Name: Maintien des Cultures biologiques et mesurer l’Expression des gènes dans l’Aphis nerii: un système Non-modèle pour les Interactions plantes-insectes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Découvrez les protocoles de culture et d'analyse génétique de Aphis nerii pour étudier les interactions plantes-insectes. Ces méthodes peuvent s'adapter à la plupart des espèces de pucerons.

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Nous tenons à remercier Michelle Moon (Vanderbilt University) pour une assistance avec la photographie. Soutien de l’Université Vanderbilt fourni PA et SSLB est pris en charge par DGE-1445197.

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Il a longtemps été reconnu que l’aposématiques nerii a. peut apporter un éclairage sur les modèles et les mécanismes de résistance aux défenses de la plante et particulièrement chimique séquestration du18,37. Un certain nombre de ressources génomiques ont récemment émergé pour a. nerii10, offrant de nouvelles possibilités pour des études de génomique écologiques et fonctionnels qui utilisent nerii a. comme un mod...

Les pucerons sont de petits insectes hémimétaboles qui colonisent sur des familles de diverses plantes dans le monde entier. Ils sont distinguent par plusieurs caractéristiques, plus notamment leurs cycles de vie complexes impliquant la parthénogénèse cyclique et polyphenisms discrets et leurs symbioses nutritionnelles obligatoires avec endosymbiontes bactérie ou levure qui fournissent des éléments nutritifs manquant à partir leur alimentation d’usine sap1. Alors que la plupart des pucerons sont des spécialistes de plante hôte, certaines espèces généralistes sont des ravageurs de culture importante, infligeant des dégâts économiques considérables sur les cultures soit directement ou via les agents pathogènes et les virus ils vector2. La publication du premier génome du puceron en 2010, du puceron du pois Acyrthosiphon pisum3, a marqué un jalon important dans l’étude de la biologie de pucerons parce qu’il a fourni les ressources génomiques pour répondre aux questions au sujet de l’insecte adaptations pour les herbivores des modes de vie, y compris celles qui pourraient conduire à un meilleur contrôle des stratégies4. Depuis ce temps, des ressources supplémentaires de génomiques ont accumulé avec la publication d’un génome annoté pour le soja puceron Aphis glycines5et ressources accessibles tout le génome d’une autre espèce de trois-puceron (Myzus Cerasi (black cherry aphid), Myzus persicae (pêche-pomme de terre pucerons), Rhopalosiphum padi (cerisier des oiseaux-puceron)6. Ressources de transcriptomique précieux de novo sont disponibles aussi bien pour un certain nombre d’autres espèces de pucerons (e.g.,Aphis gossypii (puceron du cotonnier)7, Sitobion avenae (puceron des céréales)8, Cinara pinitabulaeformis (puceron du pin)9, Aphis nerii (puceron asclépiade-laurier-rose)10).
Les pucerons ont également une contribution durable à notre compréhension des interactions plantes-insectes et l’écologie de la vie sur plantes11. Un domaine où les pucerons ont apporté une contribution particulièrement importante est dans notre compréhension de l’écologie chimique des interactions plante hôte. Des adaptations expriment divers insectes herbivores pour vaincre les défenses végétales et certains même coopter des défenses de la plante pour leur propre bonheur12,13,14. Par exemple, le puceron de l’asclépiade-lauriers roses, Aphis nerii, est un brillant jaune, invasif puceron trouvé dans les régions tempérées et tropicales partout dans le monde qui colonise les plantes de la famille des asclépiades (Apocynaceae). Plantes de la famille des Apocynaceae ont évolué des défenses chimiques diverses, y compris le latex laiteux et des glucosides cardiotoniques, appelées cardénolides, qui lient le transporteur de cations Na, K-ATPase et sont des moyens de dissuasion efficaces au généraliste herbivores15, 16. spécialistes asclépiade expriment différents modes de résistance aux cardénolides, et certains sélectivement ou passivement accumulent ou modifient des cardénolides dans leurs tissus comme un moyen de dissuader les prédateurs ou d’autres avantages17. A. nerii est pensé pour séquestrer cardénolides de cette façon, même si les mécanismes et les avantages fonctionnels demeurent peu claires10,18.
Compte tenu des ressources génomiques à portée de main, a. nerii fournit un excellent modèle expérimental pour l’étude des mécanismes moléculaires et génétiques impliqués dans les interactions entre plantes hôtes toxiques et leur spécialiste chimio-écologiques herbivores. Il est à noter que, tandis que certains des premières études de a. nerii axé sur la séquestration des cardénolides19, depuis ce temps, études d’a. nerii ont permis de mieux comprendre un large éventail de questions écologiques et évolutionnaires, y compris la structure génétique des insectes envahissants20 et l’interaction entre la réglementation ascendantes et descendantes sur les herbivores densité21. A. nerii est donc un bon candidat comme modèle expérimental pour un ensemble particulièrement large d’études des interactions plantes-insectes. Critique au succès de toute étude avec a. nerii est la culture attentive du puceron des populations, qui comprend la culture des plantes dont dépendent les pucerons, mais aussi à une production efficace des données de haute qualité - omic. Notre but est de guider le lecteur à travers les deux. Décrites ci-dessous sont des méthodes pour la génération et l’entretien des cultures végétales et pucerons dans la serre et laboratoire, ADN et ARN extractions, analyses microsatellites, Assemblée de transcriptome de novo et annotation, transcriptome analyse de l’expression différentielle et la vérification de qPCR de gènes différentiellement exprimés. Alors que ces méthodes soient écrits pour a. nerii, les méthodes de culture, d’extraction et analyse générales peuvent étendre à un éventail d’espèces de pucerons.

<table><tbody><tr><td>Sun Gro Fafard Germination</td> Mix <td>Hummert International</td><td>10-0952-2</td><td></td></tr><tr><td>Sun Gro Fafard 3B/ Metro Mix</td><td>Hummert International</td><td>10-0951-2</td><td></td></tr><tr><td>2 » x 4 » Pot Standard Rond</td><td>Anderson Pots</td><td>1503</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq DNA Polymérase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EP0701</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td>15596026</tr><tr><td>SuperScript&reg ; III Kit de synthèse premier brin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080051</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green PCR Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4367659</td><td></td></tr></tbody></table>

maintien des cultures biologiques et mesurer l’expression des gènes dans l’aphis nerii: un système non-modèle pour les interactions plantes-insectes

Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions

Les pucerons sont excellents modèles expérimentaux pour une variété de questions biologiques allant de l’évolution des symbioses et le développement de polyphenisms aux questions entourant les interactions avec leurs plantes hôtes de l’insecte. Ressources génomiques sont disponibles pour plusieurs espèces de pucerons, et grâce aux progrès dans le séquençage de nouvelle génération, transcriptomique études sont étendus pour les organismes non-modèle qui manquent de génomes. En outre, cultures de pucerons soient collectées sur le terrain et élevés en laboratoire pour l’utilisation dans des expériences organismiques et moléculaires pour combler l’écart entre les études écologiques et génétiques. Enfin, beaucoup de pucerons peuvent être maintenus en laboratoire sur leurs plantes hôtes préférés dans le cycle de vie perpétuel, parthénogénétiques permettant des comparaisons de reproduction asexuée des génotypes. Aphis nerii, le puceron de l’asclépiade-lauriers roses, fournit un tel modèle pour étudier les insectes interactions avec des plantes toxiques à l’aide d’expériences moléculaires et organismiques. Méthodes pour la génération et l’entretien des cultures végétales et puceron dans l’expression différentielle de serre et en laboratoire, extractions d’ADN et d’ARN, l’analyse de microsatellites, Assemblée de transcriptome de novo et annotation, transcriptome l’analyse et la vérification de qPCR de gènes différentiellement exprimés sont décrites et discutées ici.

Planter des cultures : Les graines prendront environ deux à quatre semaines, selon la saison, pour grossir suffisamment pour être re-pot (Figure 1A). Re-en pot de semis prendra encore deux à quatre semaines pour atteindre une taille optimale pour les cultures de pucerons (Figure 1B).
Cultures de pucerons :</stro...

Le puceron Aphis nerii colonise fortement défendues de plantes de la famille (Apocyanaceae) et offre de nombreuses possibilités pour étudier les interactions plantes-insectes. Nous présentons ici une série de protocoles pour l’entretien des plantes et des pucerons, cultures et la génération et l’analyse de moléculaire et données - omic pour a. nerii.

Maintien des Cultures biologiques et mesurer l’Expression des gènes dans l’Aphis nerii: un système Non-modèle pour les Interactions plantes-insectes

Aphids are excellent experimental models for a variety of biological questions ranging from the evolution of symbioses and the development of polyphenisms ...

Cette méthode décrit les étapes générales de l’élevage des pucerons et les étapes de l’analyse génétique des pucerons. Ces méthodes peuvent être appliquées pour répondre à des questions clés sur l’évolution et l’écologie des pucerons et les mécanismes moléculaires sous-jacents à la biologie des pucerons. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être généralement appliquée à la plupart des espèces de pucerons et réalisée à un coût relativement faible.Commencez par remplir un plateau de semis standard avec de la terre de mélange de germination, en veillant à ce que la terre atteigne le haut des puits. Lorsque tous les puits ont été remplis, faites un trou de trois centimètres de profondeur dans le sol de chaque puits et placez une graine dans chaque trou. Arrosez les cellules jusqu’à ce que le sol recouvrant les graines soit saturé et placez le plateau dans une serre avec un arrosage quotidien à tous les deux jours, pour maintenir un niveau d’humidité modéré du sol.Lorsque les semis ont poussé, leur première série de feuilles pleines remplit des pots ronds de quatre pouces avec du terreau, jusqu’à environ cinq centimètres sous leurs bords. Créez un tout dans le sol s

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Quantitative PCR en temps réel (qRT-PCR) est un outil efficace pour diagnostiquer les niveaux d'ARNm dans les tissus des insectes et des stades de développement. Dans ce rapport, nous montrons l'utilisation de qRT-PCR pour déterminer les niveaux d'ARNm dans différents tissus des larves et les stades de développement de l'espèce d'insecte invasif, l'agrile du frêne.

Analyse de l&#39;expression génique dans l&#39;agrile du frêne ( Agrilus planipennis) En utilisant quantitative en temps réel-PCR

Source : Rufián, J. S., et al. Analyse unicellulaire de l’expression des gènes de Pseudomonas syringae dans les tissus végétaux. J. Vis. Exp. (2022).Cette vidéo démontre une méthode d’analyse de l’expression génique dans des bactéries pathogènes extraites de plantes au niveau unicellulaire en utilisant un facteur de transcription marqué fluorescentement. L’imagerie confocale révèle une hétérogénéité dans l’expression des gènes de virulence, mettant en lumière la diversité fonctionnelle au sein...

Analyse unicellulaire de l’expression génique à partir de pathogènes extraits par des plantes

Cette vidéo montre une méthode pour établir un modèle d’infection à Mycobacterium bovis chez les larves de la teigne de la cire, Galleria mellonella. Une souche bioluminescente de Mycobacterium bovis BCG est injectée dans l’hémolymphe de la larve pour établir l’infection, et la bioluminescence est mesurée à des intervalles prédéfinis pour étudier la progression de l’infection.

Technique permettant d’établir un modèle d’infection bactérienne chez les larves d’insectes

La quantification de la croissance des agents pathogènes est un outil puissant pour caractériser diverses réponses immunitaires d’Arabidopsis thaliana (ci-après : Arabidopsis). La méthode décrite ici présente un test d’infiltration à la seringue optimisé pour quantifier le Pseudomonas syringae pv. maculicola Croissance d’ES4326 dans les feuilles adultes d’Arabidopsis.

Bactérienne Feuille Infiltration Essai de caractérisation fine des réponses de défense des plantes à l&#39;aide du<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Pathosystème

Un protocole d’immunomarquage complet sur des embryons de pucerons est présenté, dans lequel les conditions critiques pour diminuer la coloration de fond et augmenter la perméabilité tissulaire sont abordées. Ces conditions sont spécifiquement développées pour la détection efficace de l’expression des protéines dans les tissus embryonnaires des pucerons.

Identification des conditions critiques pour Immunocoloration dans le puceron du pois embryons: L&#39;augmentation de la perméabilité des tissus et la diminution de la coloration de fond

Ici, nous présentons des protocoles d'élevage un coléoptère intermédiaire germe, Dermestes maculatus (D. maculatus) dans le laboratoire. Nous partageons également des protocoles pour l'embryon et des parents ARNi et méthodes pour l'analyse des phénotypes embryonnaires pour étudier la fonction des gènes de cette espèce.

L'élevage et d'ARN double brin médiée Gene Knockdown dans le Hide Beetle, Dermestes maculatus

Ce protocole décrit une méthode simple pour analyser les signaux calciques chez les plantes générées en se nourrissant d’insectes hémiptères, comme les pucerons. Arabidopsis thaliana transformée avec le biocapteur de calcium GFP GCaMP3 permettant l’imagerie en temps réel en vivo de dynamique du calcium avec une haute résolution temporelle et spatiale.

Enregistrement en temps réel In Vivo des signaux calciques Arabidopsis pendant la tétée insectes à l’aide d’un biocapteur Fluorescent

Ce protocole décrit une méthode pour enregistrer l’activité électrique descendante du système nerveux central Drosophila melanogaster pour permettre le rapport coût-efficacité et pratique essais d’agents pharmacologiques, les mutations génétiques des protéines neuronales, et/ou le rôle des voies physiologiques inexplorées.

Enregistrement électrophysiologique de l’activité du système nerveux Central du troisième stade de Drosophila Melanogaster

La méthode présentée crée des tissus végétaux naturels endommagés par l'herbivore grâce à l'application de larves de sexta de Manduca sur des feuilles détachées de pommes de terre. Le tissu végétal est mis en ligne pour l'expression de six homologs de facteur de transcription impliqués dans les réponses précoces à l'herbivorie d'insecte.

Des essais de feuilles détachées pour simplifier les études sur l'expression génique de la pomme de terre pendant l'infestation par l'insecte à mâcher Manduca sexta

Ici, nous caractérisons les réponses de stress protéotoxiciques cellulaires dans le nématode C. elegans en mesurant l’activation des reporters transcriptionnels fluorescents et en assayant la sensibilité au stress physiologique.

Mesures des réponses physiologiques au stress à C. Elegans

Cet article décrit les méthodes de base pour normaliser des facteurs importants tels que la densité, la disponibilité des aliments, la source d’hydratation et les contrôles environnementaux pour l’élevage à long terme de cultures de laboratoire du grillon comestible, Gryllus bimaculatus.

Maintenir les cultures de laboratoire de Gryllus bimaculatus, un modèle orthoptère polyvalent pour l’agriculture des insectes et la physiologie des invertébrés

Découvrez les protocoles de culture et d'analyse génétique de Aphis nerii pour étudier les interactions plantes-insectes. Ces méthodes peuvent s'adapter à la plupart des espèces de pucerons.

Maintien des Cultures biologiques et mesurer l’Expression des gènes dans l’Aphis nerii: un système Non-modèle pour les Interactions plantes-insectes (Vidéo) | JoVE Journal

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Maintien des Cultures biologiques et mesurer l’Expression des gènes dans l’Aphis nerii: un système Non-modèle pour les Interactions plantes-insectes

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