td>Fioles tournantes</td><td>Fisher Scientific</td><td>4500-125</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Fisher Chemical</td><td>S5-3</td><td>Concentration de travail : 20 % ou 30 % dans la</td></tr><tr><td>fiole de culture PBS T25</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-207</td><td>Bouchons ventilés</td></tr><tr><td>T75 Flacon de culture Olympus</td><td>Plastics</td><td>25-209</td><td>Bouchons ventilés</td></tr><tr><td>Terg-A-zyme</td><td>Sigma</td><td>Z273287-1EA</td><td>Détergent. Concentration de travail : 1 %</td></tr> <tr><td>de milieu basal TeSR-E8</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5940</td><td>Milieu de cellules souches pluripotentes humaines (hPSC)</td></tr><tr><td>Suppléments TeSR-E8 Suppléments</td><td></td><td></td><td>pour le milieu de cellules souches pluripotentes humaines</td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500ML</td><td>Détergent pour la perméabilisation cellulaire. Concentration de travail : 0,25 % dans le tampon bloquant</td></tr><tr><td>Bleu trypan</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td><Anticorps >forts</forts></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488</td><td>Thermofisher</td><td>A-11029</td><td>Anticorps secondaire</td></tr><tr><td>AlexaFluor 594</td><td>Thermofisher</td><td>A-11037</td><td>Anticorps secondaires</td></tr><tr><td>Ezrin</td><td>Thermofisher</td><td>MA5-13862</td><td>Anticorps primaires ; astrocytes périsynaptiques</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>Chemicon</td><td>MAB360</td><td>Anticorps primaires ; astrocytes</td></tr><tr><td>GFP</td><td>Aves</td><td>GFP-1020</td><td>Anticorps primaire ; astrocytes</td></tr><tr><td>Glt1</td><td>Don du Dr Jeffrey Rothstein</td><td>n/a</td><td>Anticorps primaire ; astrocytes</td></tr><tr><td>Homer</td><td>Synaptic Systems</td><td>160 011</td><td>Anticorps primaire ; neurones post-synaptiques</td></tr><tr><td>MAP2</td><td>Systèmes synaptiques</td><td>188 004</td><td>Anticorps primaires ; neurones</td></tr><tr><td>PSD95</td><td>Abcam</td><td>ab2723</td><td>Anticorps primaires ; neurones post-synaptiques</td></tr><tr><td>S100</td><td>Abcam</td><td>ab868</td><td>Anticorps primaires ; astrocytes</td></tr><tr><td>Synapsine 1</td><td>Systèmes synaptiques</td><td>106 103</td><td>Anticorps primaires ; neurones pré-synaptiques</td></tr><tr><td>TuJ1/&beta ; 3-tubuline (TUBB3)</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>Anticorps primaire ; neurones</td></tr></tbody></table>

modélisation de microcircuit synaptique avec 3d cocultures d’astrocytes et les neurones des cellules souches pluripotentes humaines

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Une barrière à la compréhension de comment les divers types de cellules et signaux contribuent au fonctionnement synaptique est le manque de modèles pertinents pour l’étude du cerveau humain. Une technologie émergente pour régler ce problème est l’utilisation de trois dimensions (3D) cellules neurales cultures, appelé « organoids » ou « sphéroïdes », pour la préservation à long terme des interactions intercellulaires, y compris les molécules d’adhérence extracellulaire. Toutefois, ces systèmes de culture sont longues et pas systématiquement généré. Ici, nous détaillons une méthode pour produire rapidement et uniformément des cocultures 3D des neurones et les astrocytes de pluripotentes humaines de cellules souches. Tout d’abord, différenciées des astrocytes et des progéniteurs neurones sont dissociées et comptés. Ensuite, les cellules sont combinées dans la sphère formant des plats avec un inhibiteur de la Rho-Kinase et à des rapports spécifiques pour produire des sphères de taille reproductible. Après plusieurs semaines de culture comme des sphères flottantes, cocultures (« astéroïdes ») sont finalement sectionnés pour immunostaining ou plaquées sur baies multiélectrodes pour mesurer la force et la densité synaptique. En général, il est prévu que ce protocole donnera 3D sphères neurones qui affichent des marqueurs de type cellule mature restreint, forment des synapses fonctionnelles et montrent une activité éclatement spontané réseau synaptique. Ensemble, ce système permet de dépistage des drogues et des enquêtes sur les mécanismes de la maladie dans un modèle plus approprié par rapport à des cultures monocouches.

Lorsqu’ont été exécutés correctement, ce protocole va produire des populations définies des cocultures fonctionnelles d’astrocytes28,33,34 et neurones35 produit de hPSCs (Figure 1 a-1C), comme détaillées précédemment26 et étapes 2.1 à 2.2 décrites ici. Cette procédure pas à pas, avec l’utilisation de pl...

Dans ce protocole, nous avons pour objectif de décrire une méthode reproductible pour les neurones de cellules souches dérivées pluripotentes humaines combinant dissociée et astrocytes ensemble en 3D sphère cocultures, maintenir ces sphères dans des conditions de flottement libres et par la suite mesure de l’activité synaptique circuit des sphères avec immunoanalyse et enregistrements multiélectrodes tableau.

Modélisation de Microcircuit synaptique avec 3D Cocultures d’Astrocytes et les neurones des cellules souches pluripotentes humaines

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en neurosciences concernant la façon dont la communication intercellulaire entre plusieurs types de cellules neurales humaines contribue à la formation et au fonctionnement des circuits synaptiques. Cette technique génère rapidement et systématiquement des sphères de coculture tridimensionnelle d’astrocytes et de neurones fonctionnellement matures à partir de cellules souches pluripotentes humaines. Ceux-ci peuvent être utilisés pour des recherches expérimentales rigoureuses.La reproductibilité et l’évolutivité de ce protocole constituent une alternative définie aux technologies organoïdes émergentes. Ceux-ci sont prometteurs pour le développement de nouveaux médicaments et la thérapie par greffe cellulaire pour favoriser la neurorégénération après une blessure ou une maladie. Commencez par placer des grappes de HPSC dans deux millilitres de milieu HPSC contenant l’inhibiteur de la rho-kinase Y-27632 dans chaque puits d’une plaque à six puits recouverte d’ECM.Maintenez les cellules souches jusqu’à ce qu’elles soient confluentes à environ 50 %, puis changez le milieu en milieu neural contenant SB431542 et DMH1 pour favoriser l

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Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Cette vidéo démontre le développement d’une culture neuronale 3D couplée à un réseau de microélectrodes planes avec des neurones de l’hippocampe. Les neurones isolés forment un réseau 2D sur la zone active du réseau de microélectrodes et adhèrent aux microbilles de verre dans une plaque multipuits avec un insert de membrane. Lors du transfert de ces microbilles enrobées de neurones dans l’électrode, elles s’organisent en un réseau neuronal 3D interconnecté.

Construire des réseaux neuronaux tridimensionnels couplés à des réseaux de micro-électrodes

La vidéo montre une méthode pour générer des astrosphères à partir de progéniteurs de cellules souches pluripotentes humaines. Il implique la croissance et la prolifération de cellules souches avec des milieux nutritifs contenant des facteurs de croissance et des inhibiteurs de kinases. Ces cellules s’agrègent et se différencient ensuite en astrocytes, formant des astrosphères.

Génération et maintenance d’astrosphères à l’aide de cellules souches pluripotentes humaines

Cette vidéo montre une procédure de co-culture des astrocytes et des neurones pour former des sphères 3D. Ces sphères 3D fournissent une plate-forme distincte pour l’examen de la formation des synapses et de l’intégration des réseaux neuronaux, servant ainsi de modèle potentiel pour la recherche en neurosciences du développement, en maladies neurodégénératives et en interventions neuropharmacologiques.

Génération de sphères de co-culture 3D d’astrocytes et de neurones pour induire la formation de synapses

Cette vidéo montre la procédure d’utilisation du réseau de multiélectrodes (MEA) pour mesurer la physiologie synaptique dans des sphères de coculture 3D. Cette méthode permet de comprendre la dynamique des réseaux neuronaux et l’activité des rafales de réseaux synaptiques dans les sphères 3D.

Utilisation de réseaux de multiélectrodes pour mesurer la physiologie synaptique dans des sphères de coculture 3D

Cette vidéo démontre l’établissement d’une co-culture neurone-astrocytes pour enregistrer l’activité du réseau neuronal. Lors de l’établissement de la co-culture de motoneurones et d’astrocytes sur une plaque de réseau multi-électrodes (MEA), l’activité électrique rythmique synchrone du réseau neuronal a été enregistrée extracellulaire à l’aide de la MEA.

Enregistrement de l’activité électrophysiologique du réseau neuronal dans une co-culture neurone-astrocytes

Un protocole de génération d’un système de co-culture composé de neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC), de neurones corticaux primaires et d’astrocytes est décrit. Ce système de co-culture permet de détecter la formation de contacts et de circuits synaptiques entre de nouveaux neurones dérivés d’iPSC et des neurones corticaux préexistants exprimant la channelrhodopsine-2.

Une approche pour l&#39;évaluation optogénétiques formation des connexions neuronales dans un système de co-culture

Dans ce travail, un nouveau modèle expérimental dans lequel des cultures neuronales 3D sont couplées à des réseaux de micro-électrodes planes (MEA) est presented. 3D les réseaux sont construits en enracinant des neurones dans un échafaudage composé de microbilles de verre sur lesquelles les neurones se développent et forment des structures 3D interconnectées.

Cultures interface 3D Engineered neuronales à des micro-électrodes tableaux: Une innovante<em&gt; In Vitro</em&gt; Modèle expérimental

Nous modifions et mettre en œuvre un protocole précédemment publié décrivant la différenciation rapide, reproductible et efficace des humains induite par cellules souches pluripotentes (de hiPSCs) dans les neurones corticaux excitateurs 12. Plus précisément, notre modification permet un contrôle de la densité des cellules neuronales et l'utilisation sur des réseaux de micro-électrodes pour mesurer les propriétés électrophysiologiques au niveau du réseau.

Rapid Neuronal Différenciation des Induced cellules souches pluripotentes pour mesurer l&#39;activité réseau sur Arrays Micro-électrode

Nous décrivons une méthode de différenciation des astrocytes et des neurones dérivés pluripotents induits par l’homme et leur co-culture pour l’enregistrement électrophysiologique.

Mise en place d’une plateforme électrophysiologique pour la modélisation de la SLA avec des astrocytes et des neurones dérivés de cellules souches pluripotentes humaines spécifiques à une région

Nous présentons ici un protocole pour produire des cocultures bio-imprimées en 3D de neurones et d’astrocytes dérivés d’iPSC. Ce modèle de coculture, généré à l’intérieur d’un échafaudage d’hydrogel dans des formats de 96 ou 384 puits, démontre une viabilité post-impression élevée et une croissance des neurites en 7 jours et montre l’expression de marqueurs de maturité pour les deux types de cellules.

Bio-impression tridimensionnelle de cocultures neurones-astrocytes humaines dérivées d’iPSC pour des applications de criblage

Découvrez comment modéliser des microcircuits synaptiques en 3D avec des cocultures d'astrocytes et de neurones dérivés de cellules souches pluripotentes humaines. Cette méthode permet d'étudier l'activité des circuits neuronaux.

Modélisation de Microcircuit synaptique avec 3D Cocultures d’Astrocytes et les neurones des cellules souches pluripotentes humaines (Vidéo) | JoVE Journal

Modélisation de Microcircuit synaptique avec 3D Cocultures d’Astrocytes et les neurones des cellules souches pluripotentes humaines

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