Une sonde de Force directe permettant de mesurer l’intégration mécanique entre le noyau et le cytosquelette

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la mécanique nucléaire. Par exemple, quelle est la force nécessaire pour déformer le noyau d’une cellule ? Quelles sont les contributions des composants cellulaires et nucléaires à la résistance nucléaire à la déformation ?

Ou bien, le couplage nucléaire avec les structures cellulaires varie-t-il selon le type de cellule ? Le principal avantage de cette technique est qu’elle nous permet d’appliquer une force de sondage pour déformer le nucléo-cytosquelette intégrateur dans une cellule adhérente vivante. Bien que cette méthode ait été utilisée pour donner un aperçu des propriétés mécaniques nucléaires des cellules NIH-3T3, elle peut également être appliquée à tout type de cellule adhérente, comme l’exploration des propriétés mécaniques nucléaires dans les cellules progériales Hutchinson-Gilford.

Pour commencer cette procédure, enduisez un plat à fond de verre de 35 millimètres de 5 microgrammes par millilitre de fibronectine. Ensuite, cultivez les cellules de fibroblastes NIH 3T3 dans du DMEM complété par 10 % de sérum de bovin donneur et 1 % de pénicilline-streptomycine sur la boîte enrobée à 37 degrés Celsius jusqu’à la confluence souhaitée. Immédiatement avant l’expérience, lavez les cellules deux fois avec du PBS, puis un seul lavage avec un milieu de croissance complet.

Ensuite, ajoutez trois millilitres de milieu de croissance complet dans un plat à fond de verre. Dans cette procédure, allumez le micro-injecteur. À l’aide d’un compte-gouttes d’huile d’immersion, appliquez une goutte d’huile d’immersion sur l’objectif.

Ensuite, fixez fermement le plat au porte-plat et chargez le porte-plat sur la scène. Veuillez noter que les cellules doivent être maintenues à 37 degrés Celsius et à 5 % de dioxyde de carbone tout au long de l’expérience. Ensuite, ajustez la hauteur de l’objectif pour faire la mise au point sur les cellules.

Déplacez la platine du microscope pour trouver une cellule d’intérêt. À l’aide du micromanipulateur, déplacez le porte-pipette dans la position la plus haute. Ensuite, chargez la micropipette avec une pointe de 0,5 micromètre de diamètre sur le porte-pipette.

Ensuite, élevez le plan focal de l’objectif au-dessus du plan A et le haut de la cellule au plan B en ajustant la commande fine. Ensuite, réglez le micromanipulateur sur la position de contrôle grossier. Abaissez lentement la micropipette jusqu’au plan B en observant la silhouette de la micropipette jusqu’à ce que la micropipette soit complètement nette.

Une fois que la pointe de la micropipette est nette, réglez le micromanipulateur sur un contrôle précis. Par la suite, abaissez l’objectif dans le plan équatorial de la cellule et abaissez la micropipette à environ 15 micromètres au-dessus. Réglez la pression de compensation sur le micro-injecteur à la pression souhaitée.

Attendez quelques secondes que la pression se stabilise. Il est important de vérifier si la pointe de la pipette n’est pas cassée ou bouchée, sinon la mesure de la force serait imprécise. Assurez-vous que la micropipette n’est pas obstruée en utilisant le réglage clean sur le panneau du micromanipulateur et assurez-vous que les bulles d’air sortent de la pointe de la micropipette.

Ensuite, insérez la pointe de la micropipette dans la cellule jusqu’à ce qu’elle touche légèrement la surface nucléaire. Créez un joint entre la pointe de la micropipette et la membrane nucléaire en déconnectant le tube d’alimentation sous pression du système de micro-injection, ouvrant ainsi l’extrémité de la micropipette à l’atmosphère. Cette étape crée une pression négative égale à la pression de compensation sur la surface nucléaire.

Ensuite, ouvrez le logiciel de collecte d’images. Configurez une acquisition AVI pour la vidéo ou une acquisition ND pour les images dans le logiciel de collecte d’images. Ensuite, basculez vers le canal d’imagerie fluorescente correspondant et commencez l’imagerie.

Éloignez la pointe de la micropipette du corps de la cellule jusqu’à ce que le noyau se détache de la micropipette. Cette figure montre le forçage d’un noyau de fibroblaste de souris NIH 3T3. Lorsque la pointe de la micropipette se déplace vers la droite, le noyau se déforme et finit par se détacher de la pointe de la micropipette.

On voit que la déformation de la longueur du noyau augmente avec l’augmentation de la force d’aspiration. Le bord avant du noyau forme une saillie nucléaire et le bord de fuite est déplacé de sa position d’origine. La longueur de la saillie est beaucoup plus grande que le déplacement du bord de fuite, ce qui suggère une intégration étroite entre le noyau et le cytoplasme environnant.

Les échelles de temps sont courtes pour l’assouplissement du bord avant nucléaire et du bord arrière nucléaire. Une sonde à force directe a été utilisée pour déterminer la contribution des structures intranucléaires et cytosquelettiques à la résistance du noyau à la déformation. Des images fluorescentes ont montré le recouvrement du noyau avant et après dans les conditions indiquées.

Bien qu’aucune différence significative dans la déformation ou la traduction nucléaire n’ait été observée après la rupture de l’actine F ou la perturbation des microtubules, la réduction de l’expression du menten par l’inactivation basée sur les siRNA a entraîné une traduction et une déformation nucléaires significativement plus importantes. Cela suggère que les filaments intermédiaires du mentène dans les fibroblastes sont le principal élément cytosquelettique qui a aidé le noyau à résister à la force locale. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’appliquer une force contrôlée et connue au noyau d’une cellule adhérente vivante.