Name: Seule goutte numérique PCR pour la détection complète et simultanée des Mutations dans les régions de Hotspot (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Découvrez la méthode drop-off ddPCR pour détecter simultanément plusieurs mutations dans l'ADN tumoral circulant. Cette technique sensible permet l'analyse multiplexée de régions hotspot tout en préservant les échantillons patients.

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Ce travail a été soutenu par l’Institut Curie SiRIC (subvention INCa-DGCD-4654). Les auteurs souhaitent remercier Caroline Hego pour sa contribution à la vidéo.

<ol><li>Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).</li>
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<li>Postel, M., Roosen, A., Laurent-Puig, P., Taly, V., Wang-Renault, S. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet-based+digital+PCR+and+next+generation+sequencing+for+monitoring+circulating+tumor+DNA%3A+a+cancer+diagnostic+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Droplet-based digital PCR and next generation sequencing for monitoring circulating tumor DNA: a cancer diagnostic perspective.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 18 (1), 7-17 (2018).</li>
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<li>Bidshahri, R., Attali, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Detection+and+Resolution+of+BRAF+V600+Status+in+Colorectal+Cancer+Using+Droplet+Digital+PCR+and+a+Novel+Wild-Type+Negative+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Quantitative Detection and Resolution of BRAF V600 Status in Colorectal Cancer Using Droplet Digital PCR and a Novel Wild-Type Negative Assay.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 190-204 (2016).</li>
<li>Attali, D., Bidshahri, R., Haynes, C., Bryan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ddpcr%3A+an+R+package+and+web+application+for+analysis+of+droplet+digital+PCR+data%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">ddpcr: an R package and web application for analysis of droplet digital PCR data.</a> F1000Research. 5, (2016).</li>
<li>Forbes, S. A., Beare, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COSMIC%3A+somatic+cancer+genetics+at+high-resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">COSMIC: somatic cancer genetics at high-resolution.</a> Nucleic Acids Research. 45 (D1), D777-D783 (2017).</li>
</ol>

Plusieurs auteurs sont nommés inventeurs de deux demandes de brevet (EP17305920.5, EP18305277.8) associés à la détection d’ADNct.

Pour concevoir un test de ddPCR déclin efficace, l’optimisation est cruciale, et le protocole doit être suivi attentivement. Chaque combinaison des amorces et des sondes a une efficacité de réaction PCR unique. Ainsi, une analyse individuelle doit être soigneusement validés sur des échantillons de contrôle avant d’être utilisé sur des échantillons d’essai précieux. Optimisation et validation sont importantes pour certifier la détection de signal de crête et évaluer la spécificité et la sensibilité. Comme décrit dans le p...

Des milliers de mutations somatiques liées au développement du cancer ont été signalés1. Parmi ceux-ci, quelques-uns sont des marqueurs prédictifs de l’efficacité de la thérapie ciblée 2,3 et dépistage de ces mutations génétique est pratique clinique de routine maintenant. Gouttelette numérique technologie PCR (ddPCR) peut être utilisée pour surveiller la présence ou l’absence de mutations avec une précision de détection élevé et est hautement compatible avec biopsies liquide non invasif4,5. Cependant, les tests de ddPCR actuellement sont principalement conçus pour détecter les mutations connues a priori. Ceci limite fortement l’utilisation de ddPCR comme un outil de découverte lorsque la mutation est inconnue. En effet, lors de la conception conventionnelle de ddPCR, une sonde d’hydrolyse reconnaissant l’allèle sauvage (WT sonde) est en concurrence avec une sonde spécifique reconnaissant l’allèle mutant (MUT sonde) (Figure 1 a). La sonde avec une affinité plus élevée s’hybride au modèle et libère ses fluorophore, indiquant la nature de l’allèle correspondant. Les données de fluorescence obtenues pour chaque gouttelette peuvent être visualisées dans un nuage de points représentant la fluorescence émise par les sondes em et MUT de différentes dimensions. Une représentation schématique d’un résultat typique pour un dosage ddPCR conventionnelle est présentée dans la Figure 1 a. Dans cet exemple, la nuée bleue correspond à des gouttelettes contenant des allèles WT identifiées par la sonde WT, alors que le nuage rouge correspond à gouttelettes où l’allèle MUT a été amplifié et identifiée par la sonde MUT. Selon la quantité d’ADN chargé dans la réaction, des gouttelettes positives doubles contenant des amplicons fois WT et MUT peuvent apparaître (Nuage vert). Le nuage gris clair correspond à gouttelettes vides.
Étant donné que la plupart des plates-formes permettant la détection d’un nombre limité de fluorophores (généralement 2, mais jusqu'à 5), un débit de ddPCR conventionnelle est limité. Cibler des régions présentant des mutations adjacentes multiples exige donc, design de techniquement difficiles ddPCR multiplex essais ou l’utilisation de multiples réactions ciblant chaque mutation en parallèle. La stratégie de ddPCR Drop-off, permet de surmonter cette limitation car il peut éventuellement détecter toute modification génétique dans une région cible à l’aide d’une paire de sondes d’hydrolyse WT. Le premier sonde (Probe 1) couvrant qu'une séquence non variable, adjacente à la région cible et la deuxième sonde (sonde 2) est complémentaire de la séquence WT de la région cible où les mutations sont attendus (Figure 1 b). Alors que la première sonde quantifie le montant total des molécules amplifiables dans la réaction, la deuxième sonde discriminatoire WT et MUT allèles par hybridation sous-optimal de séquences de mutants. Sonde 2 peut identifier plusieurs types de mutations dans la région (substitutions nucléotidiques simples ou multiples, suppression, etc.) la cible6. Comme dans les ddPCR classique, le nuage gris clair correspond à gouttelettes ne contenant aucune des molécules d’ADN. Il est important de rappeler que dans ce type de test, une séparation optimale des nuages WT et MUT est tributaire de la quantité d’ADN chargé dans la réaction, puisque les gouttelettes contenant les WT et MUT allèles cible ne peut pas être distinguées de gouttelettes contenant uniquement le WT formulaire. Par conséquent, ce test nécessite que la plupart des gouttelettes contiennent pas plus d’une copie du gène ciblé.

<table><tbody><tr><td>Tube K2EDTA (code couleur : lavande)</td><td>Les</td><td></td><td>tubes BD 367863 EDTA sont utilisés pour obtenir un échantillon de sang total ou de plasma EDTA</td></tr><tr><td>QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (protocole manuel)</td><td>Qiagen</td><td>55114</td><td>Pour l’isolement de l’ADN circulant libre du plasma humain</td></tr><tr><td>QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (protocole automatisé)</td><td>Qiagen</td><td>937556</td><td>Pour l’isolement de l’ADN circulant libre du plasma humain</td></tr><tr><td>QIAsymphony SP system</td><td>Qiagen</td><td>9001297</td><td>système entièrement intégré et automatisé pour la purification de l’ADNcf, de l’ADN ou de l’ARN</td></tr><tr><td>QIAvac 24 Plus</td><td>Qiagen</td><td>19413</td><td>Pour la purification simultanée de jusqu’à 24 cfDNA</td></tr><tr><td>Fluorimètre Qubit</td><td>Invitrogen</td><td>Q33226</td><td>Le fluorimètre Qubit est un fluorimètre de paillasse pour la quantification de l’ADN</td></tr><tr><td>Lecteur QX100 ou QX200</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3003 ou 186-4003, respectivement</td><td>Le lecteur mesure l’intensité de fluorescence de chaque gouttelette et détecte la taille et la forme lorsque les gouttelettes passent devant le détecteur</td></tr><tr><td>Générateur de gouttelettes QX100 ou QX200</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3002 ou 186-4002, respectivement</td><td>Instrument utilisé pour la génération de gouttelettes</td></tr><tr><td>Thermocycleur C1000</td><td>Bio-Rad</td><td>1851196</td><td>Plate-forme modulaire de thermocycleur, comprend un châssis de thermocycleur C1000 Touch, un module de réaction rapide à 96 puits</td></tr><tr><td>Scelleuse de plaques</td><td>Bio-Rad</td><td>181-4000</td><td>PX1&commerce ; Porte-cartouche de scelleuse de plaques PCR</td></tr><tr><td>DG8</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3051</td><td>Positionne et maintient la cartouche DG8 dans l’instrument pour la génération</td></tr><tr><td>de gouttelettes Cartouches génératrices de gouttelettes et joints</td><td>Bio-Rad</td><td>186-4007</td><td>Cartouche microfluidique DG8 utilisée pour mélanger l’échantillon et l’huile afin de générer des gouttelettes ; Les joints DG8 scellent la cartouche pour empêcher l’évaporation et appliquer la pression requise pour la formation de gouttelettes</td></tr><tr><td>PCR supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3010</td><td>ddPCR supermix pour sondes (pas de dUTP)</td></tr><tr><td>Plaques PCR à 96 puits</td><td>Eppendorf</td><td>951020362</td><td>Plaques semi-jupes à 96 puits</td></tr><tr><td>Étanchéité en feuille</td><td>Bio-Rad</td><td>181-4040</td><td>Membrane perçable Thermoscellage</td></tr><tr><td>ddPCR Lecteur de gouttelettes Huile</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3004</td><td>huile utilisée dans le lire</td></tr><tr><td>Huile de génération de gouttelettes pour sondes</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3005</td><td>huile pour la génération de gouttelettes</td></tr><tr><td>DNA loBind Tube 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030 108.051</td><td>Les tubes Eppendorf LoBind maximisent la récupération de l’échantillon en réduisant considérablement la liaison de l’échantillon à la surface</td></tr><tr><td>Multiplex I cfDNA Reference Standard Set</td><td>HORIZON</td><td>HD780</td><td>Les étalons de référence Multiplex I cfDNA sont des matériaux de référence hautement caractérisés et biologiquement pertinents utilisés pour évaluer les performances des tests d’ADNcf qui détectent les mutations somatiques</td></tr><tr><td>QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT, 500</td><td>Life Technologies</td><td>Q32854</td><td>Le test HS est hautement sélectif pour l’ADN double brin (ADNdb) par rapport à l’ARN et est conçu pour être précis pour les concentrations initiales d’échantillons à partir de 10 pg/&micro ; L à 100 ng/&micro ; L</td></tr><tr><td>Qubit Assay Tubes Life Technologies</td><td></td><td>Q32856</td><td>Les tubes de dosage Qubit sont 500 & micro ; Tubes en polypropylène à paroi mince L à utiliser avec le fluorimètre Qubit</td></tr></tbody></table>

seule goutte numérique pcr pour la détection complète et simultanée des mutations dans les régions de hotspot

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Gouttelette numérique polymérisation en chaîne (ddPCR) est une méthode de réaction en chaîne (PCR) ultrasensible polymérase quantitative basée sur le fractionnement des échantillons dans des milliers de taille nanométrique de réactions individuelles eau-dans-huile. Récemment, ddPCR est devenu un des outils plus précis et plus sensibles pour la détection de l’ADN (ADNct) tumeur en circulation. Une des principales limites de la technique standard ddPCR est le nombre limité de mutations qui peut être projeté par réaction, comme les sondes d’hydrolyse spécifiques reconnaissant chaque version allélique possible sont nécessaires. Une autre méthode, le drop-off ddPCR, augmente le débit, car il ne nécessite qu’une seule paire de sondes pour détecter et quantifier potentiellement toutes les altérations génétiques dans la région ciblée. Drop-off ddPCR affiche une sensibilité comparable aux déterminations ddPCR classiques avec l’avantage de détecter un plus grand nombre de mutations dans une seule réaction. Il est rentable, conserve de précieux échantillons et peut aussi servir comme un outil de découverte lorsque les mutations ne sont pas connues a priori.

Dans une étude de validation, des mutations exon 2 KRAS (codons 12 et 13) et EGFR exon 19 suppressions ont été étudiées en tissus FFPE et échantillons plasmatiques provenant de patients atteints de cancer en utilisant le dépôt ddPCR stratégie6.
La sonde de déclin KRAS interrogé une région bp 16 englobant plusieurs mutations dans l’exon 2 du gène KRAS , qui abritent plus...

Nous présentons ici un protocole visant à quantifier avec précision les multiples altérations génétiques d’une région cible en une seule réaction à l’aide de Drop-off ddPCR et une paire de sondes d’hydrolyse.

Seule goutte numérique PCR pour la détection complète et simultanée des Mutations dans les régions de Hotspot

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Cette méthode peut être employée comme outil diagnostique pour le cancer pour analyser l’ADN circulant de tumeur. Cette technique interroge l’altération génétique multiple dans les régions des mutations de faisceau dans une seule réaction. Cela permet d’économiser des échantillons précieux de patients.Cette méthode peut fournir la perspicacité à la charge de tumeur sur son profil mutationnel. Il peut maintenant également être appliqué à une analyse moléculaire comme alternative à qPCR pour obtenir une quantification absolue des séquences cibles d’acide nucléique. Prélever des échantillons de sang dans des tubes EDTA de sept millilitres.Deux tubes sont recommandés pour recueillir environ quatre millilitres de plasma. Centrifuger les échantillons de sang pendant 10 minutes à 820 fois la gravité dans les trois heures suivant la prise de sang pour séparer les globules rouges, les globules blancs et le plasma. Le temps entre l’échantillonnage et la centrifugation est essentiel pour obtenir de l’ADN sans cellule T de haute qualité qui n’est pas contaminé par l’ADN libéré par les globules blancs.Après centrifugation, utiliser une pipette sérologique pour recueillir le supernatant sans toucher la couche de globules blancs. Environ deux millilitres de plasma sont habituellement récupérés par tube EDTA. Après avoir transféré les plasmes à deux tubes millilitres, centrifugez les aliquots à 16 000 fois la gravité pendant 10 minutes à 15 degrés Celsius pour enlever les débris cellulaires.Recueillir soigneusement le plasma sans déranger la pastille et transférer sur deux tubes cryogéniques millilimétriques. Conserver à 80 degrés Celsius jusqu’à ce que nécessaire. Commencez par ajouter 400 microlitres de proteinase K à un tube de 50 millilitres.Ajouter ensuite quatre millilitres de plasma et 3,2 millilitres de tampon de lyse ACL contenant un microgramme d’ARN porteur provenant du kit d’extraction. Fermer le tube et mélanger en tourbillonnant pendant 30 secondes pour obtenir une solution homogène. Puis, incuber à 60 degrés Celsius pendant 30 minutes.Après l’incubation, ajouter 7,2 millilitres d’ACB tampon au lysate pour optimiser la liaison des acides nucléiques circulants à la membrane de silice. Mélanger par vortex pendant 15 à 30 secondes. Ensuite, incuber le tube sur la glace pendant cinq minutes.Fixez la colonne et l’extension de 20 millilitres sur la pompe à vide. Fermez les parties inutilisées pour permettre l’aspiration sous vide. Après avoir brièvement centrifugé le tube, introduire soigneusement le mélange dans l’extenseur du tube.Ensuite, allumez la pompe à vide et laissez le lysate être tiré à travers les colonnes complètement. Retirer et jeter l’extenseur de tube. Ensuite, appliquez 600 microlitres de tampon ACW1 à la colonne.Lorsque le tampon ACW1 a traversé la colonne, ajouter 750 microlitres de tampon ACW2, et enfin, 750 microlitres de 96 à 100% d’éthanol. Ensuite, placez la colonne dans un tube de collecte propre de deux millilitres et une centrifugeuse à pleine vitesse pendant trois minutes pour éliminer l’éthanol. Après avoir placé la colonne dans un nouveau tube de collecte de deux millilitres, ouvrez le couvercle, puis incubez à 56 degrés Celsius pendant 10 minutes pour sécher complètement la membrane.Après l’incubation, placez la colonne dans un tube propre à faible liaison de 1,5 millilitre. Appliquez soigneusement 36 microlitres d’eau sans RNase avec de l’azide de sodium à 0,04 %. Ensuite, fermez le couvercle et incubez à température ambiante pendant trois minutes.Centrifugeuse à pleine vitesse à nouveau pendant une minute pour élucider les acides nucléiques. Ensuite, conserver à 20 degrés Celsius négatifs jusqu’à ce que nécessaire. Commencez par décongeler et équilibrer les composants de réaction à la température ambiante dans un capot PCR propre.Préparez ensuite un mélange 20 fois d’amorces et de sondes dans l’eau distillée sans RNase et dnase avec chaque amorce à 18 concentration de micromolaires et chaque sonde à cinq concentrations de micromolaires. Pour toutes les réactions pcr individuelles, préparer un mélange d’échantillons en combinant 10 microlitres de deux fois ddPCR Supermix, un microlitre de 20 fois les amorces et les sondes se mélangent, et jusqu’à 10 nanogrammes de l’échantillon d’ADN dans 20 microlitres d’eau distillée. Vortex le mélange de réaction à fond pour assurer l’homogénéité.Et brièvement centrifugeuse pour recueillir le contenu au fond du tube avant la distribution. Insérez la cartouche ddPCR dans le support et chargez 20 microlitres de mélange de réaction d’échantillon dans les puits moyens de la cartouche pour la génération de gouttelettes. Ajouter 70 microlitres d’huile de générateur de gouttelettes dans les puits du fond.Insérez la cartouche avec un joint dans le générateur de gouttelettes. Des gouttelettes seront produites dans les puits supérieur de la cartouche. Aspirez lentement et doucement 40 microlitres des gouttelettes des cartouches et distribuez-les dans une plaque PCR de 96 puits.Sceller la plaque PCR finale avec du papier d’aluminium à l’aide d’un scellant de plaque immédiatement après le transfert des gouttelettes pour éviter l’évaporation. Centrifugez brièvement la plaque pour recueillir le contenu au fond des puits. Exécutez une amplification PCR conventionnelle sur un cycleur thermique.Lorsque la course est terminée, centrifugez brièvement la plaque pour recueillir le contenu au fond des puits. Après amplification PCR, utilisez le lecteur de gouttelettes pour compter les gouttelettes négatives PCR positives et PCR suivant les instructions du fabricant. Voici les résultats représentatifs obtenus lors des étapes d’optimisation de l’analyse ddPCR de drop-off.Cette image montre la détection de l’ADN mutant et de l’ADN de type sauvage dans une réaction contenant 100% d’ADN mutant, 5% d’ADN mutant, et 100% d’ADN de type sauvage. Cette image montre des exemples d’échantillons de plasma analysés avec les analyses kras et EGFR drop-off ddPCR montrant la détection de nucléotides simples et de substitutions multiples dans l’exon deux de KRAS et une suppression dans EGFR exon 19. Tout en essayant cette procédure, il est important de procéder soigneusement à chaque étape avec une attention particulière à la génération gouttelette, qui est une étape critique de cette méthode.Après son développement, cette technique a ouvert la voie à un chercheur et à un clinicien dans le domaine de la recherche sur le cancer afin d’optimiser l’analyse de la mutation tumorale à l’aide d’une biopsie liquide.

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Dans cette vidéo, nous présentons une procédure étape par étape pour générer des nano-gouttelettes émulsionnées afin de détecter les acides nucléiques cibles par réaction en chaîne par polymérase numérique ou dPCR.

Réaction en chaîne par polymérase numérique en gouttelettes : une méthode pour générer des réactions PCR de nanogouttelettes pour détecter des mutations tumorales rares

Cette vidéo démontre le rôle de la réaction en chaîne par polymérase numérique dans l’identification de la mutation indel dans un échantillon d’ADN. La haute précision et la sensibilité de la ddPCR permettent une détection précise et cohérente des mutations rares présentes dans un échantillon, même à de faibles niveaux. Il permet d’identifier et de quantifier les mutations indel dans différentes régions du génome, fournissant ainsi des informations précieuses sur les mécanismes de mutation et...

Réaction en chaîne par polymérase numérique pour la détection de mutations indel dans des gènes cibles

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La PCR bloquante de type sauvage suivie d’un séquençage direct offre une méthode très sensible de détection des mutations somatiques à basse fréquence dans une variété de types d’échantillons.

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Ici, nous présentons un protocole pour détecter des mutations somatiques de tumeur dans l'ADN circulant présent dans les fluides biologiques patients (biofluides). Notre méthode numérique de réaction en chaîne de polymérase de gouttelette (dPCR) permet de quantifier la fréquence allélique de mutation de tumeur (MAF), facilitant un complément mini-invasif au diagnostic et à la surveillance temporelle de la réponse de tumeur.

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