Name: Dynamique de protéomique et de miRNA analyse des Polysomes d’isolé souris coeur après Perfusion de Langendorff (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Découvrez le profilage des polysomes pour étudier la synthèse protéique cardiaque chez la souris. Cette méthode analyse les mRNAs, miRNAs et le protéome des polysomes isolés après perfusion de Langendorff.

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NIH P01 HL112730 (RAG, JVE), NIH R01 HL132075 (RAG, JVE), centre du cœur féminin Barbra Streisand (RAG, JVE), Dorothy et E. Phillip Lyon chaise en cardiologie moléculaire (RAG), Erika Glazer doté de chaire en santé de la femme de cœur (JVE) et l’Académie tchèque des Sciences Appui institutionnel RVO : 68081715 (MS).

<ol><li>Pourpirali, S., Valacca, C., Merlo, P., Rizza, S., D’Amico, S., Cecconi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+pseudohypoxia+targets+ambra1+mrna+to+p-bodies+for+translational+repression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Prolonged pseudohypoxia targets ambra1 mrna to p-bodies for translational repression.</a> PLoS ONE. 10, e0129750(2015).</li>
<li>Andres, A. M., Tucker, K. C., Thomas, A., Taylor, D. J., Sengstock, D., Jahania, S. M., Dabir, R., Pourpirali, S., Brown, J. A., Westbrook, D. G., Ballinger, S. W., Mentzer, R. M. Jr, Gottlieb, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+and+mitochondrial+biogenesis+in+atrial+tissue+of+patients+undergoing+heart+surgery+with+cardiopulmonary+bypass%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Mitophagy and mitochondrial biogenesis in atrial tissue of patients undergoing heart surgery with cardiopulmonary bypass.</a> JCI Insight. 2, e89303(2017).</li>
<li>Kislinger, T., Cox, B., Kannan, A., Chung, C., Hu, P., Ignatchenko, A., Scott, M. S., Gramolini, A. O., Morris, Q., Hallett, M. T., Rossant, J., Hughes, T. R., Frey, B., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+survey+of+organ+and+organelle+protein+expression+in+mouse%3A+Combined+proteomic+and+transcriptomic+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Global survey of organ and organelle protein expression in mouse: Combined proteomic and transcriptomic profiling.</a> Cell. 125, 173-186 (2006).</li>
<li>Kren, B. T., Wong, P. Y., Shiota, A., Zhang, X., Zeng, Y., Steer, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+trafficking+of+transcripts+and+micrornas+in+regenerating+liver+after+partial+hepatectomy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Polysome trafficking of transcripts and micrornas in regenerating liver after partial hepatectomy.</a> American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, G1181-G1192 (2009).</li>
<li>Gottlieb, R. A., Pourpirali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lost+in+translation%3A+Mirnas+and+mrnas+in+ischemic+preconditioning+and+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Lost in translation: Mirnas and mrnas in ischemic preconditioning and ischemia/reperfusion injury.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 95, 70-77 (2016).</li>
<li>Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+translation+initiation+during+stress+conditions+by+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2014).</li>
<li>Lorsch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+enzymology.+Laboratory+methods+in+enzymology%3A+Rna.+Preface%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Methods in enzymology. Laboratory methods in enzymology: Rna. Preface.</a> Methods in Enzymology. 530, xxi(2013).</li>
<li>Kuzniewska, B., Chojnacka, M., Milek, J., Dziembowska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+polysomal+fractions+from+mouse+brain+synaptoneurosomes+and+analysis+of+polysomal-bound+mrnas%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Preparation of polysomal fractions from mouse brain synaptoneurosomes and analysis of polysomal-bound mrnas.</a> Journal of Neuroscience Methods. 293, 226-233 (2018).</li>
<li>He, S. L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+analysis+of+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Polysome analysis of mammalian cells.</a> Methods in Enzymology. 530, 183-192 (2013).</li>
<li>Molotski, N., Soen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+association+of+micrornas+with+polysomes+reflects+distinct+strengths+of+interactions+with+their+mrna+targets%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Differential association of micrornas with polysomes reflects distinct strengths of interactions with their mrna targets.</a> RNA. 18, 1612-1623 (2012).</li>
<li>Maroney, P. A., Yu, Y., Fisher, J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+micrornas+are+associated+with+translating+messenger+rnas+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Evidence that micrornas are associated with translating messenger rnas in human cells.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1102-1107 (2006).</li>
<li>Paul, P., Chakraborty, A., Sarkar, D., Langthasa, M., Rahman, M., Bari, M., Singha, R. S., Malakar, A. K., Chakraborty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+mirnas+and+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Interplay between mirnas and human diseases.</a> Journal of Cellular Physiology. 233, 2007-2018 (2018).</li>
<li>Rupaimoole, R., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microrna+therapeutics%3A+Towards+a+new+era+for+the+management+of+cancer+and+other+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Microrna therapeutics: Towards a new era for the management of cancer and other diseases.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16, 203-222 (2017).</li>
<li>Nelson, P. T., Hatzigeorgiou, A. G., Mourelatos, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mirnp%3AMrna+association+in+polyribosomes+in+a+human+neuronal+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Mirnp:Mrna association in polyribosomes in a human neuronal cell line.</a> RNA. 10, 387-394 (2004).</li>
<li>Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+let-7a+mirna+blocks+protein+production+on+actively+translating+polyribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Human let-7a mirna blocks protein production on actively translating polyribosomes.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1108-1114 (2006).</li>
<li>Kim, J., Krichevsky, A., Grad, Y., Hayes, G. D., Kosik, K. S., Church, G. M., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+many+micrornas+that+copurify+with+polyribosomes+in+mammalian+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Identification of many micrornas that copurify with polyribosomes in mammalian neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 360-365 (2004).</li>
<li>Androsavich, J. R., Chau, B. N., Bhat, B., Linsley, P. S., Walter, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-linked+microrna-21+exhibits+drastically+reduced+mrna+binding+and+silencing+activity+in+healthy+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Disease-linked microrna-21 exhibits drastically reduced mrna binding and silencing activity in healthy mouse liver.</a> RNA. 18, 1510-1526 (2012).</li>
<li>Kraushar, M. L., Thompson, K., Wijeratne, H. R., Viljetic, B., Sakers, K., Marson, J. W., Kontoyiannis, D. L., Buyske, S., Hart, R. P., Rasin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally+defined+neocortical+translation+and+polysome+assembly+are+determined+by+the+rna-binding+protein+hu+antigen+r%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the rna-binding protein hu antigen r.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , E3815-E3824 (2014).</li>
<li>McClatchy, D. B., Ma, Y., Liu, C., Stein, B. D., Martinez-Bartolome, S., Vasquez, D., Hellberg, K., Shaw, R. J., Yates, J. R. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+azidohomoalanine+labeling+in+mammals+%28palm%29+detects+changes+in+liver-specific+lkb1+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Pulsed azidohomoalanine labeling in mammals (palm) detects changes in liver-specific lkb1 knockout mice.</a> Journal of Proteome Research. 14, 4815-4822 (2015).</li>
<li>Schiapparelli, L. M., McClatchy, D. B., Liu, H. H., Sharma, P., Yates, J. R. 3rd, Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+detection+of+biotinylated+proteins+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Direct detection of biotinylated proteins by mass spectrometry.</a> Journal of Proteome Research. 13, 3966-3978 (2014).</li>
<li>Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature Methods. 6, 359-362 (2009).</li>
<li>Rajalingam, D., Loftis, C., Xu, J. J., Kumar, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trichloroacetic+acid-induced+protein+precipitation+involves+the+reversible+association+of+a+stable+partially+structured+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Trichloroacetic acid-induced protein precipitation involves the reversible association of a stable partially structured intermediate.</a> Protein Science. 18, 980-993 (2009).</li>
<li>Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+protein+precipitation+methods+for+various+rat+brain+structures+prior+to+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis.</a> Electrophoresis. 31, 3573-3579 (2010).</li>
<li>Sashital, D. G., Greeman, C. A., Lyumkis, D., Potter, C. S., Carragher, B., Williamson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combined+quantitative+mass+spectrometry+and+electron+microscopy+analysis+of+ribosomal+30s+subunit+assembly+in+e.+Coli%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A combined quantitative mass spectrometry and electron microscopy analysis of ribosomal 30s subunit assembly in e. Coli.</a> Elife. 3, (2014).</li>
<li>Liang, S., Bellato, H. M., Lorent, J., Lupinacci, F. C. S., Oertlin, C., van Hoef, V., Andrade, V. P., Roffé, M., Masvidal, L., Hajj, G. N. M., Larsson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome-profiling+in+small+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Polysome-profiling in small tissue samples.</a> Nucleic Acids Research. 46, e3(2018).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Analyse du profil de polysome permet l’étude de la traduction des protéines en analysant l’État translationnelle d’un ARNm spécifique ou le transcriptome ensemble6,7. Il est également d’une grande aide lorsque la traduction locale doit être étudié comme synaptosomes8. Traditionnellement, cette méthode consiste à séparer des mono - et polyribosomes et les ARNm associés sur un gradient de saccharose peut être couplée à génomiques ou protéomi...

Le cœur répond à la lésion d’ischémie (I) et de la reperfusion (R) de manière dynamique. Cependant, il y a petit aperçu des changements aigus dans la synthèse des protéines au cours de la réponse. Pour y remédier, nous avons profité de la méthode bien établie de polysome1 pour identifier les changements dans l’abondance des protéines qui reflètent la redistribution des ribosomes et des facteurs de régulation traductionnelle du cytosol aux polysomes, le profilage et le augmentation des protéines nouvellement synthétisées (NSP). Dans le cadre d’I / R, l’augmentation de la synthèse des protéines nouvelles se produit dans un laps de temps qui est incompatible avec la transcription de l’ARNm nouveau2; en outre, une discordance entre les niveaux d’expression de mRNA et l’abondance de la protéine a été rapporté3. Pour ces raisons, nous avons choisi d’analyser les changements dans le protéome dynamique comme en témoigne la traduction des protéines. Pour ce faire, nous quantifier des ARNm dans les fractions de polysome et d’analyser la composition en protéines dans les fractions de polysome. Enfin, parce que les microARN (miRs) réglemente la disponibilité d’ARNm pour traduction et peut interférer avec l’efficacité de la protéine traduction4,5, nous avons examiné la distribution des miRs dans les fractions de polysome, mettant l’accent sur la réponse à I / r.
Nous avons choisi d’utiliser le modèle de perfusion de Langendorff isolés de souris et tissus récoltés dans des conditions basales de la perfusion continue, après 30 min global ischémiques et après 30 min d’ischémie suivie d’une reperfusion de 30 min. Nous avons ensuite solubilisée le tissu cardiaque et séparés des polysomes sur un gradient de sucrose, suivie de l’analyse protéomique et détection sélective des ARNm et des miARN par PCR et microarray, respectivement. Cette combinaison de méthodes représente une approche puissante pour comprendre le protéome dynamique, qui permet la détection simultanée des ARNm, miRNA et fournisseurs de services réseau, ainsi que la redistribution des protéines régulatrices, miRNA et ARNm entre fractions nontranslating, polysomes de faible rendement et les polysomes de haute efficacité (voir Figure 1). Aperçus de la régulation dynamique de ce processus seront prolongées par une analyse plus approfondie de la phosphorylation des facteurs réglementaires clés tels qu’eIF2α ou mTOR. Maintenant, ces différentes étapes sont décrites en détail.

<table><tbody><tr><td>Pentobarbital</td><td>Vortech Phamaceuticals</td><td>9373</td><td>pour euthanasie</td></tr><tr><td>Héparine</td><td>Sagent</td><td>103424</td> utilisé dans la pince de <td>préparation de langendorff</td></tr><tr><td></td><td>Outils de science fine</td><td>91110-10</td><td>utilisé pour accrocher le cœur</td></tr><tr><td>Système de Langendorff</td><td>Radnoti + fait maison</td><td>n/a</td><td>Un système 'quatre cœurs' composé de verre soufflé sur mesure, de tubes et de bains-marie</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653-5KG</td><td>Tampon Krebs et gradient de saccharose</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>Tampon Krebs et tampon de lyse</td></tr><tr><td>KH2PO42</td><td>Sigma</td><td>P-5504</td><td>Tampon Krebs</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M7774-500G</td><td>Tampon Krebs</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G5767</td><td>Tampon Krebs</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016-500G</td><td>Tampon Krebs</td></tr><tr><td>Poudre de saccharose</td><td>Sigma</td><td>S0389-1KG</td><td>Gradient de saccharose</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>208337</td><td>Gradient de saccharose et tampon de lyse</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma</td><td>T1503-1KG</td><td>Gradient de saccharose et tampon de lyse</td></tr><tr><td>Xylène Cyanole</td><td>Sigma</td><td>X-4126</td><td>Gradient de saccharose</td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Sigma-aldrich</td><td>239763</td><td>Gradient de saccharose et tampon de lyse</td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Life Technologies</td><td>C00019</td><td>Inhibiteur de RNAse pour tampon de lyse</td></tr><tr><td>Igepal CA-360 (NP40)</td><td>Sigma</td><td>I3021</td><td>Tampon de lyse</td></tr><tr><td>Inhibiteur de protéase Comprimés cocktails, sans EDTA</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td>Tube, paroi mince, ultra-transparent, 13,2 mL, 14 mm x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifugeuse</td><td>Beckman</td><td>LE-80K</td><td>Ultracentrifugation des gradients</td></tr><tr><td>Rotor</td><td>Beckman</td><td>SW41</td><td>Ultracentrifugation des gradients</td></tr><tr><td>Biologic LP (pompe)</td><td>Biorad</td><td>731-8300</td><td>Fractionnement des gradients</td></tr><tr><td>BioFrac</td><td>Biorad</td><td>741-0002</td><td>Fractionnement des gradients</td></tr><tr><td>Eppendorf ARN/ADN Tubes à centrifuger LoBind, tube de 2 mL</td><td>Sigma</td><td>Z666513-100EA</td><td>Fraction à gradient et extraction de l’ARN</td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Life technologies</td><td>AM9738</td><td>Extraction de l’ARN</td></tr><tr><td>Luciferase Contrôle ARN</td><td>Promega</td><td>L4561</td><td>Extraction de l’ARN</td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Fisher Scientific</td><td>C606-4</td><td>ARN extraction</td></tr><tr><td>Glycogène, grade ARN</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0551</td><td>Extraction d’ARN</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma</td><td>I9516</td><td>Extraction d’ARN</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma</td><td>E7023-1L</td><td>Extraction d’ARN</td></tr><tr><td>iScript cDNA Synthesis Kit</td><td>BioRad</td><td>170-8891</td><td>Transcription inverse</td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>BioRad</td><td>175-5122</td><td>PCR</td></tr><tr><td>quantitative miRNeasy Micro Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>217084</td><td>Kit pour l’isolement total de l’ARN</td></tr><tr><td>miScript II RT Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>218161</td><td>Kit pour la transcription inverse des miARN</td></tr><tr><td>miScript Sybr Green PCR Kit (200)</td><td>Qiagen</td><td>218073</td><td>Kit pour l’analyse de l’expression PCR en temps réel des miARN</td></tr><tr><td>Centrifuge 5424R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Pour la centrifugation de tubes de 1,5 mL ou 2,0 mL à différentes températures. Vitesse maximale - 21130 x g</td></tr><tr><td>Centrifugeuse 5810R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Pour la centrifugation de plaques PCR en temps réel à différentes températures. Vitesse maximale - 2039 x g</td></tr><tr><td>My Cycler Thermocycler</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Pour la transcription inverse</td></tr><tr><td>CFX96 Real-Time System/C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Pour l’analyse PCR en temps réel</td></tr><tr><td>miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control</td><td>Qiagen</td><td>219610</td><td>Pour le contrôle de la qualité de l’isolement de l’ARN</td></tr><tr><td>Hard-Shell 96-Well PCR Plates, profil bas, paroi mince, à jupe, vert/clair</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP9641</td><td>Pour l’analyse PCR en temps réel</td></tr><tr><td>Microseal 'B' Plaque Sealing Film d’étanchéité, adhésif, optique</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB1001</td><td>Pour l’étanchéité des plaques PCR en temps réel</td></tr><tr><td>Recherche plus Pipette monocanale, gris ; 0,5-10 & micro ; L</td><td>Eppendorf</td><td>UX-24505-02</td><td>Pour le pipetage</td></tr> des <tr><td>pipettes PIPETMAN Classic, P20</td><td>Gilson</td><td>F123600G</td><td>Pour le pipetage</td></tr> des <tr><td>pipettes PIPETMAN Classic, P200</td><td>Gilson</td><td>F144565</td><td>Pour le pipetage</td></tr><tr><td>Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS Pipette 100-1000 &micro ; L</td><td>Gilson</td><td>17011782</td><td>Pour le pipetage du</td></tr><tr><td>glycogène, grade ARN</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0551</td><td>Améliore l’efficacité totale de l’isolement de l’ARN</td></tr><tr><td>Tubes Posi-Click 1,7 mL, couleur naturelle</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td>Isolement et stockage de l’ARN ; mélange de réactifs</td></tr><tr><td>Tubes à cycle thermique -0,2 mL Bouchons individuels, tubes standard de 0,2 mL avec optiquement</td><td>Denville</td><td>C18098-4 (1000910)</td><td>Réaction de transcription inverse</td></tr><tr><td>Sharp 10 Pointes de barrière de précision</td><td>Denville</td><td>P1096-FR</td><td>Pour le pipetage</td></tr><tr><td>Sharp 20 Pointes de barrière de précision</td><td>Denville</td><td>P1121</td><td>Pour le pipetage</td></tr><tr><td>Sharp 200 Pointes de barrière de précision</td><td>Denville</td><td>P1122</td><td>Pour le pipetage</td></tr><tr><td>Pointes LTS 1 mL</td><td>Filtre Rainin</td><td>RT-L1000F</td><td>Pour le pipetage</td></tr><tr><td>miScript Primer Assay ( 200)</td><td>Qiagen</td><td>(il change en fonction du miARN)</td><td>Pour l’analyse PCR en temps réel</td></tr><tr><td>Gradient Master ver 5.3 Modèle 108</td><td>BioComp Instruments</td><td></td><td>Pour la préparation des gradients de saccharose</td></tr><tr><td>Acide trichloracétique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6399</td><td></td></tr><tr><td>Acétone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>650501</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de Tris</td><td>Amresco</td><td>M108</td><td></td></tr><tr><td>dithiothreitol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP172</td><td></td></tr><tr><td>iodoacétamide</td><td>Gbiosciences</td><td>RC-150</td><td></td></tr><tr><td>séquençage qualité trypsine modifiée, porcine</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>bicarbonate d’ammonium</td><td>BDH</td><td>BDH9206</td><td></td></tr><tr><td>acide formique, Optima LC/MS</td> Fisher <td>Chemical</td><td>A117</td><td></td></tr><tr><td>méthanol, Optima LC/MS</td><td>Fisher Chemical</td><td>A454</td><td></td></tr><tr><td>acétonitrile, Optima LC/MS</td> Fisher <td>Chemical</td><td>A996</td><td></td></tr><tr><td>Tubes Protein LoBind 0,5 mL</td><td>Eppendorf AG</td><td>22431064</td><td></td></tr><tr><td>Tubes Protein LoBind 1,5 mL</td><td>Eppendorf AG</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>HLB & micro ; Plaque d’élution 30 & micro ; m</td><td>Oasis</td><td>186001828BA</td><td></td></tr><tr><td>Concentrateur SpeedVac</td><td>Thermo Scientific</td><td>Savant SPD2010</td><td></td></tr><tr><td>sonicateur</td><td>Qsonica</td><td>Oasis180</td><td></td></tr><tr><td></td><td>centrifugeuse Thermo Scientific</td><td>Sorvall Legend micro 21R</td><td></td></tr><tr><td>LC colonne de piège PepMap 100 C18</td><td>Thermo Scientific</td><td>160454</td><td></td></tr><tr><td>colonne de séparation LC PepMap RSLC C18</td><td>Thermo Scientific</td><td>164536</td><td></td></tr><tr><td>spectromètre de masse</td><td>Thermo Scientific</td><td>Orbitrap Elite Spectromètre</td><td></td>de masse à piège ionique</tr><tr><td>MSConvert logiciel</td><td>ProteoWizard Toolkit</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorcerer-SEQUEST logiciel</td><td>Sage-N Research, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dynamique de protéomique et de mirna analyse des polysomes d’isolé souris coeur après perfusion de langendorff

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Études des changements dynamiques dans la traduction des protéines nécessitent des méthodes spécialisées. Ici, nous avons examiné les changements dans les protéines nouvellement synthétisées en réponse à l’ischémie et reperfusion en utilisant le cœur isolé perfusé souris couplé avec le profilage polysome. Pour mieux comprendre les changements dynamiques dans la traduction des protéines, nous avons caractérisé l’ARNm qui étaient chargés de ribosomes cytosoliques (polyribosomes ou polysomes) récupéré polysomes mitochondriales et comparativement les répartition ARNm et de protéines dans le fractions de haut rendement (nombreux ribosomes attachés à l’ARNm), faible rendement (moins ribosomes attachés) qui comprenait également les polysomes mitochondriales et les fractions non-traduction. miARN peut également être associé ARNm qui est en cours de traduction, ce qui réduit l’efficacité de la traduction, nous avons étudié la distribution des miARN dans les fractions. La distribution des miARN, ARNm et de protéines a été étudiée dans des conditions basales perfusées, à la fin des 30 min de global ischémiques et après 30 min de reperfusion. Nous présentons ici les méthodes utilisées pour réaliser cette analyse, en particulier, l’approche à l’optimisation de l’extraction de la protéine de la gradient de saccharose, car cela n’a pas été décrite avant — et fournissent des résultats représentatifs.

analyse de l’ARNm résultats de l’ARNm peuvent être exprimées comme une distribution d’un ARNm spécifique dans chacune des fractions (Figure 3 a) ; pour la quantification, combiner des fractions de traduction polyribosomiques et comparer à la fraction non-traduction (Figure 3 b), présentant un rapport de l’abondance d’ARNm dans la traduction des fractions nontranslating. Des informations supplémentaires sont acquise en...

Nous présentons ici un protocole pour effectuer le polysome profilage sur le cœur isolé perfusé souris. Nous décrivons des méthodes pour la perfusion cardiaque polysome profilage et analyse des fractions polysome en ce qui concerne les ARNm, miARN et le protéome polysome.

Dynamique de protéomique et de miRNA analyse des Polysomes d’isolé souris coeur après Perfusion de Langendorff

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la synthèse dynamique des protéines et le protéome impliqué dans le processus. Cette technique permet d’identifier les ARNm qui sont sélectionnés pour la traduction, les microARN qui peuvent participer au processus et interférer avec la traduction, et les protéines qui contribuent à la traduction des protéines ou qui sont elles-mêmes traduites. Cette méthode peut donner un aperçu des réponses cardiaques au stress, mais peut également être appliquée à l’étude des réponses aiguës au stress dans d’autres organes.Miroslava Stastna, une scientifique du laboratoire de Jennifer Van Eyk, fera la démonstration de la procédure. Le jour de l’expérience, remplissez le compartiment gauche d’un mélangeur à gradient avec cinq millilitres de solution à gradient de saccharose à 15 %, et remplissez le compartiment droit avec cinq millilitres de solution à gradient de saccharose à 50 %. Ouvrez le robinet et allumez la pompe pour remuer les deux petits compartiments avec un agitateur magnétique, et utilisez un tube relié au deuxième robinet pour permettre aux solutions de saccharose mélangées de s’écouler dans un seul tube d’ultracentrifugat

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Langendorff mode de perfusion cardiaque isolée, en collaboration...

L&#39;évaluation de la fonction cardiaque et Energétique dans les coeurs isolés de souris à l&#39;aide<sup&gt; 31</sup&gt; P NMR Spectroscopy

Simple cellule de profilage de l'expression génique permet l'analyse détaillée d'expression des cellules individuelles. Nous décrivons des méthodes pour l'isolement des cardiomyocytes, et la préparation des lysats résultant soit pour tout ou biopuces transcriptome qPCR d'objectifs spécifiques.

Profilage Single Cell transcriptionnelle des cardiomyocytes de souris adultes

Les progrès de la spectrométrie de masse ont permis l'analyse à haut débit de l'expression protéique et la modification dans une multitude de tissus. Combiné avec fractionnement subcellulaire et modèles de maladies, spectrométrie de masse quantitative et de la bioinformatique peut révéler de nouvelles propriétés dans les systèmes biologiques. Le procédé décrit ici analyse des protéines associées à la chromatine dans le cadre d'une maladie cardiaque et est facilement applicable à...

Analyse quantitative des Protéomes chromatine dans la maladie

Des cardiomyocytes individuels de souris de type sauvage et mutantes peuvent être isolés du cœur afin d’étudier leur contractilité et leurs transitoires calciques. Cela permet de caractériser la contribution du dysfonctionnement cellulaire au dysfonctionnement cardiaque, quelle qu’en soit la cause.

L&#39;isolement et l&#39;analyse physiologique de cardiomyocytes de souris

micro-ARN (miARN) est des séquences d’ARN courts et très homologues, agissant comme organismes de réglementation post-transcriptionnelle des ARN messagers (ARNm). Les méthodes actuelles de détection de miRNA varient dans la sensibilité et la spécificité. Les auteurs décrivent un protocole qui combine l’hybridation in situ et immunostaining pour la détection simultanée de miRNA et protéine molécules sur des sections de tissu cardiaque souris.

Tissu-spécifique miRNA, profilage de l’Expression à l’aide de la souris coeur Sections en hybridation in Situ

Une méthode est décrite pour l’isolement simultané des myocytes et des non-myocytes des atria et des ventricules d’un coeur adulte simple de souris. Ce protocole a comme résultat des rendements cohérents des myocytes cardiaques et des non-myocytes fortement viables et détaille les conditions optimales de culture cellule-spécifique pour le phénotypage et l’analyse in vitro.

Isolement et culture simultanés des myocytes auriculaires, des myocytes ventriculaires et des non-myocytes provenant d’un cœur de souris adulte

Nous avons développé une méthode simple pour isoler les cellules individuelles de coeur de souris de haute qualité par la technique antegrade de perfusion. Cette méthode est sans Langendorff et utile pour isoler les myocytes ventriculaires et auriculaires ou les cellules interstitielles, telles que les fibroblastes cardiaques ou les progéniteurs.

Procédé de perfusion antegrade pour l’isolement de cardiomyocytes de souris

Le développement du cerveau mammifère nécessite un contrôle approprié de l’expression des gènes au niveau de la traduction. Ici, nous décrivons un système de profilage polysome avec une plate-forme facile à assembler de gradient de saccharose et de fractionnement pour évaluer l’état translationnel des ARNM dans le cerveau en développement.

Analyse de la traduction dans le cerveau de souris en développement à l’aide du profilage polysome

Ici, nous décrivons un protocole pour isoler une quantité suffisante de non-cardiomyocytes uniques avec une viabilité élevée d’un cœur de souris post-infarctus du myocarde (IM). Cela peut être utilisé pour le séquençage ultérieur d’une seule cellule, l’analyse de cytométrie en flux et la culture cellulaire primaire.

Préparation d’une suspension cellulaire non cardiomyocytaire pour le séquençage d’ARN unicellulaire à partir d’un cœur de souris adulte post-infarctus du myocarde

Ici, nous présentons des protocoles pour la purification par affinité des complexes de protéines et leur séparation par PAGE native bleu, suivie par le profilage de corrélation de la protéine en utilisant le marqueur libre spectrométrie de masse quantitative. Cette méthode est utile pour résoudre interactomes dans des complexes protéiques distincts.

Résoudre les complexes protéiques purifiés par affinité de Blue native PAGE et le profilage de corrélation des protéines

Découvrez le profilage des polysomes pour étudier la synthèse protéique cardiaque chez la souris. Cette méthode analyse les mRNAs, miRNAs et le protéome des polysomes isolés après perfusion de Langendorff.

Dynamique de protéomique et de miRNA analyse des Polysomes d’isolé souris coeur après Perfusion de Langendorff

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