Identification et isolement des Oligopotent et des progéniteurs myéloïdes Lineage-commis de moelle osseuse de souris

Cette méthode pourrait être utile pour les hématologues et les immunologistes qui étudient la production et la fonction des cellules myéloïdes, y compris les neutrophiles, les monocytes et les cellules dendritiques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une identification plus précise des sous-ensembles de progéniteurs myéloïdes que les stratégies précédentes. Pour enrichir les cellules de la moelle osseuse pour les progéniteurs par tri cellulaire activé magnétiquement, ou MACS, granulez les cellules par centrifugation et remettez en suspension la pastille dans 40 microlitres de tampon de coloration MACS par un fois 10 aux sept cellules de la moelle osseuse.

Pour épuiser les cellules positives de la lignée différenciée, ajoutez 10 microlitres de cocktail d’anticorps à la biotine par fois 10 aux sept cellules et mélangez par pipetage pour une incubation de 10 minutes à quatre degrés Celsius. À la fin de l’incubation, ajoutez 30 microlitres de tampon de coloration par fois 10 aux sept cellules avec mélange, puis 20 microlitres de microbilles d’anti-biotine par une fois 10 aux sept cellules. Après 15 minutes à quatre degrés Celsius, lavez les cellules avec un millilitre de tampon de coloration par une fois 10 aux sept cellules et remettez la pastille en suspension dans 500 microlitres de tampon de coloration fraîche jusqu’à une fois 10 fois les huit cellules.

Ensuite, installez le séparateur magnétique automatisé selon les instructions du fabricant et placez le tube des cellules marquées dans le séparateur. Lancez le programme de sélection négative pour collecter la fraction négative qui contient les cellules négatives de lignée enrichies en progéniteurs. Granulez les cellules négatives de la lignée par centrifugation et remettez en suspension la cuiller, qui est maintenant blanche, dans deux millilitres de tampon de coloration par souris pour le comptage.

Pour isoler les cellules progénitrices myéloïdes par FACS, ajoutez une fois 10 à la cinquième cellule négative de la lignée à chacun des huit tubes de microcentrifugation de contrôle pour la sélection de tension et la compensation de couleur et ajoutez le reste de l’échantillon de cellule à un neuvième tube de microcentrifugation pour la coloration avec les sept anticorps marqueurs de surface d’intérêt pour l’identification et le tri des progéniteurs. Granulez les cellules par centrifugation et remettez en suspension les pastilles de contrôle dans 100 microlitres de tampon de coloration FACS et la pastille d’échantillon expérimentale dans 100 microlitres de tampon de coloration par cinq fois 10 aux six cellules. Ensuite, ajoutez l’anticorps anti-CD16/CD32 dans le tube de coloration unique du récepteur gamma Fc et le tube d’échantillon.

Agitez doucement et incubez les échantillons pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. À la fin de l’incubation, ajoutez les autres anticorps dans les tubes de coloration unique correspondants appropriés et dans le tube d’échantillon et, après un léger vortex, incubez les échantillons pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. À la fin de l’incubation, ajoutez 900 microlitres de tampon de coloration dans les tubes de contrôle et un millilitre de tampon de coloration par fois 10 aux sept cellules du tube d’échantillon pour la centrifugation.

Remettez en suspension les pastilles de contrôle dans 200 microlitres de tampon de coloration frais par tube et la pastille expérimentale dans 500 microlitres par 2,5 fois 10 aux sept cellules et transférez les cellules marquées dans des tubes FACS individuels correspondants de cinq millilitres. Ensuite, configurez le cytomètre en flux selon les protocoles standard et utilisez les commandes non colorées et monocolorées pour régler les tensions et les compensations de couleur. Pour identifier et isoler les cellules progénitrices myéloïdes, chargez l’échantillon de cellules expérimentales sur le cytomètre et créez un graphique de zone de diffusion directe par rapport à la zone de diffusion latérale, avec un gate pour exclure les débris et les cellules mortes.

Créez un tracé de la hauteur de diffusion vers l’avant en fonction de la largeur de diffusion vers l’avant des cellules vivantes et de la porte pour exclure les doublets. Répétez ce processus avec un graphique de hauteur de diffusion latérale en fonction de la largeur de diffusion latérale des singlets et de la porte de diffusion avant pour exclure les doublets. Créez un graphique et une porte Sca-1 en fonction de c-Kit pour sélectionner les progéniteurs négatifs positifs de Sca-1 c-Kit.

Créez ensuite un tracé et une porte de récepteur gamma CD-34 en fonction de FC pour sélectionner les populations mixtes de progéniteurs myéloïdes communs et de progéniteurs monocytaires granulocytaires mixtes. Il est important de repérer aussi précisément que possible les populations mixtes de progéniteurs myéloïdes myéloïdes communs et de progéniteurs monocytaires granulocytaires mixtes. Il peut être utile d’utiliser un graphique de densité de pseudo-couleurs ou un tracé de contour pour un contrôle plus précis.

Utilisez les cellules de la porte mixte du progéniteur myéloïde commun pour créer un graphique et une porte CD115 par rapport à Flt3 afin de sélectionner les cellules basses CD115 positives du progéniteur myéloïde commun Flt3, les cellules basses CD115 négatives du progéniteur myéloïde commun Flt3 et les progéniteurs de cellules dendritiques monocytaires CD115 positifs Flt3. Utilisez les cellules de la porte progénitrice des monocytes à granulocytes mixtes pour créer un tracé et une porte du récepteur gamma Ly6C par rapport à FC pour sélectionner les cellules négatives Ly6C et les cellules positives Ly6C. Créez ensuite un graphique CD115 en fonction de Flt3 pour chaque sous-population de cellules progénitrices de monocytes à granulocytes mixtes et identifiez les progéniteurs de monocytes à faible granulocyte Ly6C négatifs Flt3 négatifs, les progéniteurs à faible granulocytes Ly6C positifs Flt3 négatifs CD115 et les progéniteurs monocytaires à hauts granulocytes Ly6C positifs Flt3 négatifs CD115.

La déplétion maximale de la lignée est efficace pour appauvrir les cellules différenciées et pour enrichir les cellules progénitrices positives du c-Kit. La fraction négative de la lignée contient toujours des cellules négatives c-Kit, mais ces cellules seront éliminées lors des étapes ultérieures de contrôle de la cytométrie en flux. Les rendements des progéniteurs après le tri FACS peuvent varier en fonction des paramètres de tri utilisés, mais il devrait être possible d’obtenir entre une et quatre fois 10 à la quatrième cellule par fraction de chaque souris avec une pureté de post-tri supérieure à 95 % pour chaque fraction.

Une bonne coloration est essentielle pour une séparation nette des populations. Vous devrez peut-être titrer les anticorps ou choisir différents fluorophores pour assurer une séparation optimale. Ce protocole peut être utilisé pour identifier les cellules progénitrices afin d’évaluer les différences de composition de la moelle osseuse entre les échantillons, d’isoler les progéniteurs pour une analyse moléculaire ou d’évaluer leur capacité à produire des cellules myéloïdes.