Name: Profil de compatibilité biologique sur les biomatériaux pour la régénération osseuse (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Découvrez une stratégie multidisciplinaire pour tester la biocompatibilité des biomatériaux orthopédiques destinés à la régénération osseuse. Cette méthode combine techniques in vitro et in vivo pour évaluer l'efficacité et les réponses immunitaires.

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Ce projet de recherche a reçu financement du septième Programme-cadre (7e PC/2007-2013) de l’Union européenne au titre de la subvention contrat no 263363.

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ici, nous montrons une approche multidisciplinaire pour l’évaluation préclinique de la biocompatibilité des biomatériaux représentatif mis au point pour la réparation et la régénération osseuse. Nous avons testé les réponses de l’OBs, OCs, et la réponse de guérison in vivo dans un défaut critique OS modèle de souris ainsi que in vitro et in vivo des réponses immunitaires. L’étude visait à démontrer comment les tests fonctionnent et résument les données et les conclusions tirées de l’examen des ...

La réparation osseuse est un processus complexe qui commence par la formation d’un hématome, une inflammation, Cal formation et remodelage puis1,2. Toutefois, le potentiel de régénération osseuse est limité à la taille de l’OS fracture1,3. Par exemple, les fractures des os grand causées par un traumatisme, le cancer ou l’ostéoporose ne peuvent pas guérir et sont appelées fractures osseuses non syndiqués. Ces lésions osseuses nécessitent souvent des traitements pour promouvoir la régénération et la réparation osseuse physiologique sain. Actuellement, autogreffe et allogreffe osseuse transplantation est l’approche de choix4 avec les procédures de remplacement des OS 2,2 millions par an5. Bien que ces procédures ont un taux de réussite élevé, il peut y avoir des complications, par exemple, la disponibilité limitée des os, infection, morbidité du site donneur et rejet4. De nouvelles alternatives pour l’ingénierie tissulaire osseuse sont recherchés pour relever ces défis.
La conception des biomatériaux à base de polymères naturels ou synthétiques, des biocéramiques ou des métaux en combinaison avec les cellules et molécules bioactives est sur l' élévation6. Notre compréhension actuelle des os physiologiques de guérison et de guérison dans le contexte des biomatériaux dépend de divers facteurs tels que les propriétés mécaniques et de multiples facteurs les et systémiques, y compris les cellules de la circulation et le site de fracture7 ,8,9. Biomatériaux pour la régénération osseuse vise à promouvoir les osteogenicity et ostéointégration10 et est idéalement biocompatible et biodégradable poreux (promotion de nutriments, l’oxygène et la migration cellulaire). Ils doivent également être suffisamment solide pour supporter le site fracture pour soulager la douleur. En outre, des facteurs inflammatoires sont tenus d’engager le processus de guérison. Toutefois, si le biomatériau induit une inflammation excessive et réactions allergiques, cela pourrait limiter ou inhiber l’OS guérison11,12. Ainsi, une approche interdisciplinaire est nécessaire pour évaluer les biomatériaux destinés à la réparation osseuse.
Dans cette étude, nous présentons une évaluation préclinique de matières représentatives, 1) Orthovita Vitoss mousse qui est un substitut de greffe disponible dans le commerce d’os spongieux consistant en phosphate tricalcique composée de taille nanométrique pur β tricalcique les particules de phosphate (β-TCP) et collagène bovin de Type 1 (C) (β-TCP/C mousse) et 2) des disques de β-TCP. Ici, nous illustrons test de biocompatibilité de ces biomatériaux à l’aide des ostéoblastes primaires (OB) et dosages des ostéoclastes (OC), un modèle in vivo de la réparation osseuse, une évaluation immunologique comprenant in vitro la prolifération des lymphocytes T et la production de cytokines et in vivo de l’immunogénicité et l’allergénicité, comme indiqué précédemment13.

profil de compatibilité biologique sur les biomatériaux pour la régénération osseuse

Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration

Fractures osseuses importantes de non syndiqués sont un défi en chirurgie orthopédique. Bien qu’auto - et greffe osseuse allogénique est excellente pour la guérison des lésions, il y a des complications potentielles à leur utilisation. Ainsi, matériels scientifiques mettent au point des biomatériaux synthétiques, biocompatibles pour résoudre ces problèmes. Dans cette étude, nous présentons une plateforme multidisciplinaire pour l’évaluation de biomatériaux pour la réparation osseuse. Nous avons combiné expertise biologie osseuse et d’immunologie de développer une plate-forme y compris in vitro ostéoclastes (OC) et dosages des ostéoblastes (OB) et in vivo de modèles murins de la réparation osseuse, immunogénicité et d’allergénicité. Nous montrent comment réaliser les expériences, résument les résultats et rapport sur la biocompatibilité de biomatériau. En particulier, nous avons testé la viabilité de l’OB, la différenciation et minéralisation et viabilité OC et différenciation dans le contexte des disques de β-tricalcium phosphate (β-TCP). Nous avons aussi testé une mousse (β-TCP/C) de β-TCP/collagène qui est un matériau disponible dans le commerce, utilisé en clinique pour la réparation osseuse dans un modèle murin de taille critique de substance osseuse défaut pour déterminer les effets sur la première phase de cicatrisation osseuse. Dans des expériences parallèles, nous avons évalué les réponses immunitaires et allergiques chez les souris. Notre approche génère un profil de compatibilité biologique d’un biomatériau osseux avec une gamme de paramètres nécessaires pour prédire la biocompatibilité des biomatériaux utilisés pour la guérison osseuse et la réparation chez les patients.

Pour évaluer le β-TCP pour son efficacité comme un biomatériau pour la réparation osseuse, nous avons utilisé in vitro et in vivo méthodes de dépistage. Tout d’abord, nous avons mesuré les réponses OB sur les disques de β-TCP comparées aux témoins seul moyen de base. La figure 2 montre la viabilité de l’OB en réponse à des disques de β-TCP à 7 et 14 jours de culture. La viabilité cellulaire mesurée à partir des cellules métaboliquement activ...

Le nombre de nouveaux biomatériaux conçus pour réparer les lésions osseuses importantes est en expansion continue dans le but d’améliorer la guérison osseuse et surmonter les complications associées à la transplantation osseuse. Nous présentons ici une stratégie multidisciplinaire pour les tests de biocompatibilité préclinique de biomatériaux pour la réparation osseuse.

Profil de compatibilité biologique sur les biomatériaux pour la régénération osseuse

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such ...

Ces méthodes peuvent aider à répondre aux questions clés dans le domaine des biomatériaux. En particulier pour la régénération osseuse. Ils sont utilisés pour évaluer l’efficacité des biomatériaux et les réponses immunitaires potentielles.Le principal avantage de cette plate-forme multidisciplinaire est qu’elle fournit une gamme de paramètres pour prédire la biocompatibilité des biomatériaux utilisés pour la réparation osseuse. Les implications de ces techniques osseuses in vitro et in vivo s’étendent à d’autres troubles osseux. En raison de la nécessité d’un dépistage préclinique de nouveaux biomatériaux orthopédiques.La méthodologie dermatologique peut fournir un aperçu des biomatériaux pour la guérison osseuse, il peut également être appliqué aux évaluations biomatériaux pour toute autre indication clinique. Aspirer le milieu de culture des ostéoblastes primaires 14 jours après l’ajout du milieu ostéogénique de minéralisation. Rincer deux fois avec 0,5 millilitres de 1X PBS.Ensuite, fixez les cellules en ajoutant 0,5 millilitres de solution formaline tamponnée à 10 % et en couveant à température ambiante pendant 10 minutes. Après 10 minutes, aspirer la formaline tamponnée à 10 % avec un pipet à usage unique et laver deux fois avec 0,5 millilitres d’eau ultrapure. Ajouter ensuite 250 microlitres de solution de coloration Alizarin Red S de 40 millimolaires aux ostéoblastes fixes.Et incuber la plaque à température ambiante pendant 10 minutes sur un shaker à 100 shakes par minute. Après l’incubation avec la solution de coloration, aspirer la solution de coloration avec un pipet à usage unique et rincer avec un millilitre d’eau ultrapure. Répétez cette étape cinq à dix fois jusqu’à ce que la solution de rinçage se dégage clairement pour enlever les taches non spécifiques.Après avoir aspiré le lavage final, ajouter un millilitre de PBS froid. Et incuber la plaque à température ambiante pendant 10 minutes sur un shaker comme avant. Ensuite, transférez les disques tachés de phosphate bêta tricalcium dans un nouveau puits et numérisez les plaques à l’aide d’un scanner à plate-forme pour enregistrer la minéralisation.Après la capture d’image, ajouter 250 microlitres de 10% de solution de chlorure de cetylpyridinium et agiter pendant 15 minutes pour extraire le colorant Alizarin Red S. Ensuite, transférez la solution des puits aux tubes individuels de 1,5 millilitres et à la centrifugeuse à 17 000 x g pendant cinq minutes à température ambiante. Diluer l’extrait avec 10% de solution de chlorure de cetylpyridinium à une ration de dilution de 1:10 à 1:20 dans un tube de 1,5 millilitre.Transférer ensuite 300 microlitres de chaque échantillon dilué dans les puits de la plaque de 96 puits. Inclure deux puits vierges contenant seulement 10 % de chlorure de cetylpyridinium. Ensuite, préparez sept normes de référence Alizarin Red S allant de 4 400 micromolaires en diluant la solution de coloration Alizarin Red S de 40 milliomolaires avec une solution de chlorure de cetylpyridinium à 10 % pour générer une courbe standard.Chargez 300 microlitres de chaque norme dans la plaque. Enfin, lisez les absorbants des échantillons, des blancs et des normes de référence à 520 nanomètres. Isoler les précurseurs de l’ostéoplaste de moelle osseuse des fémurs et du tibia d’une souris euthanasié en utilisant des ciseaux stériles pour enlever les jambes du corps à l’articulation de la hanche.Couper les membres aux articulations du genou et de la cheville et enlever les tissus mous avec le scalpel stérile et les forceps. Coupez les épiphyses. Insérer une aiguille de calibre 27 attachée à une seringue remplie d’un millilitre de milieu de croissance osseuse dans le lumen et rincer la moelle dans une boîte de Pétri stérile de six centimètres.Après avoir répété cela pour tous les fémurs et tibiae, transférer la suspension cellulaire à un tube conique de 50 millilitres. Laver la boîte de Pétri de six centimètres avec cinq millilitres de milieu de croissance osseuse et la transférer dans le même tube conique de 50 millilitres. Centrifugeuse à 350 x g à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.Après centrifugation re-suspendre les cellules en un millilitre par puits de milieu de différenciation ostéoclaste. Une souris BALB/c fournit un nombre suffisant de précurseurs ostéoclastes pour une plaque de culture de 24 puits. Ajouter les ostéoblastes primaires suspendus dans le milieu de croissance osseuse sur le biomatériau et les contrôles à 8,8*10^4 cellules par centimètre carré.Des disques de phosphate de tricalcium bêta, l’os bovin commandé, et le plastique de culture de tissu sont utilisés ici. Incuber à 37 degrés Celsius en cinq pour cent de dioxyde de carbone pendant 24 heures. Après 24 heures, ajouter des précurseurs ostéoclastes de moelle osseuse fraîchement isolés et un milieu de différenciation ostéoclaste aux ostéoblastes primaires cultivés et retourner à l’incubateur pour cinq jours de culture à 37 degrés Celsius à 5 % de dioxyde de carbone.Remplacez le milieu par un milieu de différenciation ostéoclaste fraîchement préparé tous les deux jours. Tacher ensuite les ostéoclastes pour la phosphatase acide résistante au tartrate pour évaluer la différenciation. Raser le cuir chevelu d’une souris BALB/c anesthésiée de huit semaines et nettoyer la surface avec une solution d’iode à 7,5 % de povidone et 70 % d’éthanol.Couvrez les yeux d’onguent ophtalmique pour éviter le séchage pendant l’intervention. Assurer un niveau approprié d’anesthésie par manque de réaction à un pincement d’un outeil et de la queue. Puis, après avoir fait une incision sagittale midline enlever les tissus conjonctifs paracranium au-dessus de l’os pariétal droit en le raclant avec un scalpel.Ensuite, utilisez une tréphine dentaire stérile d’un diamètre de quatre millimètres à 2000 rotations par minute pour créer un défaut de taille critique dans l’os pariétal droit. Irriguer constamment la région avec la solution saline stérile tout en encoche l’os pariétal droit et en coupant à travers l’ectocortext et un peu d’endocortex. Pour éviter les dommages au Dera Mater, utilisez un petit ascenseur periosteal pour percer l’endocortex restant.Ensuite, utilisez des forceps pour soulever soigneusement l’os calvarial et l’enlever. Le défaut qui en résulte doit être circulaire et d’environ 3,5 millimètres de diamètre. Ensuite, remplissez le défaut calvarial avec la mousse de collagène de phosphate de tricalcium bêta, présoaked dans PBS stérile.Pour maintenir le biomatériau en place, appliquez 0,5 microlitres d’adhésif tissulaire à la fin du défaut à deux points opposés. Ensuite, fermez la peau avec une suture nonabsorbable. Placez une souris anesthésiée sur le dos, rasez la fourrure abdominale et nettoyez la surface rasée avec une solution d’iode à 7,5 % de povidone et 70 % d’éthanol.Après avoir fait une incision médiane de huit millimètres de long à travers la peau le long du linea alba de l’abdomen, implant PBS imbibé biomatériau sous la peau. Puis suture de la peau avec une suture nonabsorbable. Huit semaines après l’implantation, exciser le site d’implantation avec les tissus environnants de la souris euthanasiée.Cette image démontre que la croissance sur les disques de phosphate de bêta-tricalcium montrés dans les barres ouvertes n’affecte pas la viabilité d’osteoblast comparée à la croissance sur le plastique de culture de tissu à sept et 14 jours de culture. Des ostéoblastes cultivés ont été tachés avec Alizarin Red S après 14 jours. La minéralisation était plus élevée pour les contrôles moyens de minéralisation que pour les ostéoblastes cultivés dans le seul milieu.Et sur les disques de phosphate bêta tricalcium dans les puits de culture de suspension. Quand un défaut calvarial chirurgicalement-induit de taille critique a été laissé vide, une couche mince couvrant le défaut entier a été observée, mais aucune formation significative d’os n’était présente à 12 semaines après opération. En revanche, quand le défaut a contenu la mousse bêta de collagène de phosphate de tricalcium, les restes de mousse entourés du tissu fibreux dense comprenant quelques vaisseaux sanguins et cellules inflammatoires ont ponté la zone de défaut sans évidence de formation d’os.Après l’implantation sous-cutanée de mousse de collagène de phosphate de bêta-tricalcium, une réponse inflammatoire avec des cellules géantes étrangères de corps a été observée sur des sections hematoxyline et eosin-souillées une évidence de fibrose sur Masson' sections trichromes tachées à huit semaines. En revanche, le site d’implantation des contrôles factices a eu l’inflammation minimale et aucune fibrose. Tout en essayant cette procédure, il est important de faire des ensemblages précis et reproductibles du calvarium sans blesser l’animal.Suivant les autres méthodes de cette procédure comme les tests de différenciation ostéoclaste et le débit élevé dans les modèles immunitaires péritonéaux peuvent être préformés afin de répondre à des questions supplémentaires comme la réponse de l’ostéoclaste aux biomatériaux et le type de réponse immunitaire.

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Cette étude a établi un modèle de défaut semi-segmentaire fémoral chez le rat afin d’évaluer la performance mécanique et ostéogénique des matériaux de substitution osseuse dans des conditions portantes, sans recours à fixation interne ou externe.

Modèle de défaut osseux diaphysaire semi-segmentaire chez les rats pour évaluer la performance des substituts osseux dans les régions portantes

Nous proposons un protocole pour évaluer la régénération osseuse à différents niveaux hiérarchiques. Cette approche multimodale permet une analyse structurelle sur différentes échelles de longueur, répondant efficacement aux défis de la préparation de l’échantillon. Il offre également un flux de travail fiable pour évaluer l’efficacité des biomatériaux dans la promotion de la régénération osseuse.

Approche multimodale pour évaluer la régénération osseuse et la performance de l’échafaudage

Découvrez une stratégie multidisciplinaire pour tester la biocompatibilité des biomatériaux orthopédiques destinés à la régénération osseuse. Cette méthode combine techniques in vitro et in vivo pour évaluer l'efficacité et les réponses immunitaires.

Profil de compatibilité biologique sur les biomatériaux pour la régénération osseuse

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