Maintien des Cultures biologiques et mesurer l’Expression des gènes dans l’Aphis nerii: un système Non-modèle pour les Interactions plantes-insectes

Cette méthode décrit les étapes générales de l’élevage des pucerons et les étapes de l’analyse génétique des pucerons. Ces méthodes peuvent être appliquées pour répondre à des questions clés sur l’évolution et l’écologie des pucerons et les mécanismes moléculaires sous-jacents à la biologie des pucerons. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être généralement appliquée à la plupart des espèces de pucerons et réalisée à un coût relativement faible.

Commencez par remplir un plateau de semis standard avec de la terre de mélange de germination, en veillant à ce que la terre atteigne le haut des puits. Lorsque tous les puits ont été remplis, faites un trou de trois centimètres de profondeur dans le sol de chaque puits et placez une graine dans chaque trou. Arrosez les cellules jusqu’à ce que le sol recouvrant les graines soit saturé et placez le plateau dans une serre avec un arrosage quotidien à tous les deux jours, pour maintenir un niveau d’humidité modéré du sol.

Lorsque les semis ont poussé, leur première série de feuilles pleines remplit des pots ronds de quatre pouces avec du terreau, jusqu’à environ cinq centimètres sous leurs bords. Créez un tout dans le sol suffisamment profond pour atteindre le fond du pot et ramassez doucement les plants matures à la main pour les placer profondément dans les trous des nouveaux pots. Ensuite, recouvrez les semis de terre et arrosez les plants tous les jours à tous les deux jours pour maintenir un niveau d’humidité modéré du sol.

Lorsque les plantes ont développé au moins trois à quatre paires de feuilles complètes et mesurent au moins dix centimètres de haut, inspectez manuellement les plantes pour détecter tout parasite indésirable et utilisez une pipette à bouche pour transférer soigneusement un seul puceron adulte reproducteur collecté sur le terrain sur la feuille de la première plante pour créer une ligne iso-clonale. Lorsque tous les pucerons ont été transférés, couvrez solidement les plantes avec une cage à godet sur mesure et placez les plantes infestées de pucerons dans une chambre à environnement contrôlé. Pour maintenir les populations de base, à l’aide d’une pipette buccale, transférez en toute sécurité une à trois nymphes du deuxième ou du troisième stade, ainsi qu’un puceron adulte âgé, vers une nouvelle plante sur une base hebdomadaire.

Et couvrez chaque plante avec une nouvelle cage à godet pour la culture, comme démontré. Pour l’extraction de l’ADN d’un seul puceron adulte, placez le puceron près du fond d’un tube de microcentrifugation stérile de 1,5 millilitre contenant de l’azote liquide et broyez le puceron avec un pilon. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de tampon de lyse dans le tube de microcentrifugation et continuez à broyer le puceron broyé jusqu’à ce que l’échantillon soit visiblement désintégré.

Lavez le pilon avec 100 microlitres supplémentaires de tampon de lyse et incubez le puceron terrestre à 65 degrés Celsius pendant 30 minutes. À la fin de l’incubation, ajoutez 14 microlitres d’acétate de potassium aemulor dans le tube et retournez pour mélanger. Après 30 minutes sur la glace, récupérez les débris cellulaires par centrifugation et transférez le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre sans perturber la pastille.

Ajoutez 200 microlitres d’éthanol froid 100 % de qualité moléculaire au surnageant et retournez le tube pour mélanger. Après 15 minutes à température ambiante, prélever l’ADN précipité par centrifugation et retirer l’éthanol à l’aide d’une pipette. Remettez le granulé en suspension dans 200 microlitres d’éthanol froid à 70 % de qualité moléculaire avec un effleurement pour un deuxième lavage par centrifugation.

Et remettre le granulé en suspension dans 200 microlitres d’éthanol frais, froid et 100 % de qualité moléculaire. Après la troisième centrifugation, placez le tube horizontalement sur un morceau de papier de soie pour un séchage à l’air libre pendant cinq à dix minutes. Et remettre en suspension la pastille d’ADN dans 80 microlitres de tris edta faible.

Ensuite, quantifiez l’ADN remis en suspension dans un spectrophotomètre et stockez l’échantillon restant à quatre degrés Celsius. Après avoir broyé jusqu’à cinq pucerons adultes dans de l’azote liquide, comme démontré, transférez l’échantillon dans une hotte et ajoutez 800 microlitres de réactif d’extraction thiocyanate-phénol-chloroforme de guanidinium dans le tube d’échantillon. Homogénéisez l’échantillon à l’aide d’un pilon et incubez l’homogénat pendant cinq minutes à température ambiante.

Ensuite, ajoutez 160 microlitres de chloroforme à l’échantillon, suivi de 15 secondes de secousses vigoureuses à la main. Ensuite, incubez l’échantillon pendant deux à trois minutes à température ambiante et centrifugez-le pour recueillir l’ARN extrait. Pour précipiter l’ARN, transférez la phase aqueuse dans un nouveau tube de microcentrifugation sans perturber la phase intermédiaire, et ajoutez 400 microlitres d’isopropanol à l’ARN.

Après une incubation de dix minutes à moins 20 degrés Celsius, recueillir l’ARN précipité par centrifugation. Ensuite, lavez l’échantillon deux fois avec un millilitre d’éthanol à 75 % dans de l’eau traitée au pyrocarbonate de diéthyle, jusqu’à ce que l’échantillon soit lentement vortex et centrifugé pour éliminer tous les contaminants phénoliques. Après le deuxième lavage, faites sécher la pastille à l’air libre pendant cinq à dix minutes sur une paillasse stérile, et dissolvez la pastille d’ARN dans 30 microlitres d’eau ultra pure avec un pipetage doux avant une incubation de dix à 15 minutes à 55 à 60 degrés Celsius.

Les graines mettront environ deux à quatre semaines, selon la saison, pour devenir suffisamment grosses pour être rempotées. Les semis rempotés mettront encore deux à quatre semaines pour atteindre une taille optimale pour la culture de pucerons. Les aye-near-ee-eye adultes se distinguent par une cauda foncée, et peuvent être non ailés ou ailés.

Les coussinets alaires en développement deviennent visibles lorsque les nymphes atteignent le troisième stade. Un seul adulte donnera environ 100 à 200 nanogrammes par microlitre d’ADN et 150 à 300 nanogrammes par microlitre d’ARN. L’expression relative d’un gène candidat dans différentes conditions de traitement peut alors être calculée.

Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de ne pas contaminer vos stocks iso-clonaux. N’oubliez pas non plus que la qualité de vos pucerons dépend fortement de la qualité de vos plantes. À la suite de cette procédure, d’autres extractions et techniques de séquençage peuvent être effectuées pour répondre à des questions sur les mécanismes moléculaires sous-jacents à la biologie des pucerons.