Name: Biologie cellulaire quantitative de neurodégénération chez la drosophile grâce à l’analyse impartiale des protéines fluorescent étiquetées à l’aide de ImageJ (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Découvrez une méthode d'analyse d'images semi-automatisée pour quantifier les agrégats protéiques et le flux autophagique dans des modèles de Drosophila. Cette approche réduit les biais de sélection et améliore la reproductibilité dans l'étude des mécanismes de neurodégénérescence.

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Ce travail est soutenu par la Sheila et David Fuente Neuropathic Pain Research Programme Graduate Fellowship (à J.M.B.), les Lois Pope LIFE Fellows Program (à C.L., Y.Z. et J.M.B.), la bourse prédoctorale de Snyder-Robinson Foundation (à C.L.), le Dr John T . La Fondation Macdonald (à C.L.), contrats, subventions du National Institutes of Health (NIH) HHSN268201300038C, R21GM119018 et R56NS095893 (pour R.G.Z.) et par projet d’érudit Taishan (Province du Shandong, République populaire de Chine) (de R.G.Z.).

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le protocole décrit ici peut servir à solidement et de façon reproductible quantifier les processus biologiques cellulaires visualisées par l’imagerie par fluorescence. Contexte biologique et limitations techniques doivent être examinés attentivement pour guider la conception expérimentale. Marqueurs fluorescents des structures subcellulaires d’intérêt, si immunohistochimiques, teintée ou génétiquement ils sont exprimés, doivent être distinguables au-dessus de fond par la morphologie et l’intensité. Le système UAS/GA...

Maladies neurodégénératives touchent des millions de personnes chaque année et l’incidence augmente avec un vieillissement de la population1. Alors que chaque maladie neurodégénérative a une étiologie unique, agrégation de protéines mal repliées et ventilation du réseau protéostasie caractérisent commune pathologique d’un grand nombre de ces maladies. Élucider comment les perturbations de ces processus fondamentaux et interdépendants se dérègle pour contribuer à la mort neuronale de la dysfonction et de cellules est essentiel pour comprendre les maladies neurodégénératives, en plus de guider les interventions thérapeutiques. Imagerie par fluorescence permet l’étude de ces processus complexes et dynamiques dans les neurones et a grandement contribué à notre compréhension de la biologie cellulaire neuronale. L’analyse des protéines fluorescent étiquetés est un défi, particulièrement lorsque les expériences sont réalisées in vivo, en raison des tissus hautement compacts, types de diverses cellules et hétérogénéité morphologique. Quantification assistée manuellement est abordable et simple, mais il est souvent fastidieux et sous réserve de partialité humaine. Par conséquent, il y a une nécessité d’approches non biaisées, reproductibles et accessibles permettant d’extraire des données quantifiables des études d’imagerie.
Nous avons esquissé un workflow simple et adaptable à l’aide de Fidji/ImageJ, une image puissante et librement accessible, traitement logiciel2,3, pour extraire des données quantitatives d’études par imagerie de fluorescence sur des modèles expérimentaux de neurodégénérescence à l’aide de drosophile. En suivant ce protocole afin de quantifier l’agrégation des protéines et du flux autophagique — deux cellules caractéristiques biologiques qui sont très pertinents à la pathologie de la maladie neurodégénérative — nous avons démontré la sensibilité et la reproductibilité de cette démarche. Analyse des protéines fluorescent étiqueté de la huntingtine mutante (Htt) dans le lobe optique de drosophile a révélé le nombre, la taille et l’intensité des agrégats de protéine. Nous avons visualisé un journaliste fluorescent en tandem du flux autophagie dans le système visuel de drosophile , qui affiche des signaux d’émission différentes selon l' environnement compartimenté4. Analyse comparative ratiométrique du reporter en tandem permettant une vision quantitative et globale du flux d’autophagie-lysosome de formation de l’autophagosome, la maturation et le transport à la dégradation dans le lysosome et a en outre souligné vulnérables compartiments perturbées dans les maladies neurodégénératives. Ce qui est important, dans les deux analyses, nous avons implémenté seuillage semi-automatisée et étapes de la segmentation dans notre protocole à minimiser le biais inconscient, augmenter la puissance de l’échantillonnage et fournir une norme pour faciliter les comparaisons entre des études similaires. Le flux de travail simple est destiné à rendre puissant plugins de Fidji/ImageJ (développés par des informaticiens basés sur des algorithmes mathématiques) plus accessibles aux neurobiologistes et la communauté des sciences de la vie en général.

<table><tbody><tr><td>SYLGARD(R) 184 Kit d’élastomère de silicone</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>PF184250</td><td>Plat de dissection</td></tr><tr><td>Falcon 35 mm Non traité TC Easy-Grip Style Boîte de Petri bactériologique</td><td>Corning</td><td>351008</td><td>Plat de dissection</td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td>Outil de dissection</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>Solution</td></tr> <tr><td>PBSPhosphate de sodium dibasique</td><td>Sigma</td><td>S5136</td><td>PBS solution</td></tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>PBS solution</td></tr><tr><td>Triton&nbsp ; X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>Solution de lavage et d’incuba d’anticorps.</td></tr><tr><td>37 % Formaldéhyde</td><td>VWR</td><td>10790-710</td><td></td></tr><tr><td>Fixation Tubes à microcentrifuger jetables (0.5mL, bleu)</td><td>VWR</td><td>89000-022</td><td>Fixation, lavage et incuba d’anticorps.&nbsp ;</td></tr><tr><td>Micro-lames unies et givrées (25&fois ; 75mm)</td><td>VWR</td><td>48312-004</td><td>Lames pour imagerie confocale</td></tr><tr><td>Micro Cover Glasses, rectangulaires (22&times ; 40mm)</td><td>VWR</td><td>48393-172</td><td>Lames pour l’imagerie confocale</td></tr><tr><td>Caoutchouc Ciment</td><td>Slime</td><td>1051-A</td><td>Montage</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade Montage Medium</td><td>Vector Laboratories, Inc.</td><td>H-1000</td><td>Montage</td></tr><tr><td>Scotch Magic 810 Invisible Tape (19mm&times ; 25.4m)</td><td>3M Company</td><td>810</td><td>Montage</td></tr><tr><td>Sérum de chèvre normal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PCN5000</td><td>Incubaton</td></tr><tr><td>d’anticorps DAPI (4',6-Diamidino-2-Phénylindole, Dichlorhydrate)&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td>Coloration aux acides nucléiques. Dissoudre dans de l’eau désionisée pour obtenir une solution mère de 5 mg/mL et conserver à -80°C. Diluer à une concentration de travail de 10-20 &mu ; g/mL dans PBTx.</td></tr><tr><td>3.5x-90x stéréo zoom inspection microscope industriel</td><td>amscope</td><td>sm-1bnz</td><td>. Équipé d’un double illuminateur LED à col de cygne 6W</td></tr><tr><td>ImageJ/Fiji</td><td>NIH</td><td>v1.51u</td><td>Avec SCF_MPI_CBG plugins (version 1.1.2)</td></tr><tr><td>FV1000-IX81 Microscope à balayage confocal-laser</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Construct</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>BL37749</td><td></td></tr></tbody></table>

biologie cellulaire quantitative de neurodégénération chez la drosophile grâce à l’analyse impartiale des protéines fluorescent étiquetées à l’aide de imagej

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

Avec l’augmentation de la prévalence des maladies neurodégénératives, c’est de plus en plus important de comprendre la physiopathologie sous-jacente qui mène à la perte et la dysfonction neuronale. Technologies et outils d’imagerie par fluorescence permettent une analyse inédite des processus neurobiologiques subcellulaires, mais il n’y a toujours un besoin d’approches non biaisées, reproductibles et accessibles permettant d’extraire des données quantifiables des études d’imagerie . Nous avons développé un workflow simple et adaptable pour extraire des données quantitatives de basés sur la fluorescence des études d’imagerie utilisant des modèles de drosophile de la neurodégénérescence. Plus précisément, les auteurs décrivent une approche facile à suivre, semi-automatique à l’aide de Fidji/ImageJ pour analyser deux processus cellulaires : tout d’abord, nous quantifier la teneur totale en protéines et profil dans le lobe optique de drosophile à l’aide de mutant fluorescentes-tag protéines de la huntingtine ; et en second lieu, nous évaluons le flux de l’autophagie-lysosome dans le système visuel de drosophile avec quantification ratiométrique-basé d’un reporter fluorescent en tandem de l’autophagie. Ce qui est important, le protocole décrit ici comprend une étape de segmentation semi-automatique pour s’assurer que toutes les structures fluorescents sont analysées afin de minimiser les biais de sélection et d’augmenter la résolution des comparaisons subtiles. Cette approche peut être étendue pour l’analyse des autres structures biologiques cellulaires et processus impliqués dans la neurodégénérescence, tels que punctums protéiques (granules de stress et complexes synaptiques), compartiments ainsi que membranaires (mitochondries et trafic des vésicules membranaires). Cette méthode fournit un standard, pourtant référence adaptable point pour l’analyse d’images et de la quantification et pourrait faciliter la fiabilité et la reproductibilité dans le champ et finalement renforcer l’interprétation mécaniste de la neurodégénérescence.

Quantification du nombre, espace et intensité des agrégats de Htt mutants fluorescent étiquetés dans le lobe optique de drosophile
Pour étudier l’agrégation des protéines mal repliées dans le système nerveux central d’un modèle drosophile de la maladie de Huntington, DP-tag mutant Htt humaine avec un non pathologiques (SAMU-DP-hHttQ15) ou l’expansion pathologique ( UAS-RFP-hHttQ138) et la membran...

Nous avons développé un workflow simple et adaptable pour extraire des données quantitatives d’études biologiques de fluorescence dotés d’imagerie cellulaire d’agrégation des protéines et du flux autophagie dans le système nerveux central de Drosophila modèles de neurodégénérescence.

Biologie cellulaire quantitative de neurodégénération chez la drosophile grâce à l’analyse impartiale des protéines fluorescent étiquetées à l’aide de ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

Nous avons développé cette méthode pour extraire des données quantitatives d’études d’imagerie basées sur la fluorescence afin d’extraire des processus biologiques cellulaires complexes et dynamiques dans des modèles de neurodégénérescence de la drosophile. Le principal avantage de cette technique est qu’elle dispose d’un flux de travail d’analyse d’images adaptable et semi-automatisé qui permet de minimiser le biais de sélection, de maximiser la puissance d’échantillonnage et d’obtenir une reproductibilité sur le terrain. Cette approche peut être étendue à l’analyse d’autres ponctuations protéiques et compartiments membranaires impliqués dans la neurodégénérescence qui, en fin de compte, amélioreront notre compréhension mécaniste des maladies neurodégénératives.Pour garder la lame intacte pendant la dissection, au microscope stéréoscopique, glissez deux pinces sous la rétine et déchirez doucement le milieu de l’œil pour retirer la rétine. En gardant la pince parallèle à la surface de la lame, retirez tout tissu rétinien restant attaché à la lame. Disséquez trois à cinq cerveaux pour chaque groupe et transférez les cerveaux dans un tube de microcentrifugation contenant un fixateur approprié pendant 15 minutes à température ambiante avec un léger balancement.Après trois lavages de 15 minutes avec du PBS plus Triton X-100, ou PBTx, remplacez le dernier lavage par l’anticorps primaire d’intérêt dilué dans du PBTx avec 5 % de sérum de chèvre normal pour une incubation d’une nuit dans un mélangeur d’aliquote à quatre degrés Celsius. Le lendemain matin, retirez l’excès d’anticorps en effectuant trois lavages de 15 minutes dans du PBTx et incubez les cerveaux dans un anticorps secondaire approprié dilué dans du PBTx avec 5 % de sérum de chèvre normal pendant une heure à température ambiante. À la fin de l’incubation, lavez les cerveaux trois fois comme démontré et placez une goutte de support de montage entre deux morceaux de ruban adhésif transparent au centre d’une lame de microscopie par échantillon de tissu.Placez les cerveaux dans le support de montage pendant une à deux minutes. Lorsque les tissus deviennent transparents, utilisez une pipette pour retirer soigneusement le milieu de montage de chaque côté. Pour imager les tissus colorés, appliquez une goutte de milieu de montage frais sur le cerveau et superposez soigneusement les échantillons avec un verre de protection.Scellez les bords du verre de couverture avec de la colle de caoutchouc et faites sécher les lames à l’air libre pendant 20 minutes à température ambiante. Ensuite, visualisez l’échantillon sur le microscope et ajustez les commandes du détecteur d’image sur le microscope à fluorescence pour capturer le rapport signal/bruit le plus élevé dans la plage dynamique la plus élevée de l’échantillon. Une fois que les paramètres ont été optimisés, visualisez un échantillon d’un autre groupe pour confirmer que les paramètres seront appropriés dans l’ensemble de l’expérience.Le premier échantillon peut ensuite être imagé en prenant soin de l’enregistrer sous forme de type de fichier permettant de préserver les métadonnées telles que les paramètres d’acquisition et l’étalonnage spatial. Pour analyser les images, ouvrez une image aux Fidji, sélectionnez Afficher la pile avec Hyperstack dans la boîte de dialogue Options d’importation des bioformats et définissez le mode de couleur sur Niveaux de gris. Identifiez une zone en fonction des canaux marqueurs qui peut être utilisée comme région d’intérêt normalisée sur les échantillons à l’aide de la barre de défilement C pour visualiser les canaux et de la barre de défilement Z pour vous déplacer dans les plans focaux.Pour simplifier l’analyse de l’image, générez une nouvelle image contenant les canaux et les plans focaux, puis sélectionnez Image et dupliquer. Définissez les canaux et les tranches souhaités et modifiez le nom du fichier pour refléter la sélection. Sélectionnez manuellement une région d’intérêt normalisée à l’aide d’un outil de sélection basé sur les critères de sélection précédemment déterminés.Cliquez sur Analyser, Outils, Gestionnaire de régions d’intérêt, puis sur Ajouter pour ajouter la région d’intérêt au Gestionnaire de régions d’intérêt. Cliquez ensuite sur Plus et Enregistrer et nommez le fichier pour refléter la région qui vous intéresse. Pour le prétraitement des images, cliquez sur Traiter dans Filtres et sélectionnez un filtre approprié.Sélectionnez ici les paramètres de filtre qui réduisent le bruit tout en préservant les bords afin d’aider à la détection des structures d’intérêt lors de la segmentation. Avec l’image prétraitée active aux Fidji, cliquez sur SCF, Étiquetage et H_Watershed interactif. À partir du panneau de configuration, ajustez la dynamique de départ, le seuil d’intensité et l’inondation maximale pour optimiser la segmentation.Une fois les résultats de segmentation optimisés, sélectionnez Exporter les régions, Masquer, puis Exporter pour générer une image binaire des résultats du bassin versant. Ouvrez la région standardisée qui vous intéresse enregistrée. Dans le Gestionnaire de régions d’intérêt, sélectionnez l’identificateur de la région d’intérêt pour limiter l’extraction de caractéristiques à la région d’intérêt normalisée de l’image.Avec la région d’intérêt active sur le masque de bassin versant binaire, sélectionnez Analyser, Analyser les particules et Ajouter au gestionnaire pour extraire les entités afin d’ajouter un identificateur de particule pour chaque structure délimitée lors de la segmentation au Gestionnaire de régions d’intérêt. Enregistrez ensuite les particules ajoutées en veillant à ce que les identifiants soient désélectionnés et que toutes les particules soient enregistrées dans un fichier zip. Ouvrez maintenant l’image brute prétraitée et faites défiler jusqu’au canal utilisé pour capturer les structures d’intérêt.Ouvrez les particules obtenues à partir de l’extraction des caractéristiques et sélectionnez Afficher tout dans le Gestionnaire de régions d’intérêt pour superposer un contour de chaque particule sur l’image. Cliquez sur Analyser et définir les mesures, puis définissez les mesures expérimentales appropriées. Ensuite, dans le gestionnaire de région d’intérêt, sélectionnez Mesurer, puis copiez et collez les résultats dans un tableur approprié pour la compilation et les calculs ultérieurs.La quantification du nombre d’agrégats de huntingtine RFP segmentés de manière semi-automatique à partir de plans focaux standardisés à travers le lobe optique de la drosophile révèle une expression diffuse de l’expansion non pathogène de Huntington Q15 dans l’accumulation d’agrégats de protéines par l’expansion de Huntington Q138 causant la maladie. Les profils de taille et d’intensité de tous les agrégats à partir d’un plan focal standardisé de cinq lobes optiques différents exprimant Huntington Q138 illustrent la robustesse et la reproductibilité de ce flux de travail. Lorsque les agrégats sont surexposés lors de l’acquisition de l’image, la quantification de la taille et du nombre d’agrégats est comparable à celle des agrégats capturés avec une exposition idéale.Cependant, l’intensité des agrégats surexposés devient fonction de la taille lorsque les pixels saturés présentent la valeur d’intensité maximale. La visualisation de l’intensité de mCherry et de GFP dans plusieurs structures liées à l’autophagie ou positives à Atg8 révèle des différences dans le rapporteur où l’intensité élevée des deux fluorophores indique des autophagosomes. Un mCherry élevé et une GFP faible indiquent une fusion avec le lysosome car la GFP est éteinte dans ce compartiment acide.Et enfin, une faible mCherry reflète la dégradation au sein du lysosome. Un nuage de points généré à partir de l’intensité moyenne du fluorophore de chaque particule positive mCherry Atg8 segmentée semi-automatiquement illustre le flux à travers la voie du lysosome d’autophagie qui peut être séparé en étapes discrètes par l’analyse des quadrants. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que les paramètres définis par l’utilisateur dans les étapes d’analyse d’image dépendent fortement de l’application.Veillez donc à documenter le flux de travail pour assurer la cohérence et la comparabilité entre les échantillons.

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Simple Drosophile Dissection ommatidie et imagerie

Cette vidéo démontre l’imagerie et la quantification des agrégats de protéines dans des cerveaux de drosophiles génétiquement modifiés. Les cerveaux sont fixés, lavés et traités avec un agent anti-décoloration avant d’être montés. Les images sont capturées à l’aide d’un microscope confocal et quantifiées pour observer la transmission des agrégats de protéines mutantes.

Imagerie et quantification des agrégats protéiques dans les cerveaux de drosophiles génétiquement modifiés

Drosophile est largement utilisé en tant que système modèle pour étudier la neurodégénérescence. Ce protocole décrit un procédé par lequel une dégénérescence, comme déterminé par la formation de vacuoles dans le cerveau, peuvent être quantifiés. Il minimise également les effets dus à la procédure expérimentale par le traitement et le contrôle sectionner et les mouches expérimentales comme un échantillon.

Mass histologie à Quantifier neurodégénérescence<em&gt; Drosophila</em

Ici , nous montrons comment quantifier le nombre et la répartition spatiale des zones actives synaptiques dans Drosophila melanogaster photorécepteurs, mis en évidence avec un marqueur moléculaire codé génétiquement, et leur modulation après une exposition prolongée à la lumière.

Analyse Synaptic Modulation de<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Photorécepteurs après exposition à la lumière prolongée

Ce protocole décrit la dissection et immunostaining des adultes Drosophila melanogaster tissus du cerveau. Plus précisément, ce protocole met en évidence l’utilisation de Drosophila champignon corps et photorécepteur neurones comme des sous-ensembles neuronale exemple qui peuvent être utilisés avec précision afin de découvrir les principes généraux de nombreux aspects du développement neuronal.

Dissection et immunofluorescence souillant de champignon corps et photorécepteur de neurones dans le cerveau adulte Drosophila melanogaster

Accumulation de preuves souscrit l’idée qu’agrégats de protéine pathogène est associée aux maladies neurodégénératives répartis entre les cellules ayant des propriétés prion. Nous décrivons ici une méthode qui permet la visualisation de cellule à cellule propagation des agrégats de type prion dans l’organisme modèle, Drosophila melanogaster.

Surveillance de cellule à cellule Transmission des agrégats de protéine Prion chez Drosophila Melanogaster

Ce protocole met l’accent sur l’analyse quantitative de la complexité de l’arborisation dendritique neuronale (NDAC) chez la drosophile, qui peut être utilisé pour l’étude de la morphogenèse dendritique.

Analyse quantitative de la complexité d’arborisation dendritique neuronale chez la drosophile

Le but de cette procédure est de disséquer le tissu longitudinal dorsal (DLM) pour évaluer l’intégrité structurelle des jonctions neuromusculaires DLM (NMJs) dans les modèles de maladies neurodégénératives utilisant Drosophila melanogaster.

Visualisation de la dégénérescence synaptique chez les adultes Drosophila en association avec la neurodégénérescence

Ici, des méthodes non invasives sont décrites pour la localisation des protéines de la membrane photoréceptrice et l’évaluation de la dégénérescence rétinienne dans l’œil composé de la drosophile à l’aide de la fluorescence eGFP.

Étude du trafic de protéines membranaires dans les cellules photoréceptrices de la drosophile à l’aide de protéines marquées eGFP

Cette étude présente un protocole simplifié pour le traitement des tissus impliquant la décapitation, la fixation, la cryosection, la coloration par fluorescence, l’immunocoloration et l’imagerie, qui peut être étendu à l’imagerie confocale et multiphotonique. La méthode maintient une efficacité comparable à celle des dissections complexes, en contournant le besoin de motricité avancée. L’analyse quantitative d’images offre un vaste potentiel d’investigation.

Cryosectionnement direct des têtes de drosophile pour une coloration par fluorescence cérébrale et une immunocoloration améliorées

Découvrez une méthode d'analyse d'images semi-automatisée pour quantifier les agrégats protéiques et le flux autophagique dans des modèles de Drosophila. Cette approche réduit les biais de sélection et améliore la reproductibilité dans l'étude des mécanismes de neurodégénérescence.

Biologie cellulaire quantitative de neurodégénération chez la drosophile grâce à l’analyse impartiale des protéines fluorescent étiquetées à l’aide de ImageJ (Vidéo) | JoVE Journal

Biologie cellulaire quantitative de neurodégénération chez la drosophile grâce à l’analyse impartiale des protéines fluorescent étiquetées à l’aide de ImageJ

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