Name: Une sonde de Force directe permettant de mesurer l’intégration mécanique entre le noyau et le cytosquelette (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Découvrez une technique de micropipette pour mesurer les propriétés mécaniques du noyau dans des cellules adhérentes vivantes. Cette méthode permet d'explorer l'intégration nucléo-cytosquelettique et la résistance nucléaire à la déformation.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ce travail a été soutenu par les NIH R01 EB014869.

1. préparation des cellules pour l’imagerie
Remarque : La sonde de force directe (DFP) peut être utilisée pour n’importe quel type de cellules adhérentes. Ici, les fibroblastes de souris NIH 3 t 3 sont utilisées comme la lignée cellulaire de modèle pour ce protocole.
<ol><li>Cellules de fibroblastes culture NIH 3 t 3 dans de l’aigle de la modification de Dulbecco Medium (DMEM) additionné de 10 % de sérum de bovin donneur et 1 % la pénicilline-streptomycine sur un fond de verre 35 mm plat jusqu'à confluence désirée. Maintenir les cellules à 37 ° C et 5 % de CO2.<ol>
<li>N’oubliez pas de recouvrir tous les plats de fond verre 35 mm avec 5 µg/mL de la fibronectine (ou protéine ECM similaire), avant d’ensemencer les cellules 3 t 3 NIH pour l’imagerie. Remarque : Les cellules doivent être entièrement étalés et adhérente sur le plat pour l’expérience. Il n’y a pas toutes les contraintes en termes de confluence pour la méthode DFP fonctionne.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Immédiatement avant l’expérience, laver les cellules deux fois avec du PBS suivie d’un lavage simple avec milieu de culture complet.</li>
	<li>Ajouter 3 mL de milieu de culture complet au verre fond plat.</li>
</ol>2. microscopie et Acquisition d’images
Remarque : Un inversé fluorescence microscope (ou équivalent) avec micromanipulateur installée sur le bras de côté, selon les recommandations du fabricant. Le microscope devrait également être équipé d’une chambre environnementale pour maintenir la température à 37 ° C et la teneur en CO2 à 5 %. Il faut aussi un micromanipulateur et microinjector attaché au microscope. Une huile d’immersion 40 x / 1.3 NA ou x 60 / 1,49 NA (ou objectifs équivalents) sont recommandés pour les expériences. Le microscope doit être posé sur une table d’isolement de vibration.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58038/58038fig1.jpg"> Figure 1 . Déformation nucléaire et mise au point du Microscope A. le maximum déformation nucléaire et relaxation de déformation nucléaire. Avant de calculer la déformation maximale de nucléaire, des rebords arrières des formes nucléaires ont été tout d’abord a coïncidé pour corriger la traduction de noyau déformé. La forme du noyau au moment du détachement de pointe une micropipette été ajoutée à la forme initiale du nucléaire avant de tirer. La différence dans la zone entre les deux formes a été mesurée comme ΔA1. La déformation maximale du nucléaire a été définie comme ΔA1 divisé par la zone d’origine nucléaire. De même, un deuxième paramètre, ΔA2, peut être définie en superposant la forme nucléaire de l’état d’équilibre final après détachement micropipette forme d’origine nucléaire. B. concentrer la cellule au plan A, puis déplacez le plan focal, plan B pour trouver l’extrémité de la micropipette. Au cours de l’imagerie, la micropipette a été traduite vers la droite (sens de la flèche orange). Ce chiffre a été modifié par Neelam et al. 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58038/58038fig1large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<ol><li>Allumez le microinjector selon le protocole du fabricant.</li>
	<li>Avec un compte-gouttes d’huile d’immersion, appliquez une goutte d’huile à immersion sur le dessus de l’objectif.</li>
	<li>Brider le plat hermétiquement dans le porte-savon et charger le porte-savon sur scène. Remarque : Les cellules doivent être maintenues à 37 ° C et 5 % de CO2 dans l’ensemble de l’expérience.</li>
	<li>Régler la hauteur de l’objectif d’apporter les cellules dans le foyer (plan A, Figure 1 b).</li>
	<li>Déplacer la platine du microscope pour rechercher une cellule d’intérêt.</li>
	<li>Tournez la manette sur le micromanipulateur pour déplacer le titulaire de la pipette vers la première position. Charger une micropipette de pointe 0,5 µm de diamètre au support de la pipette.<ol>
<li>Pour éviter l’adhérence cellulaire à la micropipette, Prétraitez la pointe d’une micropipette et 0,3 mg/mL solution de PLL-g-PEG pendant 1 h à température ambiante. Test d’adhérence en touchant la micropipette vers le noyau sans aucune pression d’aspiration et ensuite traduire la micropipette loin du noyau. On peut discerner l’absence d’adhérence d’un manque complet de déformation nucléaire et de la traduction. Remarque : Veuillez suivre les suggestions de fabrication à l’ouverture du paquet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Soulever l’objectif plan focal au-dessus A de l’avion et la partie supérieure de la cellule d’avion B en réglant la commande fine (Figure 1 b, voir étape 2,4).</li>
	<li>Affectez le micromanipulateur contrôle grossier . Amenez lentement la micropipette jusqu'à plan B en regardant pour la silhouette de la micropipette, jusqu'à ce que la micropipette soit parfaitement net.</li>
	<li>Une fois la pointe d’une micropipette mise au point, régler le micromanipulateur pour un contrôle précis .</li>
	<li>Abaisser l’objectif du plan équatorial de la cellule (plan A, Figure 1 b) et abaissez la micropipette à environ 15 µm au-dessus plan A (Figure 1 b, micropipette en pointillés).</li>
	<li>Réglez la pression de compensation (Pc) sur la microinjector à la pression désirée ; attendre quelques secondes pour que la pression se stabilise. Remarque : La consigne de pression optimale dépend de type de cellule et les objectifs spécifiques de l’expérience. Pour la plupart des cas, 300 hPa serait un bon point de départ.</li>
	<li>Veiller à ce que la micropipette n’est pas bouchée en utilisant le paramètre Clean sur le panneau de micromanipulateur et vérification pour vous assurer que les bulles d’air sortent de la pointe de la micropipette.</li>
	<li>Introduire l’embout dans la cellule en abaissant progressivement la micropipette jusqu'à ce que la pointe touche légèrement la surface nucléaire. Remarque : Lorsque vous abaissez la micropipette, la silhouette de la pointe d’une micropipette deviendra claire qu’il s’agit dans le foyer. Avant que la micropipette touche le noyau, soulever la discussion objective et alignez la pointe d’une micropipette avec noyau (même coordonnée de x-y, z-plan plus élevé). Retourner le focus vers le plan équatorial du noyau (plan A, Figure 1 b) et de diminuer progressivement la pointe d’une micropipette.</li>
	<li>Assurer l’étanchéité entre la pointe d’une micropipette et la membrane nucléaire en déconnectant le tube de pression-alimentation du système de micro-injection, ouvrant ainsi l’extrémité du tube une micropipette dans l’atmosphère. Cette étape crée une pression négative égale à Pc sur la surface nucléaire.</li>
	<li>Acquisition d’images avec le logiciel de collecte d’image de microscopes. Mettre en place un avi-acquisition (vidéo) ou nd-acquisition (images) dans le logiciel de collecte d’image. Remarque : Pour toute acquisition de logiciels de l’imagerie, mis en place une imagerie vidéo en temps réel ou d’acquisitions en Time-lapse image avec un intervalle de temps court.</li>
	<li>Activer/désactiver à l’imagerie canal de fluorescente correspondant (c'est-à-dire, GFP, DP, etc.) et commencez à l’imagerie.</li>
	<li>Définition de la pointe d’une micropipette loin du corps de la cellule (à droite, Figure 1 b) jusqu'à ce que le noyau se détache de la micropipette. Remarque : Tirer la pointe le long de l’axe x positif (vers la droite dans le champ de vision). Le taux de traction peut être programmé et contrôlé par ordinateur ou le joystick peut être déplacé manuellement. Nous n’avons trouvé aucune corrélation entre la traction taux et déformation nucléaire15 suggérant une réponse essentiellement élastique pour forcer.</li>
</ol>3. analyse des données
<ol><li>Effectuer l’analyse d’images avec n’importe quel logiciel de traitement d’image base disponible. La mesure de la déformation nucléaire peut être quantifiée par la souche de longueur (Ɛ) ou la souche de la région (Figure 1 a). Quantifier la souche de longueur à l’aide de l’équation 1, où L et L0 représentent les longueurs du noyau à la déformation maximale et la position initiale, respectivement. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58038/58038eq1.jpg">(Équation 1)</li>
</ol>

<ol><li>Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+envelope+environment+and+its+cancer+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">The nuclear envelope environment and its cancer connections.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).</li>
<li>Zink, D., Fischer, A. H., Nickerson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+structure+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Nuclear structure in cancer cells.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (9), 677-687 (2004).</li>
<li>Bank, E. M., Gruenbaum, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+lamina+and+heterochromatin%3A+a+complex+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">The nuclear lamina and heterochromatin: a complex relationship.</a> Biochemical Society Transactions. 39 (6), 1705-1709 (2011).</li>
<li>Lammerding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamins+A+and+C+but+not+lamin+B1+regulate+nuclear+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Lamins A and C but not lamin B1 regulate nuclear mechanics.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (35), 25768-25780 (2006).</li>
<li>Dahl, K. N., Engler, A. J., Pajerowski, J. D., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Power-law+rheology+of+isolated+nuclei+with+deformation+mapping+of+nuclear+substructures%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Power-law rheology of isolated nuclei with deformation mapping of nuclear substructures.</a> Biophysical Journal. 89 (4), 2855-2864 (2005).</li>
<li>Crisp, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+the+nucleus+and+cytoplasm%3A+role+of+the+LINC+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex.</a> Journal of Cell Biology. 172 (1), 41-53 (2006).</li>
<li>Sosa, B. A., Rothballer, A., Kutay, U., Schwartz, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LINC+complexes+form+by+binding+of+three+KASH+peptides+to+domain+interfaces+of+trimeric+SUN+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">LINC complexes form by binding of three KASH peptides to domain interfaces of trimeric SUN proteins.</a> Cell. 149 (5), 1035-1047 (2012).</li>
<li>Tapley, E. C., Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connecting+the+nucleus+to+the+cytoskeleton+by+SUN-KASH+bridges+across+the+nuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Connecting the nucleus to the cytoskeleton by SUN-KASH bridges across the nuclear envelope.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 57-62 (2013).</li>
<li>Arsenovic, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nesprin-2G%2C+a+Component+of+the+Nuclear+LINC+Complex%2C+Is+Subject+to+Myosin-Dependent+Tension%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension.</a> Biophysical Journal. 110 (1), 34-43 (2016).</li>
<li>Rowat, A. C., Lammerding, J., Ipsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+the+cell+nucleus+and+the+effect+of+emerin+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of the cell nucleus and the effect of emerin deficiency.</a> Biophysical Journal. 91 (12), 4649-4664 (2006).</li>
<li>Rowat, A. C., Foster, L. J., Nielsen, M. M., Weiss, M., Ipsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+elastic+properties+of+the+nuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Characterization of the elastic properties of the nuclear envelope.</a> Journal of the Royal Society Interface. 2 (2), 63-69 (2005).</li>
<li>Pagliara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auxetic+nuclei+in+embryonic+stem+cells+exiting+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Auxetic nuclei in embryonic stem cells exiting pluripotency.</a> Nature Materials. 13 (6), 638-644 (2014).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+mechanical+characterization+of+the+cell+nucleus+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">In situ mechanical characterization of the cell nucleus by atomic force microscopy.</a> ACS Nanotechnology. 8 (4), 3821-3828 (2014).</li>
<li>Krause, M., Te Riet, J., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+compressibility+of+tumor+cell+nuclei+by+combined+atomic+force-confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Probing the compressibility of tumor cell nuclei by combined atomic force-confocal microscopy.</a> Physical Biology. 10 (6), 065002(2013).</li>
<li>Neelam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+force+probe+reveals+the+mechanics+of+nuclear+homeostasis+in+the+mammalian+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Direct force probe reveals the mechanics of nuclear homeostasis in the mammalian cell.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5720-5725 (2015).</li>
<li>Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+plasticity+of+the+nucleus+in+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (40), 15619-15624 (2007).</li>
<li>Lammerding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamin+A%2FC+deficiency+causes+defective+nuclear+mechanics+and+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction.</a> Journal of Clinical Investigation. 113 (3), 370-378 (2004).</li>
<li>Chancellor, T. J., Lee, J., Thodeti, C. K., Lele, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actomyosin+tension+exerted+on+the+nucleus+through+nesprin-1+connections+influences+endothelial+cell+adhesion%2C+migration%2C+and+cyclic+strain-induced+reorientation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Actomyosin tension exerted on the nucleus through nesprin-1 connections influences endothelial cell adhesion, migration, and cyclic strain-induced reorientation.</a> Biophysical Journal. 99 (1), 115-123 (2010).</li>
<li>Neelam, S., Dickinson, R. B., Lele, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+approaches+for+understanding+the+nuclear+force+balance+in+living%2C+adherent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">New approaches for understanding the nuclear force balance in living, adherent cells.</a> Methods. 94, 27-32 (2016).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Mesurer l’intégration mécanique du noyau avec le cytosquelette est un défi pour les méthodes plus récentes, par exemple une micropipette aspiration16, car ils nécessitent deux noyaux isolés (où le noyau est découplé du cytosquelette) ou noyaux dans les cellules suspendues (où les forces extracellulaires, telles que les forces de traction, sont absents). Force a été appliquée au noyau en appliquant biaxiale souche aux adhérentes de cellules à une membrane17,<sup c...

Pathologies telles que le cancer impliquent des modifications de forme nucléaire et composition1,2, qui sont généralement accompagnés par un ramollissement du noyau3,4. La résistance à la déformation mécanique nucléaire a été généralement caractérisée en appliquant une force de noyaux isolés5.
Le noyau dans les cellules est moléculairement relié au cytosquelette par l’éditeur de liens de Nucleoskeleton et cytosquelette (LINC) complexe6,7,8,9. Ainsi, le noyau est mécaniquement intégré avec le cytosquelette et, à travers les adhérences cellule-substrat, la matrice extracellulaire. Mécaniquement sonder le noyau à l’intérieur de cellules adhérentes peut donner un aperçu de cette intégration mécanique. Méthodes pour manipuler des noyaux dans les cellules vivantes incluent une micropipette aspiration10,11et la microscopie de force atomique12,13,14. Nous avons récemment décrit une sonde de force directe (DFP) qui s’applique à des forces mécaniques directement sur le noyau en une vie cellulaire adhérente15.
Ici, nous décrivons la procédure d’utilisation d’un système de micro-injection qui est couramment disponible dans les installations de microscopie d’appliquer une force mécanique de nano-échelle connue, directement vers le noyau dans une cellule adhérente. Un femtotip (0,5 µm de diamètre micropipette Astuce) est monté et raccordé au système de micro-injection par un tube. La pointe, placée à un angle de 45° par rapport à la surface de la boîte de Petri, est abaissée jusqu'à adjacente à la surface nucléaire. Le tube est ensuite déconnecté et ouvert à l’atmosphère, ce qui crée une dépression d’aspiration sur la surface nucléaire et scelle l’embout de micropipette contre la surface nucléaire. D’une traduction de la pointe d’une micropipette, le noyau est déformé et éventuellement (en fonction de l’ampleur de la force appliquée), détaché de la micropipette. Ce détachement se produit lorsque les forces de restauration (résister), exercées par le noyau et la cellule, égale à la force d’aspiration de la micropipette. Analyse peut être réalisée en mesurant le déplacement du noyau, la souche de longueur (équation 1), ou la souche de la région (Figure 1 a).

<table><tbody><tr><td>FluoroDish</td><td></td><td>WPI FD35</td><td></td></tr><tr><td>SYTO 59</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11341</td><td></td></tr><tr><td>Femtotips&nbsp ;</td><td>Eppendorf</td><td>930000043</td><td></td></tr><tr><td>InjectMan NI2</td><td>Eppendorf</td><td>NA</td><td>discontinué, modèle équivalent actuel : InjectMan 4</td></tr><tr><td>FemtoJet</td><td>Eppendorf</td><td>NA</td><td>Modèle actuel FemtoJet 4i</td></tr><tr><td>Plan Immersion dans l’huile fluorée 40x</td><td>Nikon</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Apo TIRF immersion dans l’huile 60x</td><td>Nikon</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Sérum bovin donneur (DBS)</td><td>ThermoFisher Scientifique</td><td>16030074</td><td>NIH 3T3 sérum</td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modification of Eagle’s (DMEM)</td><td>Mediatech cellgro</td><td>MT10013CVRF</td><td>NIH 3T3 milieu</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine&nbsp ;</td><td>Mediatech</td><td>MT30004CIRF</td><td>NIH 3T3 medium supplément</td></tr><tr><td>Huile d’immersion Type LDF Non-Fluorescent</td><td>Nikon</td><td>77007</td><td>Huile d’immersion pour objectif objectif&nbsp ;</td></tr></tbody></table>

une sonde de force directe permettant de mesurer l’intégration mécanique entre le noyau et le cytosquelette

A Direct Force Probe for Measuring Mechanical Integration Between the Nucleus and the Cytoskeleton

Les propriétés mécaniques du noyau déterminent sa réponse aux forces mécaniques générées dans les cellules. Parce que le noyau est moléculairement continu avec le cytosquelette, les méthodes sont nécessaires pour sonder son comportement mécanique dans les cellules adhérentes. Ici, nous discutons la sonde force directe (DFP) comme outil d’employer la force directement vers le noyau dans une cellule adhérente vivante. Nous attachons une micropipette étroite à la surface nucléaire avec aspiration. Une micropipette est traduite loin du noyau, ce qui provoque le noyau à déformer et à traduire. Lorsque la force de rappel est égale à la force d’aspiration, le noyau se détache et élastique se détend. Parce que la pression d’aspiration est connue avec précision, la force sur la surface nucléaire est connue. Cette méthode a révélé que les forces de la nano-échelle suffisent à déformer et à traduire le noyau dans les cellules adhérentes et identifié des éléments du cytosquelette qui permettent le noyau à résister aux forces. Le DFP peut servir à disséquer les contributions des composantes cellulaires et nucléaires nucléaire propriétés mécaniques dans les cellules vivantes.

Figure 2 a montre le forçage d’un noyau de fibroblastes de souris de 3 t 3 NIH. Comme la pointe d’une micropipette est traduite vers la droite, le noyau se déforme et finit par se détache de l’extrémité de la micropipette. La souche de la longueur du noyau semble augmenter avec l’augmentation de la force d’aspiration (Figure 2 b). Le bord avant du noyau (en tirant avantage de micropipette) forme une protubérance nucléaire et le b...

Dans ce protocole, nous décrivons une méthode d’une micropipette pour appliquer directement une force contrôlée dans le noyau dans une cellule vivante. Ce dosage permet aux interrogatoires des propriétés mécaniques nucléaires dans la cellule vivante, adhérente.

Une sonde de Force directe permettant de mesurer l’intégration mécanique entre le noyau et le cytosquelette

The mechanical properties of the nucleus determine its response to mechanical forces generated in cells. Because the nucleus is molecularly continuous ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la mécanique nucléaire. Par exemple, quelle est la force nécessaire pour déformer le noyau d’une cellule ? Quelles sont les contributions des composants cellulaires et nucléaires à la résistance nucléaire à la déformation ?Ou bien, le couplage nucléaire avec les structures cellulaires varie-t-il selon le type de cellule ? Le principal avantage de cette technique est qu’elle nous permet d’appliquer une force de sondage pour déformer le nucléo-cytosquelette intégrateur dans une cellule adhérente vivante. Bien que cette méthode ait été utilisée pour donner un aperçu des propriétés mécaniques nucléaires des cellules NIH-3T3, elle peut également être appliquée à tout type de cellule adhérente, comme l’exploration des propriétés mécaniques nucléaires dans les cellules progériales Hutchinson-Gilford.Pour commencer cette procédure, enduisez un plat à fond de verre de 35 millimètres de 5 microgrammes par millilitre de fibronectine. Ensuite, cultivez les cellules de fibroblastes NIH 3T3 dans du DMEM complété par 10 % de sérum de bovin donneur et 1 % de pénicilline-streptomycine sur la boîte enrobée à 37 degrés Celsiu

a-direct-force-probe-for-measuring-mechanical-integration-between

Research

Recherche

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimie

Nous présentons deux indépendantes, basées sur le microscope des outils pour mesurer les déformations induites nucléaire et du cytosquelette dans la seule, vivant des cellules adhérentes en réponse à l'application de déformation globale ou localisée. Ces techniques sont utilisées pour déterminer la rigidité nucléaire (ie, déformabilité) et de transmission de la force de sonde intracellulaire entre le noyau et le cytosquelette.

Tests biophysiques pour sonder les propriétés mécaniques du noyau cellulaire interphase: Application Strain Substrat et manipulation Microneedle

Un certain nombre de biocapteurs de force basés sur FRET ont récemment été développés, permettant la résolution spécifique des protéines de la force intracellulaire. Dans ce protocole, nous démontrons comment l’un de ces capteurs, conçu pour l’agent de liaison de la protéine du complexe nucléosquelette-cytosquelette (LINC) Nesprin-2G, peut être utilisé pour mesurer les forces de l’actomyosine sur le complexe nucléaire LINC.

Un protocole pour l&#39;utilisation Förster Resonance Energy Transfer (FRET) -force biocapteurs pour mesurer les forces mécaniques à travers le complexe nucléaire LINC

Nous présentons ici un protocole afin de caractériser les particules nucleosome à l’échelle de la molécule unique à l’aide de la microscopie à force atomique statiques et time-lapse (AFM) techniques d’imagerie. La méthode de la fonctionnalisation de surface décrite permet la capture de la structure et la dynamique des nucléosomes dans haute résolution à l’échelle nanométrique.

Sonder la Structure et la dynamique des nucléosomes à l’aide de la microscopie de Force atomique d’imagerie

Présenté ici est un protocole pour évaluer les propriétés contractiles des myofibrils musculaires striés avec la résolution nano-Newton. Le protocole utilise une configuration avec une sonde de force optique basée sur l’interférométrie. Cette configuration génère des données avec un rapport signal/bruit élevé et permet d’évaluer la cinétique contractile des myofibrils.

Isoler les myofibrils des biopsies des muscles squelettiques et déterminer la fonction contractile avec un transducteur de force de résolution nano-newton

Cet article décrit un protocole détaillé pour l’utilisation de sondes de tension basées sur l’ADN pour imager les forces réceptrices appliquées par les cellules immunitaires. Cette approche permet de cartographier les forces du récepteur &gt;4,7pN en temps réel et d’intégrer les forces au fil du temps.

Sondes de tension de l’ADN pour cartographier les forces transitoires du récepteur Piconewton par les cellules immunitaires

Nous présentons ici un protocole pour étudier les propriétés mécaniques intracellulaires de cellules embryonnaires isolées de poisson-zèbre en confinement tridimensionnel avec mesure directe de la force par un piège optique.

Mesures de force directe de la mécanique subcellulaire en confinement à l’aide de pinces optiques

Nous présentons ici un protocole pour reconstituer des faisceaux de microtubules in vitro et quantifier directement les forces exercées en leur sein en utilisant le piégeage optique simultané et la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale. Ce test permet de mesurer à l’échelle nanométrique les forces et les déplacements générés par les ensembles de protéines au sein de réseaux de microtubules actifs.

Mesure directe des forces dans les faisceaux de microtubules actifs reconstitués

Cette étude présente un nouveau protocole pour appliquer directement une force mécanique sur le noyau cellulaire par le biais de microbilles magnétiques livrées dans le cytoplasme et pour effectuer simultanément l’imagerie fluorescente de cellules vivantes.

Combinaison d’un actionneur de force magnétique 3D et d’une imagerie par fluorescence multifonctionnelle pour étudier la mécanobiologie du noyau

L'interaction entre les canaux HCN et leur sous-unité auxiliaire a été identifié comme une cible thérapeutique dans le trouble dépressif majeur. Ici, une méthode basée sur la polarisation de fluorescence pour identifier les petites molécules inhibitrices de cette interaction protéine-protéine, est présentée.

Procédé pour l&#39;identification d&#39;inhibiteurs de petites molécules de l&#39;interaction protéine-protéine entre HCN1 et TRIP8b

flexibilité conformationnelle joue un rôle essentiel dans la fonction des protéines. Nous décrivons ici l'utilisation de la spectrométrie de masse à ionisation par électronébulisation couplée à l'échange hydrogène-deutérium résolue dans le temps pour sonder les changements structurels rapides qui favorisent la fonction des protéines ordonné et désordonné.

Résolue en temps d&#39;échange hydrogène Ionisation ElectroSpray-deuterium spectrométrie de masse pour l&#39;étude de la structure des protéines et dynamique

Découvrez une technique de micropipette pour mesurer les propriétés mécaniques du noyau dans des cellules adhérentes vivantes. Cette méthode permet d'explorer l'intégration nucléo-cytosquelettique et la résistance nucléaire à la déformation.

Une sonde de Force directe permettant de mesurer l’intégration mécanique entre le noyau et le cytosquelette

Explorer plus de vidéos