L’Identification des phéromones de la lamproie marine à l’aide de fractionnement Bioassay-guidé

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’écologie chimique, telles que l’identification des phéromones. Le principal avantage de cette technique est qu’elle relie de nouveaux composés à la fonction des phéromones. Pour commencer cette procédure, placez 15 à 30 lamproies marines mâles sexuellement matures dans un réservoir alimenté par 250 litres d’eau aérée du lac Huron, maintenue à 16-18 degrés Celsius.

Pour extraire l’eau conditionnée par extraction en phase solide, faites-la passer de la cuve via le système de pompage vers le haut de la colonne. L’eau passe à travers un lit de deux kilogrammes de résine échangeuse d’ions polymère modérément polaire contenue dans une série de quatre colonnes de verre d’une capacité d’un litre. Ensuite, retirez le solvant organique et récoltez l’extrait par évaporation rotative pendant cinq heures sous pression réduite à 40 degrés Celsius.

Pour isoler les flaques de fractions, faites tremper le gel de silice dans la phase mobile initiale pendant 30 minutes. Transférez le gel avec le solvant dans une colonne de verre et ouvrez sa valve pour permettre à la phase mobile de passer. Ensuite, mélangez soigneusement les extraits avec du gel de silice et chargez-les dans la colonne de chromatographie liquide sur le lit de gel de silice.

Éluez-les avec un gradient de 95 % de chloroforme à méthanol à 100 % de méthanol, ce qui donne un total de 2,5 litres, puis collectez l’éluant dans des flacons individuels de 10 millilitres. Par la suite, effectuez l’expérience CCM sur des plaques de gel de silice pré-enduites en appliquant l’échantillon sur la ligne de départ et en immergeant la ligne de départ de la plaque dans le solvant en développement dans un réservoir en verre scellé. Une fois que le solvant en développement a atteint la ligne finale, sortez la plaque du réservoir et attendez 10 minutes pour que le solvant s’évapore.

Visualisez les taches, d’abord sous une lumière UV à 254 nanomètres, puis colorez la plaque en la vaporisant avec une solution de méthanol acide à 5 % d’anisaldéhyde à l’aide d’un pulvérisateur de chromatographie et en la chauffant à 85 degrés Celsius pendant trois minutes. Ensuite, concentrez la fraction en un résidu par évaporation rotative sous pression réduite à 40 degrés Celsius pendant environ 30 minutes. Pour effectuer l’enregistrement EOG, remplissez les électrodes capillaires à pôles et les porte-électrodes à l’état solide, préfabriqués avec des pastilles de chlorure d’argent-argent, avec du chlorure de potassium à trois molaires à l’aide d’une micropipette.

Ensuite, insérez les électrodes à pôles dans les porte-électrodes. Ensuite, préparez 100 millilitres de 10 à moins cinq molaires de L-arginine dans de l’eau filtrée au charbon de bois à partir d’une solution mère de L-arginine de 10 à moins deux molaires dans de l’eau désionisée dans une fiole jaugée. Pour la courbe de réponse de concentration, préparer 10 millilitres de dilutions 10 fois des mélanges de fraction.

Maintenant, orientez une lamproie anesthésiée dans un support en forme de V et enveloppez-la avec une serviette en papier humide pour éviter la dessiccation. Insérez un tube d’eau aérée à recirculation contenant 50 milligrammes par litre de MS222 dans la cavité buccale. Ajustez le débit et assurez-vous que l’eau sort par les ouvertures branchiales pour irriguer continuellement les branchies.

Rincez le tube de distribution d’odorant avec de l’eau filtrée et connectez-le à la vanne montée sur un micromanipulateur. Ensuite, placez le tube capillaire de distribution d’odorant dans la cavité de l’épithélium olfactif pour fournir de l’eau filtrée à l’épithélium olfactif afin d’éviter la dessiccation lors de l’absence d’odorants. Ensuite, montez les électrodes d’enregistrement et de référence sur les micromanipulateurs.

Abaissez l’électrode de référence sur la peau externe près des narines. À l’aide du microscope stéréoscopique, abaissez l’électrode d’enregistrement pour qu’elle touche à peine la surface de l’épithélium olfactif. Par la suite, transférez l’absorption du tube de distribution d’odorant de l’eau filtrée de fond à la solution de L-arginine de 10 à moins cinq molaires.

Mettez l’ordinateur, l’amplificateur, le filtre et le numériseur sous tension. À l’aide du logiciel de commande de vanne, programmez la procédure pour administrer une impulsion unique de dorant de quatre secondes en cochant la case de T1, en réglant T sur quatre secondes et en cochant la case de T2.In le logiciel d’acquisition de données, réglez le mode d’acquisition sur un oscilloscope à grande vitesse. Cliquez sur l’icône Lecture, puis sur Démarrer dans le pilote de vanne pour déclencher l’impulsion d’odorant.

Commencez à enregistrer le contrôle à blanc, la L-arginine, puis les odorisants de faibles à fortes concentrations avec un rinçage de deux minutes d’eau filtrée entre les applications. Pour identifier les fractions comportementales actives, acclimatez la lamproie marine femelle sexuellement mature dans la cage de libération du labyrinthe pendant cinq minutes. Relâchez la lamproie marine et notez le temps cumulé qu’elle passe dans le chenal expérimental et le canal témoin, chacun contenant de l’eau de rivière, pendant 10 minutes.

Ensuite, appliquez le stimulus d’essai au canal d’essai attribué au hasard dans le véhicule au canal de commande à l’aide de pompes péristaltiques à des débits constants de 200 millilitres par minute pendant cinq minutes, puis appliquez le stimulus d’essai dans le véhicule pendant 10 minutes supplémentaires et enregistrez le temps cumulé que la lamproie passe dans les canaux d’essai et de contrôle. Dans cette procédure, purifiez davantage les fractions actives en composés avec la chromatographie d’exclusion stérique à l’aide d’une colonne sephadex LH-20. Préparez l’échantillon en 0,5 millilitre de la phase mobile initiale, en le chargeant dans la colonne de chloroforme en méthanol, puis dans la colonne de méthanol, et éluez les fractions actives pour obtenir le composé.

Dissoudre et diluer le composé purifié dans la phase mobile initiale de la HPLC pour former une solution de 10 microlitres d’environ un microgramme par millilitre. Ensuite, transférez la solution d’échantillon dans les flacons HPLC et placez-les dans l’échantillonneur automatique de HPLC. Injectez l’échantillon dans la spectrométrie de masse à ionisation par électronébulisation et enregistrez les spectres de spectrométrie de masse à ionisation par électronébulisation à haute résolution à l’aide d’un spectromètre de masse par chromatographie.

Dissoudre complètement l’échantillon dans les solvants deutérés sélectionnés pour former une solution dont la concentration varie approximativement de 0,1 à 10 milligrammes par millilitre. Transférez la solution d’échantillon dans un tube RMN pour enregistrer les spectres RMN 1D et 2D sur un spectromètre RMN de 900 mégahertz. On voit ici un spectromètre RMN de 600 mégahertz.

Cinq nouvelles phéromones présumées de lamproie marine ont été identifiées et leurs structures ont été élucidées à l’aide de méthodes spectrométriques et spectroscopiques. Ces phéromones présumées stimulaient l’épithélium olfactif de la lamproie marine adulte et présentaient de faibles seuils de détection dans les enregistrements d’électro-olfactogrammes. Dans les tests comportementaux en labyrinthe à deux choix, les lamproies marines femelles ovulées ont été attirées par la Petromyzone A, le Petromyzène A et le Petromyzène B, et repoussées par la Petromyzone C.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la cristallographie aux rayons X et les réactions de dérivatisation peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la stéréochimie des composés. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des produits naturels et de la neuroéthologie pour explorer la biosynthèse plausible et la fonction biologique des phéromones dans des organismes aquatiques comme la lamproie marine. N’oubliez pas que travailler avec du chloroforme peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que travailler avec la cagoule chimique, porter des gants et des lunettes de sécurité, doivent toujours être prises lors de la manipulation de ce réactif.