Name: L’Identification des phéromones de la lamproie marine à l’aide de fractionnement Bioassay-guidé (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Découvrez l'identification des phéromones de la lamproie marine par extraction en phase solide et chromatographie. Cette méthode lie de nouveaux composés à leur fonction phéromonale en écologie chimique.

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Nous remercions l’US Geological Survey Hammond Bay Station biologique pour l’utilisation de leurs installations de recherche et le personnel du U.S. Fish and Wildlife Service et Pêches et Océans Canada pour fournir de la lamproie marine. Cette recherche a été financée par des subventions de la Commission des pêcheries des grands lacs à Weiming Li et Ke Li.

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Poissons vivants dans un monde chimique de composés encore être identifiés. Guidée par bioessai fractionnement s’est avérée essentiel pour identifier et caractériser les molécules bioactives qui assurent la médiation de nombreuses interactions chimiques, tels que ceux observés en saumon masu31, éléphants d’Asie,32et la grande lamproie marine33, 34,35. Fractionnement guidée par ess...

Les phéromones sont des signaux chimiques spécifiques, libérés par les personnes qui les aident à localiser les sources de nourriture, détecter les prédateurs et médiation des interactions sociales de leurs congénères1. Communication de la phéromone chez les insectes a été bien étudiée2; Cependant, l’identification chimique et la fonction biologique des phéromones de vertébrés aquatiques n'ont pas été étudiées aussi largement. Connaissance de l’identité et la fonction des phéromones libéré peuvent être appliquées pour faciliter la récupération des espèces menacées,3,4 ou contrôle antiparasitaire espèces5,6. L’application de ces techniques nécessite l’isolement et la caractérisation des composants bioactifs de phéromone.
Identification de la phéromone est une branche de la chimie des produits naturels. Progrès dans la recherche de phéromone a été partiellement limité en raison de la nature des molécules phéromones eux-mêmes. Les phéromones sont souvent instables et publié en petites quantités, et seulement quelques techniques d’échantillonnage existent pour détecter des quantités infimes de volatiles7,8 ou des composés solubles dans l’eau9. Méthodes pour identifier les phéromones comprennent 1) un dépistage ciblé des composés connus, métabolomique) 2 et 3) guidée par bioessai fractionnement. Un dépistage ciblé des composés connus les tests disponibles dans le commerce des sous-produits métaboliques des processus physiologiques hypothétiquement fonctionnent comme des phéromones. Cette approche est limité parce que les chercheurs peuvent tester uniquement composés connus et disponibles. Toutefois, il a conduit à l’identification réussie des hormones sexuelles chez le poisson rouge qui fonctionnent comme phéromones10,11,12. La métabolomique est une deuxième approche d’identification de phéromone qui distingue les produits métaboliques potentiels de petites molécules dans un système biologique13. Une comparaison des profils métaboliques des deux groupes (c.-à-d., un actif contre un extrait inactif) permet l’identification d’un profil métabolique potentiel de qui le métabolite est épuré, la structure est élucidée et les bioactivité est confirmé14. Effets additifs ou synergiques des formulations complexes des mélanges spécifiques sont plus susceptibles d’être détectés avec la métabolomique, parce que les métabolites sont considérés ensemble plutôt que comme une série de fractions13. Pourtant, la mise en œuvre de la métabolomique repose sur la disponibilité des références synthétiques parce que les données qui en résulte ne facilitent pas l’élucidation des nouvelles structures.
Fractionnement guidée par essai biologique est une approche intégrée et itérative qui s’étend sur deux domaines : chimie et biologie. Cette approche utilise les résultats des essais biologiques physiologiques et comportementales pour guider l’isolement et l’identification d’un composé actif de phéromone. Un extrait brut est fractionné par une propriété chimique(p. ex., taille moléculaire, polarité, etc.) et testé avec enregistrements électro-olfactogramme (EOG) et/ou dans un test biologique. Les composants bioactifs sont éliminés en répétant ces étapes de fractionnement et EOGs et/ou biologiques. Les structures des composés actifs purs ont été dégagés par les méthodes spectrométriques et spectroscopiques, qui assurent le poids moléculaire et l’information structurale pour produire un modèle de ce composé à être synthétisé. Guidée par bioessai fractionnement peut produire divers métabolites et potentiellement roman phéromones avec des squelettes chimiques uniques qui ne risquent pas d’être prédites par les voies de biosynthèse.
Nous décrivons ici le protocole de fractionnement guidée par essai biologique utilisé pour isoler et de caractériser la bioactivité de la lamproie de mer mâle sex pheromone composés. La lamproie marine (Petromyzon marinus) est un modèle idéal de vertébrés pour étudier la communication phéromonale parce que ces poissons s’appuient fortement sur la détection olfactive des signaux chimiques d’arbitrer leur histoire de vie anadrome composé de trois étapes distinctes : les larves, juvénile et adulte. Larve de la lamproie marine se terrent dans les sédiments des cours d’eau douce, subissent une métamorphose radicale et de transforme en juvéniles qui migrent d’un lac ou l’océan où ils parasitent les poissons de la grande hostie. Après avoir détaché du poisson hôte, les adultes migrent vers des ruisseaux frayères, guidé par les phéromones migrateurs publiés par flux résident larves15,16,17,18,19 . Les mâles matures montent sur les frayères, libérer une phéromone de sexe multi-composants pour attirer des compagnons, frayer par intermittence pendant environ une semaine et puis mourir15,20. L’identification des phéromones de la lamproie marine est importante parce qu’une modulation du système de communication phéromone est parmi les options envisagées pour contrôler les lamproies marines envahissantes dans les Grands Lacs laurentiens21.

<table><tbody><tr><td>Capillaires en borosilicate à paroi standard de qualité supérieure avec filament&nbsp ;</td><td>Warner Instruments</td><td>G150F-4</td><td>Électrode d’enregistrement et de référence (OD 1,5 mm, ID 0,86 mm)</td></tr><tr><td>Instrument d’extraction de pipette</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td>tire des électrodes pour EOG</td></tr><tr><td>Coupe-verre à pointe de diamant</td><td>Pointe générique</td><td></td><td>d’électrodes pour EOG</td></tr><tr><td>Capillaires en verre borosilicaté</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B150-4</td><td>Tube de distribution d’odorant pour EOG</td></tr><tr><td>Porte-électrode d’enregistrement Série E corps droit avec pastille Ag/AgCl pour capillaire en verre OD 1,5 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>ESP-M15N</td><td>Porte-électrode d’enregistrement</td></tr><tr><td>Porte-électrode de référence Série E avec poignée avec&nbsp ; Granulés Ag/AgCl&nbsp ; pour capillaire en verre OD 1,5 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>E45P-F15NH</td><td>porte-électrode de référence</td></tr><tr><td>1 broche</td><td>Warner Instruments</td><td>WC1-10</td><td>pour pont porte-électrodes de référence et d’enregistrement</td></tr> 2 <tr><td>mm broche</td><td>Warner Instruments</td><td>WC2-5</td><td>pour pont porte-électrodes de référence et d’enregistrement</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma</td><td>A1296</td><td>gélose fondue pour remplir les électrodes</td></tr><tr><td>Chlorure de potassium (KCl)</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td>3M KCl pour le remplissage des électrodes et des porte-électrodes</td></tr><tr><td>Micropipette microfil</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF28G-5</td><td>pour le remplissage des électrodes et des porte-électrodes</td></tr><tr><td>L-Arginine</td><td>Sigma</td><td>A5006</td><td>odorant à contrôle positif pour EOG</td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Bain-marie</td><td>Sur mesure</td><td>N/A</td><td>maintient les odorisants pour EOG</td></tr><tr><td>Ester éthylique de l’acide 3-aminobenzoïque (MS222)</td><td>Syndel USA</td><td>Tricaïne1G</td><td>EOG anesthésique</td></tr><tr><td>Triéthiodide Gallamine</td><td>Sigma</td><td>G8134-5G</td><td>EOG paralytique</td></tr><tr><td>1 mL seringue</td><td>BD Biosciences</td><td>301025</td><td>pour administrer paralysant</td></tr><tr><td>Aiguille sous-cutanée 26G 5/8</td><td>BD Biosciences</td><td>305115</td><td>pour administrer paralysant</td></tr><tr><td>Pince à rouleau</td><td>World Precision Les instruments</td><td>14043-20</td><td>ajustent le débit d’anesthésique dans la bouche de la lamproie</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (NaCl)</td><td>J.T. Baker</td><td>3624-05</td><td>pour la préparation d’un support en plastique salin en forme de V à 0,9 %</td></tr><tr><td>comme étape d’échantillon N</td><td>/A</td> Fabriqué <td>sur mesure</td><td>pour maintenir la lamproie pendant l’EOG</td></tr><tr><td>Auge en plastique S.O.</td> sur <td>mesure</td><td></td><td>pour tenir le support en plastique en forme de V pendant l’EOG</td></tr><tr><td>Lames de scalpel - #11</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td>pour la dissection EOG</td></tr><tr><td>Manche de scalpel - #3</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td>pour la dissection EOG</td></tr><tr><td>Pince droite ultra fine</td><td>Outils de science</td><td>fine 11252-00</td><td>pour la dissection EOG, Dumont #5SF Pince</td></tr><tr><td>Pince ultra fine incurvée</td><td>Outils de science fine</td><td>11370-42</td><td>pour la dissection EOG, Moria MC40B</td></tr><tr><td>Ciseaux</td> <td>droitsOutils de haute science</td><td>15003-08</td><td>pour la dissection EOG</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Zeiss</td><td>Discovery V8</td><td>pour la dissection EOG</td></tr><tr><td>Lumière de l’illuminateur</td><td>Zeiss</td><td>CL 1500 ECO</td><td>pour la dissection EOG</td></tr><tr><td>Tube en plastique Générique</td><td></td><td></td><td>pour connecter la configuration EOG à recirculation et les bains-marie</td></tr><tr><td>Tube de distribution d’odorant Fabrication</td><td>sur mesure</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>In Filtre de ligne et joint d’étanchéité</td><td>Lee Company</td><td>TCFA1201035A</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateurs</td><td>Narishige</td><td>MM-3</td><td>pour positionner les électrodes et le tube capillaire de distribution d’odorant</td></tr><tr><td>Dispositifs de maintien magnétiques</td><td>Kanetec</td><td>MB-K</td><td></td></tr><tr><td>Pilote de vanne</td><td>Arduino</td><td>fabriqué sur mesure</td><td>pour contrôler l’ouverture de la vanne pour la stimulation des odeurs</td></tr><tr><td>Vanne électromagnétique Lee</td><td> Entreprise</td><td>LFAA1201618H</td><td>valve pour la stimulation des odeurs</td></tr><tr><td>NeuroLog Amplificateur AC/DC</td><td>Digitimer Ltd.</td><td>NL106</td><td>pour augmenter l’amplitude du préamplificateur DC du signal électrique</td></tr><tr><td>NeuroLog avec étage de tête</td><td>Digitimer Ltd.</td><td>NL102G</td><td>pour augmenter l’amplitude du signal électrique</td></tr><tr><td>Filtre passe-bas 60 Hz</td><td>Digitimer Ltd.</td><td>NL125</td><td></td></tr><tr><td>Numériseur</td><td>Molecular Devices LLC</td><td>Axon Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Ordinateur Dell (OptiPlex 745) exécutant le logiciel d’acquisition de données Axoscope</td><td>Molecular Devices LLC</td><td>AxoScope version 10.4</td><td></td></tr><tr><td>Cage de Faraday</td><td>Fabrication sur mesure</td><td>N/A</td><td>Blindage contre le bruit électromagnétique</td></tr><tr><td>Labyrinthe à deux choix Fabrication</td><td>sur mesure</td><td>N/A</td><td>contreplaqué imperméable de qualité marine recouvert d’une doublure en plastique</td></tr><tr><td>Pompe à ordures</td><td>Honda</td><td>WT30XK4A</td><td>remplit le labyrinthe avec de l’eau de la rivière voisine</td></tr><tr><td>Pompe péristaltique avec tube</td><td>Cole Parmer</td><td>Masterflex 07557-00</td><td>pour administrer les odorisants dans le labyrinthe</td></tr><tr><td>Générateur d’onduleur</td><td>Honda</td><td>EU1000i</td><td>alimente la pompe perstaltique</td></tr><tr><td>Cage de libération</td><td>sur mesure</td><td>N/A</td><td>utilisé pour acclimater la lamproie dans le labyrinthe</td></tr><tr><td>Maille</td><td>Générique</td><td></td><td>utilisé pour contenir les dimensions du labyrinthe et minimiser la turbulance de l’eau avec des rouleaux à mailles</td></tr><tr><td>Seaux (5 gallons)</td><td>Générique</td><td></td><td>pour mélanger les odorisants</td></tr><tr><td>Débitmètre</td><td>Marsh-McBirney</td><td>Flo-Mate 2000</td><td>pour mesurer la décharge</td></tr><tr><td>XAD 7 HP résine</td><td>Dow chimique</td><td>37380-43-1</td><td>pour l’extraction de l’eau conditionnée&nbsp ;</td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td>pour l’extraction d’eau conditionnée</td></tr><tr><td>Bain-marie</td><td>Yamato</td><td>BM 200</td><td>pour l’extraction de l’eau conditionnée</td></tr><tr><td>Lyophilisateur</td><td>Labconco</td><td>CentriVap Concentrateur</td><td>pour l’extraction de l’eau conditionnée</td></tr><tr><td>chloroforme</td><td>Sigma</td><td>CX1050</td><td>pour l’isolement des flaques de fractions</td></tr><tr><td>Gel de silice 70-230 mesh</td><td>Sigma</td><td>112926-00-8</td><td>pour l’isolation des pools de fractions Gel de</td></tr><tr><td>silice 230-400 mesh</td><td>Sigma</td><td>112926-00-8</td><td>pour l’isolation des pools de fractions</td></tr><tr><td>Silice pré-enduite gel plaques TLC</td><td>Sigma</td><td>99571</td><td>pour l’isolation des piscines de fractions</td></tr><tr><td>anisaldéhyde</td><td>Sigma</td><td>A88107</td><td>pour l’isolation des piscines de fractions</td></tr><tr><td>Sephadex LH-20</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0090-01</td><td>pour l’isolation des piscines de fractions</td></tr><tr><td>Amberlite XAD 7 HP résine</td><td>Sigma</td><td>XAD7HP</td><td>pour l’extraction de l’eau conditionnée&nbsp ;</td></tr><tr><td>4 colonnes de verre d’une capacité de 2,5 L</td><td>Ace Glass Inc.</td><td>5820</td><td>pour l’extraction d’eau conditionnée</td></tr><tr><td>Acétone</td><td>Sigma</td><td>650501</td><td>pour l’extraction d’eau conditionnée</td></tr><tr><td>TQ-S TOF LC Spectromètre de masse (ou équivalent)</td><td>Waters Co.</td><td>N/A</td><td>pour l’élucidation de la structure</td></tr><tr><td>Pompe HPLC binaire</td><td>Waters Co.</td><td>1525</td><td>pour l’isolement de bassins de fractions/composés</td></tr><tr><td>Spectromètre RMN Agilent, 900MHz (ou équivalent)</td><td>Agilent</td><td>N/A</td><td>pour l’élucidation de la structure</td></tr><tr><td>Système de séchage Rotovap</td><td>Buchi</td><td>RII</td><td>pour l’extraction d’eau conditionnée&nbsp ;</td></tr><tr><td>Lampe UV (254 nm)</td><td>Spectronics Co.</td><td>ENF-240C</td><td>pour la chromatographie sur couche mince</td></tr></tbody></table>

l’identification des phéromones de la lamproie marine à l’aide de fractionnement bioassay-guidé

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

Fractionnement guidée par essai biologique est une approche itérative qui utilise les résultats des essais biologiques physiologiques et comportementales pour guider l’isolement et l’identification d’un composé actif de phéromone. Cette méthode a entraîné la caractérisation réussie des signaux chimiques qui fonctionnent comme des phéromones dans un large éventail d’espèces animales. La lamproie marine se fient olfaction pour détecter les phéromones qui médient réponses comportementales et physiologiques. Nous utilisons cette connaissance de la biologie des poissons à proposer des fonctions de phéromones putatifs et pour guider l’isolement et l’identification des composantes de l’actif de phéromone. La chromatographie est utilisée pour extraire, se concentrer et de séparer les composés de l’eau conditionnée. Électro-olfactogramme (EOG) enregistrements sont effectuées pour déterminer quelles fractions provoquer des réponses olfactifs. Tests comportementaux labyrinthe deux choix sont ensuite utilisés pour déterminer si une des fractions odorantes sont également actif sur le plan comportemental et induire une préférence. Méthodes spectrométriques et spectroscopiques fournissent le poids moléculaire et l’information structurale pour aider à l’élucidation de la structure. L’activité biologique des composés purs se confirme avec EOG et tests comportements. Les réponses comportementales observées dans le labyrinthe en fin de compte doivent être validés qu’en milieu de terrain pour confirmer leur fonction dans un cadre de cours d’eau naturel. Ces essais biologiques jouent un rôle double pour 1) guider le processus de fractionnement et 2) confirmer et préciser la bioactivité des composants isolés. Ici, nous rapportons les résultats représentatifs d’une identification de phéromone de la lamproie marine qui illustrent l’utilité de l’approche guidée par bioessai fractionnement. L’identification des phéromones de la lamproie marine est particulièrement importante parce qu’une modulation de son système de communication de phéromone est parmi les options envisagées pour contrôler la lamproie de mer envahissante dans les Grands Lacs laurentiens. Cette méthode peut être facilement adaptée pour caractériser la communication chimique dans un large éventail de taxons et de faire la lumière sur l’écologie chimique d’origine hydrique.

Un schéma résumant les étapes décrites dans le protocole du fractionnement guidée par essai biologique est donné à la Figure 1. Le protocole, procédez comme pour les isoler et de caractériser la structure, la puissance olfactive et l’activité comportementale des 5 phéromones putatifs de la lamproie (Figure 2). À l’aide de la spectrométrie de masse et les données de la RMN (Figure 3 et <strong class="...

Nous présentons ici un protocole visant à isoler et de caractériser la structure, puissance olfactive et réaction de composés de phéromones putatifs de la lamproie marine.

L’Identification des phéromones de la lamproie marine à l’aide de fractionnement Bioassay-guidé

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’écologie chimique, telles que l’identification des phéromones. Le principal avantage de cette technique est qu’elle relie de nouveaux composés à la fonction des phéromones. Pour commencer cette procédure, placez 15 à 30 lamproies marines mâles sexuellement matures dans un réservoir alimenté par 250 litres d’eau aérée du lac Huron, maintenue à 16-18 degrés Celsius.Pour extraire l’eau conditionnée par extraction en phase solide, faites-la passer de la cuve via le système de pompage vers le haut de la colonne. L’eau passe à travers un lit de deux kilogrammes de résine échangeuse d’ions polymère modérément polaire contenue dans une série de quatre colonnes de verre d’une capacité d’un litre. Ensuite, retirez le solvant organique et récoltez l’extrait par évaporation rotative pendant cinq heures sous pression réduite à 40 degrés Celsius.Pour isoler les flaques de fractions, faites tremper le gel de silice dans la phase mobile initiale pendant 30 minutes. Transférez le gel avec le solvant dans une colonne de verre et ouvrez sa valve pour permettre à la phase mobile de passer. Ensuite, mélangez soigneusement les extraits avec du gel de silice et chargez-les dans la colonne de chromatographie liquide sur le lit de gel de silice.Éluez-les avec un gradient de 95 % de chloroforme à méthanol à 100 % de méthanol, ce qui donne un total de 2,5 litres, puis collectez l’éluant dans des flacons individuels de 10 millilitres. Par la suite, effectuez l’expérience CCM sur des plaques de gel de silice pré-enduites en appliquant l’échantillon sur la ligne de départ et en immergeant la ligne de départ de la plaque dans le solvant en développement dans un réservoir en verre scellé. Une fois que le solvant en développement a atteint la ligne finale, sortez la plaque du réservoir et attendez 10 minutes pour que le solvant s’évapore.Visualisez les taches, d’abord sous une lumière UV à 254 nanomètres, puis colorez la plaque en la vaporisant avec une solution de méthanol acide à 5 % d’anisaldéhyde à l’aide d’un pulvérisateur de chromatographie et en la chauffant à 85 degrés Celsius pendant trois minutes. Ensuite, concentrez la fraction en un résidu par évaporation rotative sous pression réduite à 40 degrés Celsius pendant environ 30 minutes. Pour effectuer l’enregistrement EOG, remplissez les électrodes capillaires à pôles et les porte-électrodes à l’état solide, préfabriqués avec des pastilles de chlorure d’argent-argent, avec du chlorure de potassium à trois molaires à l’aide d’une micropipette.Ensuite, insérez les électrodes à pôles dans les porte-électrodes. Ensuite, préparez 100 millilitres de 10 à moins cinq molaires de L-arginine dans de l’eau filtrée au charbon de bois à partir d’une solution mère de L-arginine de 10 à moins deux molaires dans de l’eau désionisée dans une fiole jaugée. Pour la courbe de réponse de concentration, préparer 10 millilitres de dilutions 10 fois des mélanges de fraction.Maintenant, orientez une lamproie anesthésiée dans un support en forme de V et enveloppez-la avec une serviette en papier humide pour éviter la dessiccation. Insérez un tube d’eau aérée à recirculation contenant 50 milligrammes par litre de MS222 dans la cavité buccale. Ajustez le débit et assurez-vous que l’eau sort par les ouvertures branchiales pour irriguer continuellement les branchies.Rincez le tube de distribution d’odorant avec de l’eau filtrée et connectez-le à la vanne montée sur un micromanipulateur. Ensuite, placez le tube capillaire de distribution d’odorant dans la cavité de l’épithélium olfactif pour fournir de l’eau filtrée à l’épithélium olfactif afin d’éviter la dessiccation lors de l’absence d’odorants. Ensuite, montez les électrodes d’enregistrement et de référence sur les micromanipulateurs.Abaissez l’électrode de référence sur la peau externe près des narines. À l’aide du microscope stéréoscopique, abaissez l’électrode d’enregistrement pour qu’elle touche à peine la surface de l’épithélium olfactif. Par la suite, transférez l’absorption du tube de distribution d’odorant de l’eau filtrée de fond à la solution de L-arginine de 10 à moins cinq molaires.Mettez l’ordinateur, l’amplificateur, le filtre et le numériseur sous tension. À l’aide du logiciel de commande de vanne, programmez la procédure pour administrer une impulsion unique de dorant de quatre secondes en cochant la case de T1, en réglant T sur quatre secondes et en cochant la case de T2.In le logiciel d’acquisition de données, réglez le mode d’acquisition sur un oscilloscope à grande vitesse. Cliquez sur l’icône Lecture, puis sur Démarrer dans le pilote de vanne pour déclencher l’impulsion d’odorant.Commencez à enregistrer le contrôle à blanc, la L-arginine, puis les odorisants de faibles à fortes concentrations avec un rinçage de deux minutes d’eau filtrée entre les applications. Pour identifier les fractions comportementales actives, acclimatez la lamproie marine femelle sexuellement mature dans la cage de libération du labyrinthe pendant cinq minutes. Relâchez la lamproie marine et notez le temps cumulé qu’elle passe dans le chenal expérimental et le canal témoin, chacun contenant de l’eau de rivière, pendant 10 minutes.Ensuite, appliquez le stimulus d’essai au canal d’essai attribué au hasard dans le véhicule au canal de commande à l’aide de pompes péristaltiques à des débits constants de 200 millilitres par minute pendant cinq minutes, puis appliquez le stimulus d’essai dans le véhicule pendant 10 minutes supplémentaires et enregistrez le temps cumulé que la lamproie passe dans les canaux d’essai et de contrôle. Dans cette procédure, purifiez davantage les fractions actives en composés avec la chromatographie d’exclusion stérique à l’aide d’une colonne sephadex LH-20. Préparez l’échantillon en 0,5 millilitre de la phase mobile initiale, en le chargeant dans la colonne de chloroforme en méthanol, puis dans la colonne de méthanol, et éluez les fractions actives pour obtenir le composé.Dissoudre et diluer le composé purifié dans la phase mobile initiale de la HPLC pour former une solution de 10 microlitres d’environ un microgramme par millilitre. Ensuite, transférez la solution d’échantillon dans les flacons HPLC et placez-les dans l’échantillonneur automatique de HPLC. Injectez l’échantillon dans la spectrométrie de masse à ionisation par électronébulisation et enregistrez les spectres de spectrométrie de masse à ionisation par électronébulisation à haute résolution à l’aide d’un spectromètre de masse par chromatographie.Dissoudre complètement l’échantillon dans les solvants deutérés sélectionnés pour former une solution dont la concentration varie approximativement de 0,1 à 10 milligrammes par millilitre. Transférez la solution d’échantillon dans un tube RMN pour enregistrer les spectres RMN 1D et 2D sur un spectromètre RMN de 900 mégahertz. On voit ici un spectromètre RMN de 600 mégahertz.Cinq nouvelles phéromones présumées de lamproie marine ont été identifiées et leurs structures ont été élucidées à l’aide de méthodes spectrométriques et spectroscopiques. Ces phéromones présumées stimulaient l’épithélium olfactif de la lamproie marine adulte et présentaient de faibles seuils de détection dans les enregistrements d’électro-olfactogrammes. Dans les tests comportementaux en labyrinthe à deux choix, les lamproies marines femelles ovulées ont été attirées par la Petromyzone A, le Petromyzène A et le Petromyzène B, et repoussées par la Petromyzone C.Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la cristallographie aux rayons X et les réactions de dérivatisation peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la stéréochimie des composés. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des produits naturels et de la neuroéthologie pour explorer la biosynthèse plausible et la fonction biologique des phéromones dans des organismes aquatiques comme la lamproie marine. N’oubliez pas que travailler avec du chloroforme peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que travailler avec la cagoule chimique, porter des gants et des lunettes de sécurité, doivent toujours être prises lors de la manipulation de ce réactif.

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