Name: Transfert d’embryon et vitrification d’embryons au stade optimal de l’embryon dans le modèle Rabbit (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Apprenez le transfert d'embryons par laparoscopie et la vitrification chez le lapin, un modèle animal idéal pour étudier la reproduction humaine. Ces techniques minimalement invasives permettent le stockage à long terme et le transport des embryons.

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Ce travail a été appuyé par des fonds du ministère de l’Economie et de la compétitivité de l’Espagne (AGL2017-85162-C2-1-R) et du programme de recherche Generalitat Valenciana (PrometeoII 2014/036). Version texte anglaise révisée par N. MacOwan English Language Service

Toutes les procédures expérimentales utilisées dans cette étude ont été effectuées conformément à la directive 2010/63/UE CEE pour les expérimentations animales et examinées et approuvées par le Comité d’éthique pour l’expérimentation des animaux de l’Universitat Politècnica de València, Espagne (code de recherche: 2015/VSC/PEA/00170). XGD, FMJ, MPVC et JSV détiennent un certificat d’autorisation délivré par l’administration gouvernementale valencienne pour expérimenter sur les animaux. XGD est autorisé à superviser in situ le bien-être et le soin des animaux pendant l’expérimentation.
1. transfert d’embryons
<ol><li>Préparation des femelles bénéficiaires
	<ol>
<li>N’utiliser que des femelles sexuellement matures (&gt; 4,5 mois).</li>
		<li>Une semaine avant ET, adaptez les femelles à un régime de 16 h de lumière/8 h d’obscurité pour initier la croissance folliculaire et améliorer la réceptivité féminine.</li>
		<li>Sélectionnez les femelles bénéficiaires, en observant la turgidité et la couleur de la vulve. Si la vulve est turgide et rougeâtre, la femelle est réceptive.</li>
		<li>Induire Pseudo (ovulation) par une seule injection intramusculaire de 1 μg d’acétate de buserelin (analogue synthétique de l’hormone libérant la gonadotrophine), quel que soit le poids corporel. NOTE: normalement, 0,8 μg est une dose appropriée pour l’induction de l’ovulation chez les lapins de taille moyenne (4-5 kg), donc 1 μg garantit généralement l’ovulation.</li>
		<li>Induire l’ovulation autant de jours à l’avance que l’âge des embryons à transférer (par exemple, 70-72 h avant la morula fraîche ET).</li>
	</ol></li>
	<li>Anesthésie et analgésie
	<ol>
<li>Peser le lapin et charger les anesthésiques et les analgésiques suivants.<ol>
<li>Dans une seringue de 1 mL avec une aiguille de 30G: charger la xylazine (5mg/kg) et le chlorhydrate de buprénorphine (0,03 mg/kg). Dans une autre seringue de 1 mL avec une aiguille périraniale de 23G, charger le chlorhydrate de kétamine (35 mg/kg).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Tenez le lapin et injectez le mélange de xylazine-buprénorphine par voie intramusculaire.</li>
		<li>Insérez l’aiguille périrânienne avec de la kétamine dans la veine auriculaire marginale, en introduisant lentement tout le contenu de la seringue par voie intraveineuse.</li>
		<li>Fixez l’aiguille et laissez-la insérée tout au long des étapes restantes pour administrer plus d’anesthésie si nécessaire.</li>
		<li>Laisser le lapin dans la cage (propre et sans autres animaux) sur une scène chaude.</li>
		<li>Une fois inconscient, appliquez la pommade oculaire pour éviter la sécheresse de l’œil et vérifier l’absence du palpébral Freflex. NOTE: ce protocole fournit un plan d’anesthésie chirurgicale pour un minimum de 30 min. Si un temps plus long est nécessaire, injecter des doses supplémentaires avec la moitié de la quantité de chlorhydrate de kétamine décrite dans 1.2.1 après 30 min.</li>
		<li>Surveillez la profondeur de l’anesthésie en vérifiant le réflexe de pédale et le mouvement respiratoire. Les changements dans le modèle respiratoire à un taux irrégulier et plus rapide indiquent la perte du plan approprié de l’anesthésie.</li>
		<li>Surveillez la couleur des muqueuses (yeux, lèvres, etc.), la fréquence respiratoire (30-60 respirations par minute), la fréquence cardiaque (120-325 battements par minute) et la température rectale (38-39,6 ° c).</li>
		<li>Huit heures avant le transfert, retenir la nourriture des animaux pour éviter la plus grande taille et l’activité de l’intestin jusqu’à ce que le processus ET est terminé. Laissez libre accès à l’eau.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation d’embryons
	<ol>
<li>Réchauffer le support de manipulation d’embryons à 25 ° c: milieu de base (BM), composé de la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) complétée par 0,2% (p/v) d’albumine sérique bovine.</li>
		<li>Travailler sous un stéréomicroscope, rincer les embryons frais ou décongelés (étape 2) avec BM.</li>
		<li>En utilisant des gants stériles, fixez un cathéter épidural 17G correctement configuré à une seringue de 1 mL.</li>
		<li>Aspirer 1 cm de BM dans le cathéter, suivi d’une petite bulle d’air.</li>
		<li>Aspirer 5-7embryons dans un volume de 10 μL de BM, suivi d’une autre petite bulle d’air.</li>
		<li>Terminer le chargement du cathéter en aspirant 1 cm de BM.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfert d’embryons
	<ol>
<li>Considérez l’utilisation de gants, de robe et de masque stériles pour assurer un environnement aseptique.</li>
		<li>Stériliser les instruments chirurgicaux, nettoyer les surfaces où la chirurgie sera effectuée, et essuyez-les avec 70% d’éthanol.</li>
		<li>Effectuer l’anesthésie comme indiqué précédemment (étape 1,2), la vérification de la perte de réflexes.</li>
		<li>Rasez la fourrure de l’abdomen ventrale avec un rasoir électrique.</li>
		<li>Préparez l’abdomen ventrale de façon aseptique.<ol>
<li>Nettoyez la zone chirurgicale et enlevez les poils restants. Laver la zone chirurgicale avec un savon au gluconate de chlorhexidine. Désinfecter la zone avec la solution de chlorhexidine et l’éthanol 96 º (3 fois).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Placez l’animal sur une table chirurgicale chaude, dans la position de Trendelenburg (la tête vers le bas à 45 °) pour s’assurer que l’estomac et les intestins sont situés crânien. Considérez l’évacuation de la vessie si elle est turgide. Si des viscères sont endommagés dans le processus, l’animal peut mourir. Il est donc important de les faire correctement localisés (figure 1).</li>
		<li>Couvrez la zone à l’aide d’une serviette stérile, avec un trou (fenestration) exposant la zone rasée, pour séparer le site chirurgical de toute zone contaminante potentielle.</li>
		<li>Insérer un trocart endoscopique de 5 cm dans la cavité abdominale, 2 cm caudale au processus xiphoïde, et insuffler à travers lui la cavité péritonéale avec un insufflateur mécanique régulant la pression. NOTE: la pression intra-abdominale doit être de 8-12 mmHg avec CO2 (figure 1a).</li>
		<li>Insérez la caméra endoscope à travers le trocart endoscopique (figure 1b). Note: Identifiez le tractus reproducteur, en déterminant l’État et la position de l’infundibulum et de l’ampoule avant et pour faciliter les prochaines étapes.</li>
		<li>Insérer l’aiguille épidurale de 17 G dans la région inguinale entre 2-3 cm de l’intérieur (figure 1b).</li>
		<li>Identifiez l’entrée de l’infundibulum (figure 2a, 2b).</li>
		<li>Insérez le cathéter chargé (étape 1,3) à travers l’aiguille épidurale dans l’abdomen (figure 1c).</li>
		<li>Localiser l’oviducte et insérer 1-2 cm du cathéter épidural à travers l’infundibulum de l’ampoule (figure 2a-2C). Ne pas progresser très loin dans l’oviducte pour éviter les dommages et les hémorragies.</li>
		<li>Relâcher les embryons dans l’oviducte en appuyant doucement sur le piston de la seringue couplé au cathéter (figure 2D-2F). Les deux bulles d’air doivent sortir du cathéter.</li>
		<li>Retirer le cathéter juste après la libération des embryons.</li>
		<li>Rincer le cathéter, aspirer et relâcher le fluide manipulateur pour vérifier l’absence des embryons et confirmer leur transfert réussi.</li>
		<li>Répétez les étapes 1.4.11 à 1.4.16 de l’autre côté de l’utérus, si désiré.</li>
		<li>Retirez l’aiguille épidurale et l’appareil photo endoscope.</li>
		<li>Relâchez CO2 à travers le trocar endoscopique. Si l’excès de gaz reste dans l’abdomen de l’animal, il aura de la douleur et de l’inconfort.</li>
		<li>Retirer le trotre endoscopique de la cavité abdominale. Enlevez la serviette chirurgicale.</li>
		<li>Arrêtez l’anesthésie.</li>
		<li>Nettoyez l’incision faite par le trocart avec une solution de chlorhexidine. Fermez l’incision faite par le trocart avec un aluminium micronisé et un pansement en plastique.</li>
	</ol></li>
	<li>Soins postopératoires
	<ol>
<li>Traiter les animaux avec des antibiotiques: 10 mg/kg d’enrofloxacine, sous-cutanée, tous les 24-h pendant 5 jours.</li>
		<li>Administrer des analgésiques: chlorhydrate de buprénorphine (0,03 mg/kg), par voie intramusculaire, chaque 12 heures pendant 3 jours; Méloxicam (0,2 mg/kg), par voie sous-cutanée, tous les 24-h pendant 3 jours.</li>
		<li>Surveillez les animaux pendant au moins 30 min après la chirurgie (selon l’animal et la dose d’anesthésie utilisée) en veillant à ce qu’ils récupèrent leurs conditions physiologiques.</li>
		<li>Identifiez le receveur (p. ex., tatouage d’oreille) et les animaux domestiques individuellement dans une cage propre avec l’état environnemental approprié.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58055/58055fig1.jpg"> Figure 1: transfert d’embryon laparoscopique assisté par laparoscopie (vue externe). A) insertion du trocart endoscopique (un port). B) insertion de la caméra endoscopique et de l’aiguille épidurale (flèche noire). C) insertion du cathéter de transfert d’embryon (flèche blanche) à travers l’aiguille épidurale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58055/58055fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58055/58055fig2.jpg"> Figure 2: transfert d’embryon laparoscopique assisté par laparoscopie (vue interne). A: Insertion du cathéter à travers l’aiguille épidurale dans la zone abdominale. L’astérisque indique l’infundibulum. B, C, D: Le cathéter chargé avec les embryons est inséré dans la région d’ampoule à travers l’infundibulum. E, F: Libération des embryons, confirmée par la visualisation d’un oviduct gonflé. Ce chiffre a été adapté de Marco-Jiménez et coll. 38 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58055/58055fig2large.jpg" target="_blank">veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
2. vitrification et réchauffement embryonnaires
<ol><li>Effectuer toutes les manipulations à température ambiante (environ 22 ° c) pour réduire la toxicité de la solution de vitrification à des températures plus chaudes. Remarque: les embryons peuvent être déplacés à l’aide de la pipette automatique 0,1-2 μL dans ce protocole, mais d’autres dispositifs similaires pour déplacer les embryons faisant glisser le volume minimum peuvent convenir.</li>
	<li>Vitrifiez les embryons dans une procédure d’addition en deux étapes:<ol>
<li>Placer les embryons pendant 2 minutes dans une solution équilibrante composée de 10% (v/v) d’éthylène glycol et de 10% (v/v) de diméthyl sulfoxyde dissous dans BM.</li>
		<li>Déplacer les embryons (à partir de l’étape 2.2.1) pendant 1 minute dans une solution de vitrification consistant en 20% (v/v) d’éthylène glycol et 20% (v/v) de diméthyl sulfoxyde dissous dans BM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Chargez les embryons dans un 125 μL de plastique (qui contient une extrémité fermée avec un bouchon de coton et un extrême ouvert). Le processus est schématisé dans la figure 3.<ol>
<li>Coupler l’extrémité fermée de 0,125 μL ministraw avec le microdistributeur approprié (p. ex. Captroll III®).</li>
		<li>Aspirate BM jusqu’à 1/3 de la longueur de la paille, suite à une petite bulle d’air.</li>
		<li>Aspirer les embryons dans un volume de 40 μL de solution de vitrification, suivi d’une autre petite bulle d’air.</li>
		<li>Aspirate BM jusqu’à ce que la première fraction liquide (étape 2.3.2) atteigne le coton.</li>
		<li>Fermez l’extrémité ouverte avec une prise de paille.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Effectuer l’étape 2.2.2 alors que l’étape 2,3 est en cours pour s’assurer qu’il ne s’écoule pas plus d’une minute, ce qui serait toxique pour les embryons.</li>
	<li>Plonger le ministraw directement dans l’azote liquide pour obtenir la vitrification.</li>
	<li>Stockez le ministraw dans un Dewar pour l’azote pour le temps désiré.</li>
	<li>Décongeler les embryons en une seule étape.<ol>
<li>Placer le ministraw horizontalement à 10 cm de la vapeur d’azote liquide pour 20-30 s.</li>
		<li>Lorsque le processus de cristallisation commence à l’intérieur du ministraw, immerger le ministraw dans un bain d’eau à 25 ° c pour 10-15 s.</li>
		<li>Retirez le bouchon ministraw et coupez le bouchon en coton.</li>
		<li>Avec un microdistributeur couplé, expulser tout le contenu du ministraw dans une assiette contenant 0,33 M de saccharose à 25 ° c en BM pendant 5 minutes. Remarque: cette étape doit être effectuée rapidement afin de réduire l’exposition de l’embryon à la solution de vitrification.</li>
		<li>Déplacez les embryons vers une nouvelle plaque contenant une solution BM pendant 5 min.</li>
		<li>Ne considérez que les embryons non endommagés (avec le manteau de mucine intact et la zona pellucida) pour continuer avec l’ET. NOTE: tenir compte du fait que, dans les embryons décongelés, les transferts asynchrones (p. ex., 60-62 h dans les transferts de morula) peuvent améliorer les résultats en permettant une resynchronisation entre l’embryon et l’endomètre maternel.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58055/58055fig3.jpg"> Figure 3: schématisation de la paille correctement chargée. A) BM fait référence à l’embryon manipulant les milieux utilisés pendant la vitrification. Les embryons doivent être chargés dans une solution de vitrification. B) aspect macroscopique de la paille chargée avec un détail magnifié de la position de l’embryon. Ce dispositif de grand volume nous permet de vitrifier un grand nombre d’embryons, contrairement aux appareils de volume minimum. En outre, la manipulation de cet appareil est plus facile par rapport aux dispositifs de volume minimum, tandis que les résultats sont similaires chez les lapins41. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58055/58055fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Depuis le premier cas de naissance en direct documenté d’embryons transférés9, cette technique et l’espèce de lapin sont devenues cruciales dans les études de reproduction. En outre, les études de recherche sur les embryons impliquant la manipulation, la production, la cryopréservation, etc. exigent comme dernière étape l’évaluation de la capacité embryonnaire pour générer une progéniture saine à long terme. Par conséquent, la technique de transfert d’embryon est indispensable<sup class="...

Dans le but de contourner l’infertilité humaine ou d’améliorer la diffusion du bétail de haute valeur génétique et de préserver les ressources génétiques animales, un ensemble de techniques appelées collectivement les technologies de reproduction assistée, telles que la superovulation, dans la fécondation vitro, la culture embryonnaire ou la cryoconservation ont été développées1,2. Actuellement, des traitements hormonaux sont donnés pour stimuler les ovaires et produire un grand nombre de follicules ovariens antraux1. Les ovocytes recueillis à partir de ces follicules peuvent être mûris, fécondés et développés in vitro jusqu’à ce qu’ils soient cryopréservés ou transférés aux mères porteuses3. Cependant, pendant ces traitements, les gamètes et les zygotes sont exposés à une série de processus non physiologiques qui pourraient nécessiter une adaptation embryonnaire pour survivre dans ces conditions4,5. Cette adaptation est possible en raison de la plasticité embryonnaire précoce, qui permet des changements d’embryon dans l’expression génique et la programmation du développement6. Cependant, ces modifications peuvent influencer les stades ultérieurs du développement embryonnaire jusqu’à l’âge adulte, et il est maintenant largement admis que les méthodes, le timing, la procédure de cryoconservation ou les conditions de culture montrent des résultats différents sur le destin embryonnaire7 , 8. par conséquent, pour élucider les effets induits spécifiques des ARTs, l’utilisation de modèles animaux bien caractérisés est inévitable.
La première naissance vivante documentée résultant du transfert d’embryons de mammifères a eu lieu en 18909. Aujourd’hui, le transfert d’embryons (ET) à une femelle porteuse est une étape cruciale dans l’étude des effets induits par l’ART pendant la préimplantation sur les stades ultérieurs de développement de l’embryon10. Les techniques de l’ET dépendent de la taille et de la structure anatomique de chaque animal. Dans le cas des modèles animaux de grande taille, il a été possible d’effectuer des ET par des techniques de l’ET non chirurgicales transcervicales, mais dans les espèces de plus petite taille, le cathétérisme du col de l’utérus est plus complexe et les techniques chirurgicales sont fréquemment utilisées11. Cependant, l’ET chirurgicale peut provoquer une hémorragie qui pourrait nuire au développement de l’implantation et de l’embryon, car le sang peut envahir la lumière utérine, causant la mort de l’embryon10. Les techniques transcervicales et non chirurgicales sont toujours appliquées chez les humains, les babouins, les bovins, les porcs et les souris12,13,14,15,16,17, mais chirurgicaux Les Ets sont toujours utilisés dans des espèces comme les chèvres, les moutons ou d’autres animaux qui présentent des difficultés supplémentaires10,18,19,20,21, comme les lapins (deux des cervices indépendants) ou des souris (de petite taille). Néanmoins, les méthodes de transfert chirurgical tendent à être graduellement remplacées par des méthodes moins invasives. L’endoscopie a été utilisée pour transférer des embryons, par exemple, chez les lapins, les porcs et les petits ruminants18,19,20. Ces méthodes d’endoscopie minimalement invasives peuvent être utilisées pour transférer des embryons dans l’ampoule par l’intermédiaire de l’infundibulum, qui est essentiel chez les lapins et a démontré des effets bénéfiques chez certaines espèces20. Ceci est basé sur l’importance du dialogue correct entre l’embryon et la mère pendant les stades précoces de l’embryon dans l’oviducte. Comme mentionné ci-dessus, le remodelage de l’embryon qui a lieu chez les lapins pendant la migration de l’embryon à travers l’oviducte est essentiel pour obtenir des embryons capables d’implanter22,23.
Les modèles animaux de grande taille, comme les bovins, sont intéressants parce que les caractéristiques biochimiques et préimplantatoires sont similaires à celles de l’espèce humaine24. Cependant, les grands animaux sont trop coûteux à utiliser dans les essais préliminaires, et les rongeurs sont considérés comme un modèle idéal (76% des organismes modèles sont des rongeurs) pour la recherche en laboratoire25. Néanmoins, le modèle de lapin offre quelques avantages par rapport aux rongeurs dans les études de reproduction, car certains processus biologiques de reproduction exposés par les humains sont plus semblables chez les lapins que chez les souris. Les humains et les lapins présentent une activation du génome embryonnaire similaire, la gastrulation et la structure du placenta hémochorial. En outre, l’utilisation de lapins, il est possible de connaître le moment exact de la fécondation et les stades de la grossesse en raison de leur ovulation induite25. Les cycles de vie de lapin sont courts, achevant la gestation en 31 jours et atteignant la puberté à environ 4-5 mois; l’animal est facile à manipuler en raison de son comportement docile et non-agressif, et son entretien est très économique par rapport aux frais des animaux plus grands. En outre, il est crucial de mentionner que les lapins ont un utérus duplex avec deux Cervixes indépendants11,25. Cela place le lapin dans une position préférentielle, car les embryons des différents groupes expérimentaux peuvent être transférés dans le même animal, mais dans une corne utérine différente. Cela nous permet de comparer les deux effets expérimentaux, réduisant ainsi le facteur maternel des résultats.
Aujourd’hui, les méthodes ET non chirurgicales ne sont pas utilisées chez le lapin. Certaines études réalisées à la fin des années 90 à l’aide d’une technique transcervicale et ont entraîné des taux de livraison faibles variant de 5,5% à 20,0%11,26 versus 50-65% par des méthodes chirurgicales, dont la procédure de laparoscopie décrite par Besenfelder et Brem18. Les faibles taux de réussite de ces méthodes non chirurgicales chez les lapins coïncident avec l’absence de remodelage embryonnaire nécessaire dans l’oviducte, ce qui est évité dans l’HE transcervicale. Ici, nous décrivons une procédure de l’HE laparoscopique efficace ET peu invasive utilisant des lapins comme organisme modèle. Cette technique fournit un modèle pour de nouvelles recherches sur la reproduction chez les grands animaux et les humains.
Étant donné que les lapins ont un créneau horaire particulièrement étroit pour l’implantation d’embryons, l’ET chez cette espèce exige un degré élevé de synchronie entre le stade de développement de l’embryon à et et l’état physiologique du receveur27. Dans certains cas, après un traitement reproductif qui ralentit le développement de l’embryon (comme la culture in vitro ) ou modifie la réceptivité de l’endomètre (comme les traitements de la superovulation), il n’y a pas de synchronie entre l’embryon et l’utérus maternel. Ces situations peuvent affecter négativement les résultats. Pour répondre dans ces contextes, nous décrivons un protocole efficace de vitrification de la morula de lapin qui nous permet de suspendre, d’organiser et de reprendre les expériences. Ce processus est logistiquement souhaitable pour les études de reproduction et nous donne la capacité de stockage à long terme des embryons, permettant leur transport. La procédure laparoscopique et les stratégies de cryoconservation permettent une meilleure planification des études avec moins d’animaux. Ainsi, notre méthodologie offre des avantages hygiéniques et économiques et est conforme au concept de 3Rs (remplacement, réduction et raffinement) de la recherche animale avec l’objectif déclaré d’améliorer le traitement humain des animaux expérimentaux. Ainsi, avec ces méthodes, les lapins constituent un organisme modèle idéal pour les essais de reproduction in vivo .

<table><tbody><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>VWR</td><td>332</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de buprénorphine</td><td>Alvet Escart&iacute ;</td><td>626</td><td>À commander par un vétérinaire agréé.</td></tr><tr><td>Buserelin Acétate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B3303</td><td></td></tr><tr><td>Savon au digluconate de clorethexidine</td><td>Alvet Escart&iacute ;</td><td>0265DCCJ500B</td><td></td></tr><tr><td>Solution de digluconate de clorhexidine</td><td>Alvet Escart&iacute ;</td><td>0265DCCA500B</td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>Air Liquide</td><td>99921</td><td>CO2 N48.</td></tr><tr><td>Incubateur CO2</td><td>Fisher</td><td>scientifique 15385194</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W387509</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s solution saline tamponnée au phosphate (DPBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5773</td><td>Sans chlorure de calcium.</td></tr><tr><td>Rasoir électrique</td><td>Oster Golden A5</td><td>078005-140-002</td><td></td></tr><tr><td>Caméra endoscope</td><td>Optomic Spain S.A</td><td>OP-714</td><td></td></tr><tr><td>Trocart endoscope avec valve en silicone</td><td>Karl Storz Endoscopia Ib&eacute ; rica S.A.</td><td>30114GK</td><td>Modèle de trocart léger.</td></tr><tr><td>Enrofloxacine</td><td>Alvet Escart&iacute ;</td><td>9993046</td><td>À commander par un vétérinaire agréé.</td></tr><tr><td>Aiguille Epicraneal 23G</td><td>Alvet Escart&iacute ;</td><td>514056353</td><td>Des aiguilles plus petites peuvent également être utilisées.</td></tr><tr><td>Cathéter épidural</td><td>Vygon corporate</td><td>187.10</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille péridurale</td><td>Vygon corporate</td><td>187.10</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene Glycol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>102466-M</td><td></td></tr><tr><td>Pommade oculaire</td><td>Alvet Escart&iacute ;</td><td>5273</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de kétamine</td><td>Alvet Escart&iacute ;</td><td>184</td><td>À commander par un vétérinaire agréé.</td></tr><tr><td>Appareil de laparoscopie</td><td>Karl Storz Endoscopia Ib&eacute ; rica S.A.</td><td>26003 AA</td><td>Hopkins&reg ; Laparoscope, laparoscope à vision droite de 0 mm, longueur de 30 cm, canal de travail de 5 mm.</td></tr><tr><td>Source lumineuse</td><td>Optomic Spain S.A</td><td>Fibrolux 250</td><td></td></tr><tr><td>Azote liquide</td><td>Air Liquide</td><td>P1505XXX</td><td></td></tr><tr><td>Insufflateur mécanique de CO2</td><td>Karl Storz Endoscopia Ib&eacute ; rica S.A.</td><td>Endoflateur&reg ;</td><td></td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>Alvet Escart&iacute ;</td><td>9993501</td><td>À commander par un vétérinaire agréé.</td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri, 35 mm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS430165-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Pansement plastique (Nobecutan)IBOR</td> <td>medica</td><td>7140028</td><td></td></tr><tr><td>Paille en plastique 0,25 mL</td><td>IMV - technologies</td><td>6431</td><td></td></tr><tr><td>Povidone solution iodure</td><td>Alvet Escart&iacute ;</td><td>02656DPYS500S</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5880</td><td>N’importe quel petit ciseau droit en acier de qualité chirurgicale ordinaire fera l’affaire.</td></tr><tr><td>Tube en silicone pour insufflateur</td><td>Karl Storz Endoscopia Ib&eacute ; rica S.A.</td><td></td><td></td>20400040</tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Leica</td><td>MZ16F</td><td>Il existe des options moins chères telles que Leica MZ8 ou Nikon SMZ-10 ou SMZ-2B, pour n’en nommer que quelques-unes.</td></tr><tr><td>Gants stériles</td><td>Alvet Escart&iacute ;</td><td>087GL010075</td><td></td></tr><tr><td>Blouse stérile</td><td>Alvet Escart&iacute ;</td><td></td><td></td>12261501</tr><tr><td>Masque stérile</td><td>Alvet Escart&iacute ;</td><td>058B15924B</td><td></td></tr><tr><td>Bouchon de paille</td><td>IMV - technologies</td><td>6431</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Seringue, 1 mL</td><td>Fisher scientific</td><td>11750425</td><td></td></tr><tr><td>seringue, 5 mL</td><td>Fisher scientific</td><td>11773313</td><td></td></tr><tr><td>Sonde urinaire</td><td>IMV - technologies</td><td>17722</td><td></td></tr><tr><td>Bain d’eau</td><td>RAYPA</td><td>BAE-4</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Alvet Escart&iacute ;</td><td>525225</td><td>À commander par un vétérinaire agréé.</td></tr><tr><td>Lapins</td><td>Universität Polit&egrave ; cnica de Val&egrave ; ncia</td><td>Ligne A</td><td>D’autres lignées maternelles, telles que la ligne V ou la ligne HP, peuvent être utilisées.</td></tr></tbody></table>

transfert d’embryon et vitrification d’embryons au stade optimal de l’embryon dans le modèle rabbit

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Les techniques de reproduction assistée (art), telles que la culture d’embryons in vitro ou la cryopréservation des embryons, affectent les schémas de développement naturel avec des conséquences périnatales et postnatales. Pour garantir l’innocuité des applications ART, des études sur des modèles animaux sont nécessaires. En outre, dans un dernier temps, les études sur le développement embryonnaire exigent une évaluation de leur capacité à développer des descendants sains à terme. Ici, le transfert d’embryon vers l’utérus est indispensable pour réaliser toute expérience liée aux ARTs.
Le lapin a été utilisé comme organisme modèle pour étudier la reproduction des mammifères depuis plus d’un siècle. En plus de sa proximité phylogénétique avec l’espèce humaine et sa petite taille et son faible coût d’entretien, il a des caractéristiques de reproduction importantes telles que l’ovulation induite, une chronologie du développement embryonnaire précoce semblable à l’homme et une courte gestation qui nous permettent d’étudier facilement les conséquences de l’application ART. De plus, les ARTs (comme l’injection intracytoplasmique de spermatozoïdes, la culture d’embryons ou la cryopréservation) sont appliqués avec une efficacité appropriée chez cette espèce.
En utilisant la technique de transfert d’embryon laparoscopique et le protocole de cryoconservation présenté dans cet article, nous décrivons 1) Comment transférer des embryons par une technique facile, minimalement invasive et 2) un protocole efficace pour le stockage à long terme du lapin d’embryons pour fournir des capacités logistiques flexibles et la capacité de transporter l’échantillon. Les résultats obtenus après le transfert d’embryons de lapins à différents stades de développement indiquent que la morula est le stade idéal pour la récupération et le transfert d’embryons de lapins. Ainsi, un transfert d’embryon oviducte est exigé, justifiant la procédure chirurgicale. En outre, les morulas de lapin sont vitrifiés avec succès et transférés par voie laparoscopique, prouvant l’efficacité des techniques décrites.

Le transfert laparoscopique mini-invasif d’embryons frais ou vitrifiés place le lapin parmi les meilleurs animaux modèles pour les études de reproduction. Le tableau 1 présente les résultats de l’HE fraîche à différents stades de développement (figure 4) des embryons transférés. Le taux de survie à la naissance (pourcentage d’embryons ayant entraîné un chiot) a prouvé l’efficacité de la technique laparoscopique décrite dans cet article. Les v...

Les techniques de procréation assistée (ARTs) sont en évaluation continue pour améliorer les résultats et réduire les risques associés. Ce manuscrit décrit une procédure de transfert d’embryons mini-invasive avec un protocole de cryoconservation efficace qui permet l’utilisation de lapins comme modèle animal idéal de reproduction humaine.

Transfert d’embryon et vitrification d’embryons au stade optimal de l’embryon dans le modèle Rabbit

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

L’objectif principal de cette expérience est de décrire une procédure laparoscopique de transfert d’embryons chez le lapin comme modèle. Le principal avantage de cette technique est que celui-ci travaille à transférer des embryons en utilisant une technique facile et mini-invasive. En outre, le protocole efficace de cryopréservation embryonnaire décrit ici travaille également au stockage à long terme des embryons de lapin, fournissant des capacités logistiques flexibles dans le temps et la capacité de transporter l’échantillon.Comme nous le savons, les technologies de procréation assistée font l’effet d’une évaluation continue afin d’améliorer les résultats et de réduire les risques associés. Par conséquent, en utilisant les deux techniques, le lapin peut être utilisé comme un modèle animal idéal de reproduction humaine pour répondre à des questions clés dans ce domaine, telles que les effets de la manipulation in vitro de l’embryon sur la progéniture. La démonstration visuelle de ces questions est essentielle car les étapes de transfert d’embryons sont difficiles à apprendre, car il doit être fait avec une grande précision pour assurer le succès de la technique.Pour la vitrification embryonnaire, immerger les embryons dans une solution d’équilibrage pendant deux minutes, suivie d’une incubation d’une minute dans la solution de vitrification. À la fin de l’incubation, charger les embryons dans une mini-paille en plastique de 125 microlitres et coupler l’extrémité fermée de la mini-paille avec un microdispenseur approprié d’un millilitre. Aspirer le milieu de base jusqu’à un tiers de la longueur de paille, suivi d’une petite bulle d’air.Ensuite, utilisez un stéréomicroscope pour aspirer les embryons dans 40 microlitres de solution de vitrification, suivi d’une autre petite bulle d’air et d’un milieu de base suffisant pour déplacer la première fraction liquide jusqu’au coton de la mini-paille. Ensuite, fermez l’extrémité ouverte de la mini-paille avec un bouchon de paille, plongez la mini-paille directement dans de l’azote liquide pour atteindre la vitrification, et stockez la mini-paille dans une dewar d’azote liquide. Pour décongeler les embryons pour un transfert, placez la mini-paille horizontalement à 10 centimètres de la vapeur d’azote liquide pendant 20 à 30 secondes.Lorsque le processus de cristallisation commence à l’intérieur de la mini-paille, immerger la mini-paille dans le bain d’eau de 25 degrés Celsius pendant 10 à 15 secondes. Retirez immédiatement les bouchons de mini-paille et de coton et utilisez un microdispenser couplé pour expulser le contenu de la mini-paille dans une assiette contenant un milieu de base de 25 degrés Celsius complété par une solution de saccharose molaire de 0,33, dans laquelle les embryons doivent rester pendant cinq minutes. Transférer ensuite les embryons dans une assiette de milieu de base frais pour une incubation de cinq minutes.Autant de jours avant que l’âge des embryons à transférer, observez la turgidité et la couleur des vulves des lapins femelles sexuellement matures disponibles de 4,5 mois, et induisez l’ovulation chez les animaux réceptifs avec une injection intramusculaire simple d’un microgramme d’acétate de buserelin indépendamment du poids corporel. Le jour du transfert, rincer les embryons frais ou décongelés dans un milieu de base de 37 degrés Celsius sous un stéréomicroscope et attacher un cathéter épidural de calibre 17 correctement configuré à une seringue d’un millilitre. Aspirer un centimètre de milieu de base dans le cathéter, suivi d’une petite bulle d’air.Puis aspirer cinq à sept embryons et 10 microlitres de milieu de base, suivi d’une autre petite bulle d’air, et un dernier centimètre de milieu de base. Une fois que les embryons ont été chargés, placez le lapin receveur anesthésié dans une cage à un stade de réchauffement et appliquez de la pommade sur les yeux de l’animal. Après avoir confirmé un manque de réponse au réflexe de pédale, raser la fourrure de l’abdomen ventral, nettoyer la zone chirurgicale avec du savon gluconate de chlorhexidine, et enlever tous les cheveux restants.Couvrez la zone d’un drapé stérile avec un trou pour la zone chirurgicale, et insérez un trocar endoscopique de cinq centimètres dans la cavité abdominale, deux centimètres caudal au processus zyphoïde, et utilisez un insufflateur mécanique régulateur de pression pour gonfler la cavité péritonéale. Insérez la caméra endoscope à travers la trocar endoscopique, et insérez l’aiguille épidurale de calibre 17 dans la région inguinale, à deux ou trois centimètres de l’infundibulum. Insérez le cathéter chargé à travers l’aiguille péridurale dans l’abdomen, et insérez un à deux centimètres du cathéter épidural à travers l’infundibulum dans l’ampulla.Déprimez doucement le piston cathéter pour libérer les embryons dans l’oviducte. Les deux bulles d’air doivent sortir du cathéter. Retirer le cathéter juste après la libération des embryons et aspirer et libérer le milieu restant pour confirmer l’absence des embryons.Après confirmation d’un transfert réussi des embryons, retirez l’aiguille péridurale et la caméra endoscope, et relâchez le dioxyde de carbone abdominal par le trocar endoscopique. Nettoyez l’incision trocar avec la solution de chlorhexidine, et fermez la plaie avec un aluminium micronisé et un pansement en plastique. Traitez ensuite l’animal avec les antibiotiques et analgésiques appropriés, et surveillez l’animal jusqu’à ce qu’il se rétablisse complètement.Le transfert minimal d’embryons laparoscopiques invasifs place le lapin parmi les meilleurs modèles animaux pour les études de reproduction, avec un pourcentage élevé d’embryons frais transférés entraînant un chiot. Notamment, des valeurs plus élevées sont atteintes lorsque le transfert d’embryons frais est effectué avec des embryons au stade précoce ou compact des morulae. Des résultats similaires sont observés après le transfert précoce et compacté de morula de lapin vitrifié, particulièrement avec le morulae compact, confirmant l’efficacité et la fiabilité de cette technique pour transférer les embryons in-vitrifiés frais chez les lapins.À la suite de cette procédure, d’autres méthodes comme les technologies de reproduction assistée conditionnelles peuvent être effectuées afin de répondre à d’autres questions comme la façon dont l’ajout de densités peut entraîner un effet analgésique plus tard dans la vie. Après un développement récent, cette technique ouvre la voie aux scientifiques dans le domaine de la reproduction pour explorer cet effet chez l’homme basé sur la distance phylogénétique étroite entre le lapin et l’homme. Ainsi, cette technique peut fournir des résultats facilement transférables à la médecine clinique humaine, ainsi que chez d’autres espèces de mammifères.N’oubliez pas que notre méthode offre certains avantages hygiéniques et économiques conformes au concept de trois R de bien-être animal, remplacement, réduction et raffinement, en ayant l’intention d’améliorer le traitement humain des animaux expérimentaux.

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Developmental Biology

Biologie du développement

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Apprenez le transfert d'embryons par laparoscopie et la vitrification chez le lapin, un modèle animal idéal pour étudier la reproduction humaine. Ces techniques minimalement invasives permettent le stockage à long terme et le transport des embryons.

Transfert d’embryon et vitrification d’embryons au stade optimal de l’embryon dans le modèle Rabbit

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