Seule goutte numérique PCR pour la détection complète et simultanée des Mutations dans les régions de Hotspot

Cette méthode peut être employée comme outil diagnostique pour le cancer pour analyser l’ADN circulant de tumeur. Cette technique interroge l’altération génétique multiple dans les régions des mutations de faisceau dans une seule réaction. Cela permet d’économiser des échantillons précieux de patients.

Cette méthode peut fournir la perspicacité à la charge de tumeur sur son profil mutationnel. Il peut maintenant également être appliqué à une analyse moléculaire comme alternative à qPCR pour obtenir une quantification absolue des séquences cibles d’acide nucléique. Prélever des échantillons de sang dans des tubes EDTA de sept millilitres.

Deux tubes sont recommandés pour recueillir environ quatre millilitres de plasma. Centrifuger les échantillons de sang pendant 10 minutes à 820 fois la gravité dans les trois heures suivant la prise de sang pour séparer les globules rouges, les globules blancs et le plasma. Le temps entre l’échantillonnage et la centrifugation est essentiel pour obtenir de l’ADN sans cellule T de haute qualité qui n’est pas contaminé par l’ADN libéré par les globules blancs.

Après centrifugation, utiliser une pipette sérologique pour recueillir le supernatant sans toucher la couche de globules blancs. Environ deux millilitres de plasma sont habituellement récupérés par tube EDTA. Après avoir transféré les plasmes à deux tubes millilitres, centrifugez les aliquots à 16 000 fois la gravité pendant 10 minutes à 15 degrés Celsius pour enlever les débris cellulaires.

Recueillir soigneusement le plasma sans déranger la pastille et transférer sur deux tubes cryogéniques millilimétriques. Conserver à 80 degrés Celsius jusqu’à ce que nécessaire. Commencez par ajouter 400 microlitres de proteinase K à un tube de 50 millilitres.

Ajouter ensuite quatre millilitres de plasma et 3,2 millilitres de tampon de lyse ACL contenant un microgramme d’ARN porteur provenant du kit d’extraction. Fermer le tube et mélanger en tourbillonnant pendant 30 secondes pour obtenir une solution homogène. Puis, incuber à 60 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Après l’incubation, ajouter 7,2 millilitres d’ACB tampon au lysate pour optimiser la liaison des acides nucléiques circulants à la membrane de silice. Mélanger par vortex pendant 15 à 30 secondes. Ensuite, incuber le tube sur la glace pendant cinq minutes.

Fixez la colonne et l’extension de 20 millilitres sur la pompe à vide. Fermez les parties inutilisées pour permettre l’aspiration sous vide. Après avoir brièvement centrifugé le tube, introduire soigneusement le mélange dans l’extenseur du tube.

Ensuite, allumez la pompe à vide et laissez le lysate être tiré à travers les colonnes complètement. Retirer et jeter l’extenseur de tube. Ensuite, appliquez 600 microlitres de tampon ACW1 à la colonne.

Lorsque le tampon ACW1 a traversé la colonne, ajouter 750 microlitres de tampon ACW2, et enfin, 750 microlitres de 96 à 100% d’éthanol. Ensuite, placez la colonne dans un tube de collecte propre de deux millilitres et une centrifugeuse à pleine vitesse pendant trois minutes pour éliminer l’éthanol. Après avoir placé la colonne dans un nouveau tube de collecte de deux millilitres, ouvrez le couvercle, puis incubez à 56 degrés Celsius pendant 10 minutes pour sécher complètement la membrane.

Après l’incubation, placez la colonne dans un tube propre à faible liaison de 1,5 millilitre. Appliquez soigneusement 36 microlitres d’eau sans RNase avec de l’azide de sodium à 0,04 %. Ensuite, fermez le couvercle et incubez à température ambiante pendant trois minutes.

Centrifugeuse à pleine vitesse à nouveau pendant une minute pour élucider les acides nucléiques. Ensuite, conserver à 20 degrés Celsius négatifs jusqu’à ce que nécessaire. Commencez par décongeler et équilibrer les composants de réaction à la température ambiante dans un capot PCR propre.

Préparez ensuite un mélange 20 fois d’amorces et de sondes dans l’eau distillée sans RNase et dnase avec chaque amorce à 18 concentration de micromolaires et chaque sonde à cinq concentrations de micromolaires. Pour toutes les réactions pcr individuelles, préparer un mélange d’échantillons en combinant 10 microlitres de deux fois ddPCR Supermix, un microlitre de 20 fois les amorces et les sondes se mélangent, et jusqu’à 10 nanogrammes de l’échantillon d’ADN dans 20 microlitres d’eau distillée. Vortex le mélange de réaction à fond pour assurer l’homogénéité.

Et brièvement centrifugeuse pour recueillir le contenu au fond du tube avant la distribution. Insérez la cartouche ddPCR dans le support et chargez 20 microlitres de mélange de réaction d’échantillon dans les puits moyens de la cartouche pour la génération de gouttelettes. Ajouter 70 microlitres d’huile de générateur de gouttelettes dans les puits du fond.

Insérez la cartouche avec un joint dans le générateur de gouttelettes. Des gouttelettes seront produites dans les puits supérieur de la cartouche. Aspirez lentement et doucement 40 microlitres des gouttelettes des cartouches et distribuez-les dans une plaque PCR de 96 puits.

Sceller la plaque PCR finale avec du papier d’aluminium à l’aide d’un scellant de plaque immédiatement après le transfert des gouttelettes pour éviter l’évaporation. Centrifugez brièvement la plaque pour recueillir le contenu au fond des puits. Exécutez une amplification PCR conventionnelle sur un cycleur thermique.

Lorsque la course est terminée, centrifugez brièvement la plaque pour recueillir le contenu au fond des puits. Après amplification PCR, utilisez le lecteur de gouttelettes pour compter les gouttelettes négatives PCR positives et PCR suivant les instructions du fabricant. Voici les résultats représentatifs obtenus lors des étapes d’optimisation de l’analyse ddPCR de drop-off.

Cette image montre la détection de l’ADN mutant et de l’ADN de type sauvage dans une réaction contenant 100% d’ADN mutant, 5% d’ADN mutant, et 100% d’ADN de type sauvage. Cette image montre des exemples d’échantillons de plasma analysés avec les analyses kras et EGFR drop-off ddPCR montrant la détection de nucléotides simples et de substitutions multiples dans l’exon deux de KRAS et une suppression dans EGFR exon 19. Tout en essayant cette procédure, il est important de procéder soigneusement à chaque étape avec une attention particulière à la génération gouttelette, qui est une étape critique de cette méthode.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie à un chercheur et à un clinicien dans le domaine de la recherche sur le cancer afin d’optimiser l’analyse de la mutation tumorale à l’aide d’une biopsie liquide.