Dosage spectrophotométrique du Phycobiliprotein en cyanobactérie Synechocystis

L’objectif global de ce protocole est de déterminer quantitativement la teneur en phycobiliprotéines de la cyanobactérie modèle Synechocystis à l’aide d’une méthode spectrophotométrique. Les phycobiliprotéines sont des complexes pigmentaires-protéines solubles dans l’eau qui représentent les principaux composants des antennes collectrices de lumière chez les cyanobactéries procaryotes et plusieurs groupes d’algues eucaryotes. Comme elles sont les principaux complexes de collecte de lumière, les phycobiliprotéines représentent l’un des facteurs cruciaux qui déterminent la productivité des algues et des cyanobactéries.

Synechocystis est un modèle de cyanobactérie qui est utilisé dans des centaines de laboratoires dans le monde. Synechocystis contient deux phycobiliprotéines, la phycocyanine et l’allophycocyanine. Ce protocole décrit une méthode simple, efficace et fiable pour la détermination quantitative des deux phycobiliprotéines dans cette souche de moisissure.

Nous avons comparé plusieurs méthodes, l’extraction de phycobiliprotéines et la quantification spectrophotométrique. La méthode de quantification doit être testée pour chaque souche, car les spectres d’absorption des phycobiliprotéines peuvent varier entre différentes souches. Au début de l’extraction des phycobiliprotéines, transférez un millilitre de culture de cyanobactéries dans un tube à verrouillage sûr.

Si vous décidez de déterminer le poids sec des échantillons, pesez les tubes vides avant l’échantillonnage de la culture. Assurez-vous que la culture n’est pas sédimentée. Centrifuger les cellules à 15 000 G à la température du laboratoire pendant cinq minutes.

Jetez soigneusement le surnageant. Assurez-vous de ne pas déranger le granulé. Mettez les échantillons au congélateur.

Pour un stockage à long terme, conservez les échantillons à 80 degrés Celsius. Ceci est nécessaire pour empêcher la dégradation des phycobiliprotéines. Une fois les échantillons congelés, insérez-les dans le lyophilisateur.

Une fois la lyophilisation commencée, vérifiez la température et la pression sur le lyophilisateur. La température doit être inférieure à 60 degrés Celsius et la pression doit être d’environ un hectare Pascal. Lyophilisez les échantillons pendant la nuit.

Après avoir terminé le cycle de lyophilisation, fermez les tubes dès que possible pour éviter la réabsorption de l’eau de l’air. Ajoutez quatre PC de billes de verre de deux millilitres dans chaque tube d’échantillon. Homogénéiser les échantillons avec les billes de verre pendant 15 secondes.

L’échantillon correctement homogénéisé est réparti sur toute la surface intérieure des tubes safe-lock. Après l’homogénéisation des cellules, ajoutez un millilitre de solution saline tamponnée au phosphate aux échantillons afin d’extraire les phycobiliprotéines. Le pH optimal du PBS est d’environ 7,4.

Mélangez les cellules avec le PBS pendant cinq secondes sur l’homogénéisateur. Cela garantira un mélange optimal des échantillons pour une extraction efficace des phycobiliprotéines. Après mélange, les échantillons sont verdâtres.

Conservez les échantillons sur de la glace pendant 60 minutes pour une extraction plus efficace des phycobiliprotéines. Après l’extraction, centrifugez les échantillons à 15 000 G et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Après centrifugation, le surnageant a une couleur bleu cyan.

Avant la mesure spectrophotométrique, étalonnez le spectrophotomètre en utilisant le PBS comme blanc. Une fois le spectrophotomètre étalonné, le PBS mis au rebut à partir d’une cuvette de spectrophotomètre et pipeter le surnageant avec des phycobiliprotéines extraites au lieu du tampon mis au rebut. Pour la quantification de la phycocyanine et de l’allophycocyanine, le surnageant avec les phycobiliprotéines extraites est mesuré à 615, 652 et 720 nanomètres.

Comme décrit dans le texte, il existe plusieurs équations pour la quantification des phycobilisomes connues dans la littérature. L’équation utilisée dans ce protocole s’est avérée être la meilleure corrélation entre les concentrations de phycocyanine et d’allophycocyanine en tant que pigments et points. Les étapes critiques du protocole sont l’homogénéisation et l’extraction des cellules, qui doivent fournir à la fois un rendement élevé et une spécificité élevée.

Nous avons testé plusieurs procédés d’extraction tels que la rupture des cellules par sonication, l’homogénéisation avec des billes de zircone ou la congélation des cellules. La méthode de ce protocole a fourni le rendement le plus élevé en phycobilisomes. Étant donné que même une petite contamination de l’extrait protéique par la chlorophylle peut entraîner une surestimation de la teneur en phycobiliprotéines, il est nécessaire d’éviter toute extraction de chlorophylle des cellules.

Nous avons détecté de la chlorophylle dans l’extrait brut, puis nous avons utilisé la sonication pour la perturbation cellulaire. Avec des cycles de sonication répétitifs, la concentration de chlorophylle augmentait. Le temps d’homogénéisation a été optimisé à 15 secondes.

L’homogénéisation pendant cinq secondes et 20 secondes a donné des rendements légèrement inférieurs. L’ajout de chlorure de sodium ou de potassium au tampon PBS ou à l’eau n’a pas augmenté l’efficacité de l’extraction des phycobiliprotéines, tout comme l’extraction dans un tampon d’acétate de sodium. Le temps d’extraction des phycobiliprotéines a été optimisé pendant 60 minutes, car après 120 et même 240 minutes, la concentration en phycobiliprotéines n’a pas changé de manière significative.

Assurez-vous que l’absorbance à 615, 652 et 720 nanomètres correspond à la plage d’absorbance proche du spectrophotomètre. Le spectrophotomètre utilisé dans ce protocole montre que la plage d’absorbance proche est comprise entre 0,1 et trois. Nous avons comparé plusieurs équations de quantification spectrophotométrique des phycobiliprotéines connues de la littérature.

L’équation de Bennett et Bogorad a fourni la meilleure reconstruction de la teneur en phycocyanine et en allophycocyanine dans les étalons de pigment avec des concentrations de protéines connues. Les différences entre les équations individuelles sont liées aux variations des coefficients d’extinction des phycobiliprotéines de l’organisme spécifique. L’utilisation de sulfate de streptomycine n’a pas entraîné de réduction de la chlorophylle A dans les échantillons où la sonication a été appliquée ou évitée.

Comme données représentatives, nous avons déterminé le contenu des phycobiliprotéines dans les cellules de Synechocystis. La teneur en phycobiliprotéines diminuait avec l’augmentation de la lumière. Le protocole a été établi pour minimiser le temps et les besoins en équipement pour l’analyse écrite des pigments qui peut être effectuée dans n’importe quel laboratoire standard de science en direct.

En outre, le protocole contient deux autres étapes, telles que la lyophilisation de la pastille cellulaire et l’extraction des protéines. Le temps total de travail pour la quantification des phycobilisomes ne dépasse pas deux heures.