Modélisation de Microcircuit synaptique avec 3D Cocultures d’Astrocytes et les neurones des cellules souches pluripotentes humaines

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en neurosciences concernant la façon dont la communication intercellulaire entre plusieurs types de cellules neurales humaines contribue à la formation et au fonctionnement des circuits synaptiques. Cette technique génère rapidement et systématiquement des sphères de coculture tridimensionnelle d’astrocytes et de neurones fonctionnellement matures à partir de cellules souches pluripotentes humaines. Ceux-ci peuvent être utilisés pour des recherches expérimentales rigoureuses.

La reproductibilité et l’évolutivité de ce protocole constituent une alternative définie aux technologies organoïdes émergentes. Ceux-ci sont prometteurs pour le développement de nouveaux médicaments et la thérapie par greffe cellulaire pour favoriser la neurorégénération après une blessure ou une maladie. Commencez par placer des grappes de HPSC dans deux millilitres de milieu HPSC contenant l’inhibiteur de la rho-kinase Y-27632 dans chaque puits d’une plaque à six puits recouverte d’ECM.

Maintenez les cellules souches jusqu’à ce qu’elles soient confluentes à environ 50 %, puis changez le milieu en milieu neural contenant SB431542 et DMH1 pour favoriser l’induction neurale. Lorsque les cellules sont confluentes à environ 95 %, divisez chaque puits de un à six en nouveaux puits recouverts d’ECM. Le 14e jour, dissocier les cellules avec une solution de détachement et transférer le contenu de chaque puits dans une fiole T25 non enrobée avec un milieu contenant de l’Y-27632 pour favoriser la formation d’agrégats.

Pour générer des progéniteurs d’astrocytes et des astrocytes dans des agrégats 3D formés spontanément, passez à un milieu neural contenant EGF et FGF2, et nourrissez-les tous les trois à quatre jours jusqu’à ce que l’identité des astrocytes soit confirmée à quatre à six mois. Par défaut, ce protocole produit des astrocytes corticaux dorsaux. Cependant, les sous-types d’astrocytes peuvent être spécifiés régionalement par l’ajout de morphogènes de motifs, si vous le souhaitez.

Une fois par semaine, lorsque des centres sombres apparaissent, collectez les sphères par centrifugation, puis dissociez doucement les agrégats H-astro avec une solution de détachement. Ne replaquez que les sphères qui ne se fixent pas spontanément pour éviter de faire passer des cellules non SNC et non neurales. Après quatre à six mois d’expansion, confirmer l’identité cellulaire dans un milieu de congélation et de cryoconservation selon les instructions du fabricant, ou utiliser immédiatement pour l’expérimentation.

Pour la génération de progéniteurs neuronaux non transgéniques dans les neurones, ou neurones H, ensemencez les progéniteurs neuronaux dérivés du HPSC du jour 14 dans des plaques à six puits recouvertes d’ECM avec deux millilitres de milieu neural et Y-27632 par puits. Si vous travaillez avec des iNeurones inductibles par la doxycycline, ajoutez un milieu neural contenant de la doxycycline lorsque les cellules sont confluentes à environ 35 % pour induire la différenciation et activer l’expression des gènes. Après deux jours, nourrissez les lignées transgéniques et non transgéniques avec deux millilitres de média neural par puits et par jour.

Continuez jusqu’à ce que les cellules soient prêtes à se soulever à 70 % de confluence. Pour les cocultures, dissociez d’abord doucement les H-astros des agrégats 3D avec la solution de détachement. Procédez ensuite à la dissociation des neurones H, ou iNeurones, d’une monocouche 2D.

Tout d’abord, retirez le milieu de la plaque à six puits et ajoutez 500 microlitres de solution de détachement à chaque puits contenant des cultures monocouches. Incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Après l’incubation, ajoutez doucement deux à trois millilitres de milieu DMEM-F12 pour retirer les cellules attachées.

Ensuite, collectez les cellules dans un milieu dans un tube conique de 15 millilitres et centrifugez à 300 fois G pendant une minute. Aspirez le surnageant, ajoutez un millilitre de milieu frais et pipetez doucement de haut en bas avec une micro-pipette de 1 000 microlitres pour obtenir une suspension unicellulaire. Comptez chaque type de cellule à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules automatisé.

Ajoutez le rapport souhaité de H-astros et de neurones H dissociés, ou iNeurones, dans un volume total de deux millilitres à chaque puits d’une microplaque. Centrifugez la plaque à 100 fois G pendant trois minutes et retournez dans l’incubateur pendant deux jours. Après une journée, des microsphères densément tassées devraient s’être formées dans la plaque.

À l’aide d’une micropipette de 1 000 microlitres, retirez délicatement les sphères des micropuits. Appliquez légèrement une force sur le fond des micro-puits avec un fluide pour éliminer toute sphère collée supplémentaire. Après avoir rassemblé toutes les sphères dans un tube conique de 15 millilitres, laissez déposer.

Ensuite, lavez les sphères en aspirant d’abord l’ancien support, puis en ajoutant au moins deux millilitres de milieu frais. Ajouter les sphères dans une fiole tournante contenant 50 à 60 millilitres de fluide. Placez le ballon dans l’incubateur sur une plaque d’agitation magnétique réglée à 60 tr/min.

Un minimum de trois semaines en culture est nécessaire pour la formation des synapses. Commencez par enduire la surface de chaque réseau de multiélectrodes, ou MEA, d’un millilitre de polyornithine pour rendre la surface hydrophile, et incubez à 37 degrés Celsius pendant au moins quatre heures. Après l’incubation, retirez la polyornithine et lavez la surface de chaque MEA avec de l’eau désionisée.

Ajoutez ensuite un millilitre de matrice extracellulaire et retournez dans l’incubateur pendant au moins quatre heures. Lorsque vous êtes prêt, retirez la matrice extracellulaire, puis appliquez les sphères dans 1,5 millilitre de milieu sur la surface MEA, en vous assurant que les sphères sont positionnées au-dessus du réseau d’électrodes. Laisser adhérer pendant deux jours.

Pour mesurer l’activité électrique des sphères neuronales, placez le MEA sur une scène de tête à température contrôlée. Utilisez un filtre passe-haut de cinq Hertz et un filtre passe-bas de 200 Hertz, ainsi qu’un seuil de pointe de cinq fois l’écart-type, pour enregistrer l’activité électrique spontanée. Enregistrez les données brutes, y compris la fréquence et l’amplitude des pics pour l’analyse statistique.

Les marqueurs protéiques restreints de type cellule neurale, tels que MAP2 pour les neurones et GFAP pour les astrocytes, démontrent visuellement l’arrangement uniformément dispersé et la maturité des astrocytes dans les neurones au sein des sphères 3D. Une projection maximale de la morphologie et de la ramification des astrocytes est représentée dans une sphère 3D représentative avec des H-astros faiblement marqués avec une GFP liée à la membrane. Les H-astros matures expriment des marqueurs, y compris GFAP.

Même si les iNeurons expriment des protéines pré et postsynaptiques, comme le montre l’image de gauche, la densité synaptique est significativement augmentée par la présence de H-astros et la coculture. Pendant les enregistrements, des sphères saines d’iNeurons placées sur des MEA provoqueront spontanément des pics de tension supérieurs à 40 microvolts avec des fréquences de décharge constantes. Les sphères de coculture présentent une plus grande connectivité réseau avec la présence de H-astros, ce qui entraîne une augmentation des rafales synchrones de pointes du réseau.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que l’imagerie calcique peuvent être effectuées afin de mesurer la réponse physiologique des astrocytes à l’activité synaptique. De plus, des transplantations dans des modèles animaux peuvent être menées pour étudier la connectivité avec des circuits synaptiques préexistants. En suivant cette approche de bio-ingénierie, on peut incorporer des biomatériaux extracellulaires et des types de cellules supplémentaires tels que les oligodendrocytes, les cellules microgliennes et les cellules éthéliales dans des ratios spécifiques afin de modéliser la signalisation complexe qui se produit dans le cerveau.