Dynamique de protéomique et de miRNA analyse des Polysomes d’isolé souris coeur après Perfusion de Langendorff

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la synthèse dynamique des protéines et le protéome impliqué dans le processus. Cette technique permet d’identifier les ARNm qui sont sélectionnés pour la traduction, les microARN qui peuvent participer au processus et interférer avec la traduction, et les protéines qui contribuent à la traduction des protéines ou qui sont elles-mêmes traduites. Cette méthode peut donner un aperçu des réponses cardiaques au stress, mais peut également être appliquée à l’étude des réponses aiguës au stress dans d’autres organes.

Miroslava Stastna, une scientifique du laboratoire de Jennifer Van Eyk, fera la démonstration de la procédure. Le jour de l’expérience, remplissez le compartiment gauche d’un mélangeur à gradient avec cinq millilitres de solution à gradient de saccharose à 15 %, et remplissez le compartiment droit avec cinq millilitres de solution à gradient de saccharose à 50 %. Ouvrez le robinet et allumez la pompe pour remuer les deux petits compartiments avec un agitateur magnétique, et utilisez un tube relié au deuxième robinet pour permettre aux solutions de saccharose mélangées de s’écouler dans un seul tube d’ultracentrifugation à parois minces sur de la glace.

Ensuite, homogénéisez le tissu cardiaque frais ou congelé avec un POLYTRON dans un tampon de lyse filtré pendant 15 secondes sur de la glace. À la fin de l’incubation, centrifugez le lysat pour éliminer la matière insoluble et récoltez le surnageant. Mettez de côté 50 microlitres du surnageant pour la détermination des protéines, l’isolement de l’ARN et l’analyse de l’intégrité de l’ARN, et superposez 100 à 500 microlitres du surnageant restant sur la solution de gradient.

Utilisez un tampon de lyse frais pour équilibrer les volumes entre les deux tubes à gradient et ultracentrifugez les échantillons dans une ultracentrifugeuse avec un rotor à godets oscillant. Faites très attention à ne pas perturber le gradient de saccharose avant ou après la centrifugation. Pour collecter les gradients, programmez le collecteur de fractions pour qu’il élimine les trois premières minutes de collecte et pour collecter les fractions lourdes, légères et non translationnelles à la vitesse d’un millilitre par minute en 17 fractions de quatre à 19 minutes avec surveillance continue de l’absorbance à 254 nanomètres.

Placez chaque fraction sur de la glace dès qu’elle est recueillie. Stockez ensuite les échantillons à moins 80 degrés Celsius, s’ils ne sont pas traités immédiatement. Pour extraire des protéines des fractions de polysomes, combinez les fractions de saccharose collectées en trois fractions finales et marquez les fractions comme lourdes, légères et non translationnelles.

Mélangez 0,5 millilitre de chaque échantillon avec 60 microlitres d’acide trichloracétique à 100 %, ou TCA. Incuber les fractions pendant la nuit à moins 20 degrés Celsius dans l’obscurité. Le lendemain matin, décongelez les échantillons sur de la glace avant de granuler les protéines par centrifugation.

Jetez les surnageants et lavez les granulés deux fois avec 0,5 millilitre d’acétone réfrigérée de moins 20 degrés Celsius par centrifugation. Assurez-vous que les pastilles, après la précipitation du TCA, sont complètement dissoutes, en utilisant la sonication par impulsions pour assurer une solubilisation complète, si nécessaire. Faites sécher les granulés à l’air libre après le dernier lavage avant de les remettre en suspension dans 360 microlitres de tampon Tris-HCl.

Ajoutez ensuite 40 microlitres de dithiothreitol pour une incubation de 45 minutes à 55 degrés Celsius en secouant. À la fin de l’incubation, ajoutez 50 microlitres d’iodoacétamide aux échantillons pour une incubation de 30 minutes sur l’agitateur à température ambiante, à l’abri de la lumière, suivie d’une digestion des échantillons avec un rapport poids/protéines de 1 à 50 pour une incubation d’une nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain matin, après refroidissement, centrifugez brièvement les échantillons et ajustez le pH à deux ou trois avec de l’acide formique à 10 % pour éteindre l’activité de la trypsine.

Pour dessaler les échantillons, il faut d’abord conditionner le sorbant dans les puits d’une plaque de 96 puits avec 200 microlitres de méthanol trois fois, puis le conditionner avec 200 microlitres d’acide formique à 0,1 % par puits trois fois. Ensuite, chargez les échantillons dans chaque puits et lavez-les trois fois avec 200 microlitres d’acide formique à 0,1 % par lavage. À l’aide de la gravitation, suivie d’un vide faible, éluez les échantillons avec 100 microlitres d’acide formique à 0,1 % dans de l’acétonitrile à 50 % deux fois dans un tube de 0,5 millilitre à faible rétention de protéines par échantillon.

Ensuite, utilisez un concentrateur pour évaporer les éluats de l’échantillon jusqu’à ce qu’ils soient secs, et reconstituez chaque pastille de peptide tryptique dans 50 à 100 microlitres d’acide formique à 0,1 % pour l’analyse par spectrométrie de masse. L’analyse de l’ARNm peut être effectuée pour évaluer la distribution d’un ARNm particulier d’intérêt dans chaque fraction ou pour quantifier et comparer les fractions polyribosomiques de traduction combinées à la fraction non traduisante en tant que rapport de l’abondance de l’ARNm par fraction. Par exemple, ici, les changements dans la distribution de l’ARNm entre les fractions en traduction et non en traduction après la soumission du cœur de souris à l’ischémie ou à la reperfusion de l’ischémie, par rapport au traitement cardiaque fictif, sont montrés.

Dans cette expérience représentative, l’analyse d’un sous-ensemble de microARN dans les fractions lourdes regroupées a révélé que 22 microARN étaient associés à des polysomes pendant l’ischémie, neuf étaient associés pendant l’ischémie et la reperfusion, et sept étaient communs aux deux conditions, démontrant que l’association des microARN est dynamique en réponse aux contraintes de l’ischémie et de la reperfusion. De plus, la majorité des protéines ribosomiques mitochondriales ont été identifiées dans la fraction légère, et la majorité des protéines ribosomiques cytosoliques ont été identifiées couramment dans les fractions lourdes et légères. Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de se rappeler d’être très prudent avec le gradient de saccharose.

précipitation TCA pour l’extraction des protéines à partir de fractions de polysomes a été sélectionnée dans notre flux de travail en fonction de la capacité à traiter la fraction à forte concentration de saccharose et du nombre de protéines identifiées par spectrométrie de masse. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode peuvent éprouver des difficultés en raison des défis associés à la reproductibilité du gradient de saccharose. La précipitation du TCA est avantageuse car seuls de petits volumes sont nécessaires pour précipiter les protéines, la pastille est visible au fond du tube et il n’y a pas d’accumulation de saccharose pendant la précipitation.