Name: Expression des protéines de Fusion Fluorescent en Murine dérivés de la moelle osseuse des cellules dendritiques et Macrophages (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Apprenez à exprimer des protéines de fusion fluorescentes dans des cellules dendritiques et des macrophages dérivés de la moelle osseuse murine. Cette méthode simple utilise la transduction rétrovirale pour visualiser la localisation protéique.

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Ce travail a été soutenu par Science de tchèque Foundation (GACR) (numéro de projet : 16-07425S), par Charles Université Grant Agence (GAUK) (numéro du projet 923116) et par un financement institutionnel de l’Institut de génétique moléculaire de l’Académie des Sciences de la République tchèque République (RVO 68378050).

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par le Comité d’experts sur le bien-être des animaux d’expérimentation de l’Institut de génétique moléculaire et de l’Académie des Sciences de la République tchèque.
1. préparation du réactif
<ol><li>Préparer le tampon chlorure d’ammonium-potassium (ACK). Ajouter 4,145 de NH4Cl et 0,5 g de KHCO3 à 500 mL de ddH2O, puis ajouter 100 µL de 0,5 M d’acide tétraacétique (EDTA) et filtre-stériliser.</li>
	<li>Préparer la solution polyéthylènimine (PEI). Ajouter 0,1 g de PEI à 90 mL de ddH2O. Tout en agitant, ajouter goutte à goutte 1 M HCl jusqu'à ce que le pH est inférieur à 2.0. Remuer pendant 3 h jusqu'à ce que le PEI est dissoute et ensuite ajuster le pH à 7,2 avec 1 NaOH M. Réglez le volume à 100 mL avec FD2O et filtre-stériliser. Faire des portions de 1 à 2 mL et conserver à-20 ° C. NOTE : Après décongélation, PEI peut être stocké à 4 ° C pendant 2 semaines, mais il ne doit pas être ré-congelé.</li>
	<li>Préparer les surnageants de culture de cellules contenant du M-CSF ou GM-CSF. Ces surnageants peuvent être faites à l’avance et stockées à-80 ° C. Pour rendre ces surnageants, poussent les cellules productrices de cytokines (cellules J558 pour GM-CSF 18 ) ou des cellules CMG 14-12 pour le M-CSF 19dans une boîte de Pétri dans le milieu de l’aigle modifié de Dulbecco (DMEM) avec 10 % sérum fœtal (SVF) de 10 cm à la confluence. Puis transférez toutes les cellules à 200 mL de médias à T150 flacon de culture de tissus et de la culture pour les journées supplémentaires de 4 à 5 % de CO237 ° C. Récupérer le surnageant et le filtre sur filtre de stérilisation 0,2 µm. Faire des aliquotes et stocker à-80 ° C.</li>
	<li>Préparation de 100 mL de milieu de culture cellulaire : DMEM supplémenté de 10 % inactivé FBS de chaleur et les surnageants de culture de cellules sécrétrices de GM-CSF (pour la différenciation BMDC) ou M-CSF (pour la différenciation BMDM) de cellules. Remarque : Le montant des cytokines dans les surnageants de ces peut varier et la concentration de travail doit être déterminée empiriquement. En général, 2 à 3 % de surnageant de lignées de cellules productrices de GM-CSF (la concentration de départ recommandée est de 2 %) ou 5 à 10 % de surnageant de CMG 14 – 12 cellules produisant M-CSF (la concentration de départ recommandée est de 10 %) est utilisée. Alternativement, purifiées commercialement disponible M-CSF à 10 ng/mL et GM-CSF à 20 ng/mL peuvent être utilisé avec résultats pratiquement identiques à la cytokine contenant les surnageants, i.e., sans aucun effet sur le taux de différenciation, efficacité de l’infection et la localisation sous-cellulaire des constructions EGFP-tag. Antibiotiques, y compris la pénicilline G (100 UI/mL), streptomycine (100 µg/mL) et gentamicine (40 µg/mL), peuvent être utilisés pour la culture cellulaire à n’importe quelle étape du protocole, sauf indication contraire.</li>
</ol>2. production des rétrovirus
ATTENTION : Bien que les vecteurs rétroviraux sont relativement sûrs par rapport à d’autres types de vecteurs viraux, ils représentent toujours un risque de sécurité potentiel. Par conséquent, il est essentiel de travailler avec le plus grand soin et l’équipement de protection approprié et de respecter toutes les consignes de sécurité et les exigences légales pour travailler avec des particules virales.
<ol><li>Une suspension monocellulaire de cellules emballage Platinum-Eco (Plat-E) dans une boîte de Pétri de 10 cm sur plaque et cultiver dans 15 mL de DMEM contenant 10 % FBS jusqu'à 50-60 % anastomosé (24h). Les cellules devraient croître en une monocouche et ne devraient pas constituer des touffes dans la culture.</li>
	<li>Pipette 20 µg d’antirétrovirale construction (p. ex.., la construction exprimant la protéine fluorescent étiquetée d’intérêt dans le vecteur pMSCV) et 10 µg de pCL-Eco Emballages vector20 dans 1 mL de DMEM (sans sérum et antibiotiques) et mélanger doucement.</li>
	<li>Dans un deuxième tube, ajouter 75 µL d’Î.-P.-É. dans 1 mL de DMEM (sans sérum et antibiotiques). Incuber 5 min à température ambiante (RT) puis mélanger le contenu de deux tubes et incuber pendant supplémentaire 10 min à température ambiante. Remarque : L’ajout de pCL-Eco est facultatif. Il est codant pour le récepteur viral ecotropic et peut augmenter le titre du virus.</li>
	<li>Replacez délicatement le support sur les cellules de Plat-E 8 ml de DMEMsupplemented frais avec 2 % FBS. Réchauffez le milieu à 37 ° C avant utilisation. N’utilisez pas d’antibiotiques au cours de la transfection, étant donné que les antibiotiques peuvent réduire l’efficacité de transfection.</li>
	<li>Soigneusement ajouter (en gouttes) le mélange préparé à l’étape 2.3 sur les cellules de Plat-E et incuber pendant 4 h à 37 ° C.</li>
	<li>Après l’incubation, change le milieu sur les cellules de Plat-E pour 10 mL de préchauffé DMEM contenant 10 % FBS et cultiver les cellules pendant 24 h à 37 ° C. Durant cette incubation, cellules Plat-E produira des virus dans les médias.</li>
	<li>Après 24h, recueillir le milieu contenant des particules rétrovirales de platine Eco de cellules à l’aide d’une pipette de 5 mL et transférez-le dans un tube à centrifuger 15 mL (= « surnageant 1 » contenant des particules rétrovirales ecotropic).</li>
	<li>Pour éviter toute contamination par des cellules de Plat-E dans les surnageants de virales, filer le virus prélevé à 1250 × g pendant 5 min à 4 ° C. Pour des résultats optimaux, le virus doit être utilisé immédiatement pour l’infection. NOTE : Conserver des portions de virus peuvent également être stockées à-80 ° C pour une utilisation ultérieure. Toutefois, il entraînera certaine réduction dans l’efficacité de la transduction. Éviter le gel/dégel répété du virus, car elle conduit à la dégradation de virus.</li>
	<li>Ajouter 10 mL de préchauffé DMEM avec 10 % de cellules de FBS à Plat-E et cultiver un autre 24 h à 37 ° C.</li>
	<li>Répétez les étapes 2,7. et 2.8. pour obtenir la « surnageant 2 ».</li>
</ol>3. isolement de cellules de moelle épinière murin
<ol><li>Sacrifier la souris à l’aide de dislocation cervicale ou autre moyen agréé. Vaporiser la souris avec l’éthanol à 70 %.</li>
	<li>Avec des ciseaux et pinces à épiler, retirez la peau ainsi qu’une partie des muscles postérieurs. Soigneusement déloger l’acetabulum de l’articulation de la hanche sans casser le fémur. Couper la patte dans l’articulation de la cheville. Vaporiser les os (fémur connecté au tibia) d’éthanol à 70 % et supprimer le reste des muscles à l’aide d’une serviette en papier.</li>
	<li>Placer les os dans un plat de Pétri de 5 cm contenant saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) avec 2 % SVF (PBS-FBS).  Si vous préparez plusieurs OS, garder la boîte de Pétri sur la glace jusqu'à ce que les traités.</li>
	<li>Pour assurer la stérilité de la culture, effectuer toutes les étapes suivantes dans une hotte de culture de tissus.</li>
	<li>Séparer le fémur du tibia sans casser les extrémités des os (flexion du genou conjointe et soigneusement coupé avec des ciseaux).</li>
	<li>Traiter les os un par un. Couper une partie infime des épiphyses (environ 1 à 2 mm) avec des ciseaux tout en maintenant l’os dans la pince à épiler.</li>
	<li>Utiliser une aiguille de 30 G et une 2 ou 5 mL seringue remplie de PBS-FBS afin d’éliminer les cellules de la moelle osseuse des deux extrémités de l’os dans un tube à centrifuger 15 mL. Déplacer l’aiguille à l’intérieur de l’os au cours de la chasse d’eau afin d’éliminer toutes les cellules. Si l’aiguille du colmatage, changez-le. Remarque : OS devrait tourner du rouge au blanc pendant le rinçage. Cela indique que la majorité des cellules ont été retirée de l’OS. Utiliser environ 2 – 3 mL de PBS-FBS / OS.</li>
	<li>Centrifuger les cellules à 500 g pendant 5 min à 4 ° C.</li>
	<li>Jeter le surnageant et lyser les globules rouges par resuspendant le culot dans 2,5 mL de tampon ACK pour 2 à 3 min à température ambiante. Lors de la lyse, filtrer les cellules de la moelle osseuse à travers un tamis de cellule de 100 μm dans un tube de centrifug frais 15 mL. Restaurer la tonicité en ajoutant 12 mL de PBS-FBS. Remarque : Ne dépassez pas 5 min de lyse hypotonique avec tampon ACK pour éviter la mort des cellules.</li>
	<li>Centrifuger immédiatement à 500 g pendant 5 min à 4 ° C.</li>
</ol>4. moelle osseuse la différenciation des cellules dans la moelle osseuse provenant des Macrophages
<ol><li>Resuspendre le culot de cellules de moelle osseuse en DMEM additionné de 10 % FBS et antibiotiques (voir la remarque après étape 1.4. pour la concentration d’antibiotique) et compter les cellules non vides. Pour une différenciation BM dérivées des macrophages, plaque 5-10 x 106 des cellules de moelle osseuse dans une 10 cm sans tissue culture traitée (bactérienne) boîte de Pétri avec 10 mL de médias DMEM préalablement préparés avec du sérum et de M-CSF étape 1.4. Remarque : Le rendement des cellules de la moelle osseuse est environ 4 x 107 par semaine 6 – 8-vieille souris C57BL/6J.</li>
	<li>Incuber les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 3 jours à 5 % CO2, 37 ° C. Remarque : Durant les 2 premiers jours, les cellules ne regardent pas très vitales, comme un grand nombre de cellules apoptotiques est actuellement (cellules incapables de se différencier en cellules myéloïdes et cellules différenciées en phase terminale).</li>
	<li>Après 3 jours, la culture de cellules de moelle osseuse commence à regarder vital et sont forment des amas de cellules en division. Premières cellules adhérentes peuvent déjà être observées. À ce stade, compléter les cellules avec les médias de cytokine fraîches.</li>
	<li>Ajouter 10 mL de médias DMEM pré chauffées avec du sérum et de M-CSF (de l’étape 1.4) dans chaque boîte de Pétri de 10 cm et retournez-le dans l’incubateur de culture cellulaire. Il n’y a aucun besoin d’enlever les anciens médias au cours de cette étape. Remarque : les macrophages de la moelle osseuse sont entièrement différenciés après 5 à 7 jours de culture. Le meilleur moment pour la récolte est à jour est complètement recouverte de 6 – 8, où la majorité des cellules sont adhérents et la boîte de Pétri.</li>
	<li>Au jour 5, prendre la boîte de Pétri dans la hotte de culture cellulaire et incliner le plat jusqu'à ce que les médias presque atteint le bord du plat. Retirez soigneusement 15 mL des médias de la surface près du bord, et les cellules ont tendance à rester au milieu du plat. Ajouter le même volume de médias préchauffés avec M-CSF et remettez le plat dans l’incubateur. Remarque : Si le média est aspiré lentement et soigneusement, presque aucune cellule n’est perdus. Toutefois, il est également possible de centrifuger les médias aspirés et rajouter les cellules à la culture, pour s’assurer qu’aucun non adhérents (i.e., incomplètement différenciés) cellules sont perdues.</li>
	<li>Pour les expériences, uniquement des cellules adhérentes (macrophages) sont utilisés. Pour récolter les cellules, 6 ou 7 jours, enlever toutes les cellules flottantes et les médias. Laver le plat une fois avec du PBS préchauffé sans sérum.</li>
	<li>Ajouter 5 mL d’EDTA de 0,02 % dans du PBS et incuber pendant 3 à 5 min à 37 ° C dans l’incubateur de culture de tissus.</li>
	<li>À l’aide d’une pipette de 5 mL, enlever les cellules de la capsule par un flux de PBS-EDTA et les placer dans un tube à centrifuger 50 mL avec 25 mL de PBS. Si besoin, regrouper plusieurs plats.</li>
	<li>Centrifuger immédiatement à 500 g pendant 5 min à 4 ° C.</li>
	<li>Resuspendre le culot de macrophages en milieu DMEM et compter les cellules non vides. Vérifier l’expression des marqueurs de différenciation surface du macrophage (CD11b et F4/80) par cytométrie en flux.</li>
	<li>Pour les expériences nécessitant les cellules en suspension, par exemple., flow cytometry expériences, qPCR ou analyse par western blot, utiliser les macrophages directement. Des expériences avec des macrophages adhérentes, plaque les cellules de la plaque de culture de tissu selon le montage expérimental.</li>
	<li>Les cellules sont déjà entièrement différenciés. Gardez-les dans les médias appropriés pour l’expérience prévue ou dans les médias originales de croissance et de différenciation avec le M-CSF. Remarque : Pour travailler avec des macrophages adhérentes, transférez-les dans une nouvelle plaque au moins 6 h avant utilisation (idéalement une nuit) afin de permettre l’adhésion complète à la nouvelle surface. La petite fraction de flottement des cellules peut être retirée avant l’expérience.</li>
</ol>5. moelle osseuse la différenciation des cellules dans la moelle osseuse provenant de cellules dendritiques
<ol><li>Suivre le protocole pour BMDMs avec les ajustements spécifiques pour BMDCs étapes 5.2 à 5.4 décrites ci-dessous.</li>
	<li>Resuspendre le culot obtenu des cellules de moelle osseuse en DMEMsupplemented avec 10 % de BF et d’antibiotiques et de compter les cellules (en suivant étape 4.1 du protocole de macrophages). Pour la différenciation en cellules dendritiques, plaque 1 – 1.5 x 107 cellules de moelle osseuse dans une 10 cm non-culture de tissus traités Pétri (bactérienne) dans 10 mL de médias DMEM préalablement préparés avec du sérum et GM-CSF (de l’étape 1.4.).</li>
	<li>Suivez les mêmes étapes de culture comme protocole BMDM (étapes 4.3 – 4,5. Protocole de macrophages). Utiliser les médias DMEM avec du sérum et GM-CSF, au lieu de M-CSF. Étant donné que pour BMDCs le temps de culture est plus long (généralement 10 à 12 jours), ajouter 1 à 2 tétées supplémentaires dans les 3 jours d’intervalle (en enlevant le surnageant et ajout d’un nouveau média de culture tel que décrit dans l’étape 4.5.).</li>
	<li>Cette partie du protocole est pratiquement identique à la partie correspondante du protocole macrophage (étapes 4,6 – 4.12. Protocole de macrophages). Pour des expériences utilisent uniquement des cellules adhérentes. Jour 10-12, recueillir les cellules à l’aide d’EDTA, compter et leur plaque sur une nouvelle surface. Vérifier l’expression des marqueurs de surface de la différenciation des cellules dendritiques (CD11c +, CD11b + F4/80-) par cytométrie en flux.</li>
</ol>6. la production de BMDMs et BMDCs exprimant EGFP-tag protéine d’intérêt
<ol><li>Resuspendre le culot de cellules de moelle osseuse a obtenu en étape 3.10. en DMEM additionné de 10 % de BF et d’antibiotiques et de compter les cellules non vides. Pour l’infection, utiliser 2 – 5 x 106 cellules BM / puits d’une culture de tissu de 6 puits traités plaque.</li>
	<li>Plaque les cellules dans 1 mL de médias DMEM préparés par complétée, soit avec M-CSF pour la différenciation en BMDMs GM-CSF à la différenciation dans BMDCs. garder les cellules pendant 4 à 6 h dans un incubateur de culture tissulaire avec 5 % de CO2 à 37 ° C.</li>
	<li>Ajouter 2 mL de virus fraîchement prélevé (« surnageant 1 ») additionné de polybrene (12 µg/mL, la concentration finale 8 µg/mL après addition aux cellules). Remarque : L’aliquote congelé du surnageant contenant le virus peut également être utilisé, mais l’efficacité sera plus faible.</li>
	<li>Centrifuger la plaque à 1 250 g pendant 90 min à 30 ° C (avec lente accélération et de décélération). Puis, incuber pendant 4 h avec 5 % de CO2 à 37 ° C.</li>
	<li>Facultatif : Remplacer 2 mL de la culture médiatique avec frais cytokine respectif contenant moyenne (M-CSF ou GM-CSF) et de la culture avec 5 % de CO2 à 37 ° C. Le deuxième jour, prélever 2 mL de milieu de culture et répéter la procédure de toute infection (étape 6.3 – 6,4) avec 2 mL de virus fraîchement prélevés (« surnageant 2 »). Remarque : Cette étape peut augmenter l’efficacité de l’infection. Amélioration après que la deuxième infection est dépendante de la protéine cellulaire de type et de la cible et à notre expérience peut varier d’augmentation de 30 % en efficacité à aucune amélioration du tout.</li>
	<li>Recueillir les cellules non adhérentes, transférer dans un tube à centrifuger 15 mL et essorage à 500 g pendant 5 min (4 ° C). Jeter le surnageant.</li>
	<li>Resuspendre le culot dans 10 mL de milieu de culture avec M-CSF ou GM-CSF, placer les cellules dans une boite de Petri traitée 10 cm sans culture tissulaire et de la culture à 37 ° C, 5 % de CO2. Nombre optimal de cellules pour un plat de 10 cm est 5-10 x 106 pour les dérivés de monocytes BM et 10 – 15 x 106 cellules dendritiques dérivées de BM. NOTE : Petits plats ou assiettes peuvent être utilisés, mais le nombre de cellules doit être ajusté en conséquence.</li>
	<li>Suivez le macrophage et protocole de culture et de la différenciation des cellules dendritiques décrit à l’étape 4 et 5.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L’expression de la protéine d’intérêt dans les cellules cibles est une étape clé dans plusieurs types d’études biologiques. Différenciées des macrophages et les cellules dendritiques sont difficiles à transfecter par transfection standard et des techniques de transduction rétrovirale. Contournant la transfection des cellules différenciées avec retroviral transduction des ancêtres de moelle, suivie de différenciation lorsqu’ils portent déjà la construction désirée, est une étape cruciale permettant l’expression d’ADNc ect...

Cellules myéloïdes représentent un élément indispensable de nos mécanismes de défense contre les agents pathogènes. Ils sont capables d’éliminer rapidement les microbes, mais aussi les cellules mourantes. En outre, ils sont également impliqués dans la régulation de réparation et développement des tissus et dans le maintien de l’homéostasie du1,2,3. Toutes les cellules myéloïdes différencient des progéniteurs myéloïdes communs dans la moelle osseuse. Leur différenciation en plusieurs sous-ensembles distincts morphologiquement et fonctionnellement est largement contrôlée par les cytokines et leurs diverses combinaisons4. Les sous-ensembles de cellules myéloïdes plus intensivement étudiés incluent les granulocytes neutrophiles, les macrophages et les cellules dendritiques. Défauts dans l’une de ces populations mènent à des conséquences potentiellement mortelles et cause de graves dysfonctionnements du système immunitaire chez l’homme et la souris1,2,3,5, 6.
À la différence des granulocytes neutrophiles, les macrophages et les cellules dendritiques sont des cellules résidentes des tissus et leur abondance dans les organes du système immunitaire est relativement faible. Ainsi, l’isolation et la purification de cellules dendritiques primaires et les macrophages pour les expériences nécessitant un grand nombre de ces cellules est coûteux et souvent impossible. Pour résoudre ce problème, les protocoles ont été développés afin d’obtenir de grandes quantités de homogènes macrophages ou cellules dendritiques in vitro. Ces approches sont basées sur la différenciation des cellules de la moelle épinière murine en présence de cytokines : and macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) pour les macrophages et le facteur stimulant les colonies de granulocytes et macrophages (GM-CSF) ou Flt3 ligand pour les cellules dendritiques7,8,9,10,11,12. Cellules générées par cette méthode sont couramment décrits dans la littérature, comme la moelle osseuse provenant des macrophages (BMDMs) et dérivés de la moelle osseuse des cellules dendritiques (BMDCs). Elles ont des propriétés physiologiques plus en commun avec le primaires macrophages ou cellules dendritiques qu’avec des lignées de cellules correspondantes. Un autre avantage majeur est la possibilité d’obtenir ces forment des cellules génétiquement modifiées souris13. Études de comparatif entre les cellules de type sauvage et cellules dérivées des souris génétiquement modifiées sont souvent essentiels pour découvrir nouvelles fonctions des gènes ou des protéines d’intérêt.
Analyse de localisation sous-cellulaire des protéines dans les cellules vivantes exige que l’accouplement d’un label fluorescent à la protéine d’intérêt in vivo. Ceci est plus souvent réalisé en exprimant construct génétiquement encodé fusion composé d’une protéine analysée couplée (souvent via un linker court) à une protéine fluorescente (e.g., green fluorescent protein (GFP))14,15 , 16. il est difficile de l’expression des protéines fluorescent étiquetées dans les cellules dendritiques ou les macrophages. Ces cellules sont généralement difficiles à transfecter de procédures standard de transfection et l’efficacité ont tendance à être très faible. En outre, la transfection est transitoire, il génère le stress cellulaire et atteints d’intensité de la fluorescence pourrait ne pas suffire pour microscopie17. Afin d’obtenir une fraction raisonnable de ces cellules avec un niveau suffisant d’expression du transgène, l’infection des cellules souches de la moelle osseuse avec retroviral vecteurs et leur différenciation ultérieure en BMDMs ou BMDCs est devenu un très efficace approche. Il a laissé pour l’analyse des protéines d’origine myéloïde dans leur environnement natif de cellulaire, aussi bien dans un état stable ou au cours de processus qui sont essentiels pour le système immunitaire comme la phagocytose, la formation des synapses immunologiques ou la migration. Nous décrivons ici un protocole qui permet l’expression stable des protéines fluorescent étiquetés d’intérêt dans les macrophages murins médullaire dérivé et les cellules dendritiques.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis</td><td>15028</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis</td><td>10270</td><td>Pour l’approvisionnement des milieux</td></tr><tr><td>KHCO3</td><td>Lachema, Brno, République tchèque</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, États-Unis)</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin</td><td>BB Pharma AS, Prague, République tchèque</td><td>N/A</td><td>PENICILIN G 1,0 DRASELN&Aacute ; SOL' BIOTIKA</td></tr><tr><td>Streptomycine</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td><td>S9137</td><td>Sulfate de streptomycine en poudre</td></tr><tr><td>Gentamicine</td><td>Dr. Kulich Pharma, Hradec Kr&aacute ; lov&eacute ;, République tchèque</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Polyéthylénimine, linéaire, MW 25,000</td><td>Polyscience, Warrington, PA, USA</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Préparé en interne par le service multimédia d’IMG ASCR, Prague, République</td> <td>tchèqueN/A</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-souris/humain CD11b, clone M1/70</td><td>BioLegend (San Diego, CA, USA)</td><td>101212</td><td>analyse par cytométrie en flux</td></tr><tr><td>Anticorps PE anti-souris F4/80, clone BM8</td><td>BioLegend (San Diego, CA, USA)</td><td>123110</td><td>analyse par cytométrie en flux</td></tr><tr><td>APC anti-souris CD11c Anticorps clone N418</td><td>BioLegend (San Diego, CA, USA)</td><td>117310</td><td>analyse par cytométrie en flux</td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>PeproTech (Rocky Hill, NJ, États-Unis)</td><td>315-02</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>PeproTech (Rocky Hill, NJ, États-Unis)</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis</td><td>H1398</td><td>Utilisation de l’analyse par cytométrie en flux à 1-2 & micro ; g/mL</td></tr></tbody></table>

expression des protéines de fusion fluorescent en murine dérivés de la moelle osseuse des cellules dendritiques et macrophages

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

Les macrophages et les cellules dendritiques sont des cellules cruciales qui forment la première ligne de défense contre les agents pathogènes. Ils jouent également un rôle important dans le déclenchement d’une réponse immunitaire adaptative. Des travaux expérimentaux avec ces cellules sont plutôt difficile. Leur abondance dans les organes et les tissus est relativement faible. Ainsi, ils ne peuvent pas être isolés en grand nombre. Ils sont également difficiles à transfecter constructions d’ADNc. Dans le modèle murin, ces problèmes peuvent être partiellement résolus par in vitro la différenciation des progéniteurs de la moelle osseuse en présence de M-CSF pour les macrophages ou GM-CSF pour les cellules dendritiques. De cette façon, il est possible d’obtenir de grandes quantités de ces cellules de très peu d’animaux. En outre, les cellules souches de la moelle osseuse peuvent être transduites avec des vecteurs rétroviraux transportant des constructions de l’ARNC durant les premiers stades de la culture avant leur différenciation dans la moelle osseuse provenant de cellules dendritiques et macrophages. Ainsi, transduction rétrovirale, suivie par la différenciation in vitro peut être utilisée pour exprimer les diverses constructions de cDNA dans ces cellules. La capacité d’exprimer les protéines ectopiques considérablement élargit sa gamme d’expériences qui peuvent être effectuées sur ces cellules, y compris l’imagerie de cellules vivantes de protéines fluorescentes, des purifications en tandem pour les analyses de l’interactome, analyses de la structure-fonction, le contrôle des fonctions cellulaires avec biocapteurs et bien d’autres. Dans cet article, nous décrivons un protocole détaillé pour la transduction rétrovirale du murin de la moelle osseuse provenant de cellules dendritiques et macrophages avec vecteurs codant pour des protéines fluorescent-étiquetées. L’exemple de deux protéines d’adaptateur, OPAL1 et PSTPIP2, nous démontrons son application pratique en cytométrie en flux et en microscopie. Nous discuterons les avantages et les limites de cette approche.

Protéines de signalisation adaptateur sont habituellement petites protéines sans aucune activité enzymatique. Ils possèdent différents domaines d’interaction ou les motifs et qui médient liaison à d’autres protéines impliqués dans la transduction des signaux, y compris les tyrosines kinases, phosphatases, ubiquitine ligases et autres21. Pour la démonstration des fonctionnalités de ce protocole, adaptateurs de cellules myéloïdes PSTPIP2 et OPAL1 ont été sélectionnés...

Dans cet article, nous fournissons qu'un protocole détaillé pour l’expression des protéines de fusion fluorescent murin de moelle osseuse provenant des macrophages et les cellules dendritiques. La méthode est basée sur la transduction de la moelle osseuse progéniteurs avec constructions retroviral suivies de différenciation en macrophages et dendritiques des cellules in vitro.

Expression des protéines de Fusion Fluorescent en Murine dérivés de la moelle osseuse des cellules dendritiques et Macrophages

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines du macrophage et de la biologie cellulaire dendritique sur la localisation subcellulaire et la dynamique de diverses protéines dans ces types de cellules. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle est relativement simple, peu coûteuse et démontre une meilleure efficacité et stabilité d’expression que la majorité des autres méthodes disponibles. Jarmila Kralova, une étudiante diplômée de mon laboratoire, démontrera la procédure.Pour produire le rétrovirus, plaquez une suspension à cellule unique des cellules platinum eco-emballage dans une boîte de Pétri de 10 centimètres et cultivez les cellules en 15 millilitres de DMEM, complétées par 10% sérum bovin fœtal, ou FBS, jusqu’à ce que la culture soit 50 à 60% confluent. Le lendemain, ajoutez 20 microgrammes de la construction rétrovirale d’intérêt et 10 microgrammes de vecteur d’éco-emballage PCL à 1 millilitre de DMEM sans sérum, avec mélange doux. Ajouter 75 microlitres de l’Île-du-Prince-Édouard dans 1 millilitre de DMEM sans sérum et antibiotiques à un deuxième tube pour une incubation de cinq minutes à température ambiante, et mélanger le co

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Cette vidéo montre la procédure pour différencier les cellules dendritiques myéloïdes de la moelle osseuse de souris. Isolement du tibia et du fémur de souris, et le traitement de la moelle osseuse sont démontrés. Photos montrant la morphologie des cellules avant et après différenciation, et les chiffres illustrant phénotype cellulaire et la maturation de production d'IL-12 suivantes à l'aide CpG sont affichés.

Culture de cellules dendritiques myéloïdes à partir de précurseurs de moelle osseuse

Présentation de l'antigène dans les organes lymphoïdes secondaires par des cellules dendritiques est crucial pour l'initiation de la cellule T médiée réponse immunitaire adaptative. Ici nous démontrons la culture de la moelle osseuse des cellules dendritiques dérivées de souris, l'activation et d'étiquetage pour les deux photons d'imagerie.

Génération de la moelle osseuse des cellules dendritiques dérivées murin pour l&#39;utilisation dans l&#39;imagerie 2-photons

Dendritiques antigènes des cellules d'absorption et de migrer vers les organes à l'abri de présenter les antigènes aux cellules T traitées. Qdot nanocristal étiquetage fournit un signal de longue durée et stable fluorescentes. Cela permet le suivi des cellules dendritiques à différents organes par microscopie fluorescente.

Génération et d&#39;étiquetage des murins de la moelle osseuse des cellules dendritiques dérivées des nanocristaux Qdot pour les études de suivi

Les macrophages ont longtemps été reconnu comme un élément essentiel des réponses immunitaires innées et adaptatives. L'explosion récente des connaissances relatives aux aspects évolutifs, génétiques, biochimiques et de l'interaction entre les macrophages et les microbes a renouvelé l'attention des scientifiques à macrophages. Cet article décrit une méthode pour différencier les macrophages de moelle osseuse de souris.

Dérivées de moelle osseuse Macrophages production

Combinatoires 5 protéines fluorescentes de marquage des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques permet in vivo suivi clonale par confocale et microscopie à deux photons, apportant des éclairages sur la moelle osseuse hématopoïétique architecture lors de la régénération. Cette méthode permet de cartographier de sort non-invasif des cellules HSPCs dérivés spectrale codés dans des tissus intacts pour de longues périodes de temps après la transplantation.

In vivo suivi clonale de cellules souches hématopoïétiques et progénitrices Marqué par cinq protéines fluorescentes confocale et multiphotonique Microscopie

Les cellules de moelle osseuse cultivées avec le facteur de stimulation des colonies de macrophages granulocytes (GM-CSF) génèrent une culture hétérogène contenant des macrophages et des cellules dendritiques (DC). Cette méthode met en évidence l’utilisation de la liaison au MHCII et à l’hyaluronane (HA) pour différencier les macrophages des CD dans la culture GM-CSF. Les macrophages de cette culture présentent de nombreuses similitudes avec les macrophages alvéolaires.

Génération et identification de GM-CSF dérivé alvéolaires comme Macrophages et cellules dendritiques à partir de moelle osseuse de souris

Nous rapportons un protocole utilisant les cellules activées par fluorescence de tri pour isoler les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) avec une grande pureté à partir de la moelle osseuse de souris lupus sujettes à des études fonctionnelles de pDC.

Fluorescence-tri cellulaire activé pour la purification de cellules dendritiques plasmacytoïdes de la moelle osseuse de souris

Cette étude démontre l’utilisation de la cytométrie à détecter une production réactives de l’oxygène (dro) résultant de l’activation de la FcγR. Cette méthode peut être utilisée pour évaluer les changements dans les antimicrobiens et oxydo-réduction fonction des phagocytes en réponse à des complexes immuns, micro-organismes opsonisées ou direct FcγR réticulation de signalisation.

Mesure de débit par cytométrie en flux de Production de ROS dans les Macrophages en réponse à la réticulation FcγR

Nous présentons ici une méthode économique et efficace pour isoler et générer des cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse de haute pureté à partir de souris après 7 jours de culture avec 10 ng / mL GM-CSF / IL-4.

Protocole économique et efficace pour isoler et cultiver des cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse à partir de souris

Ce protocole décrit l’isolement de thymocytes doublement négatifs du thymus de souris, suivi d’une transduction rétrovirale et d’une co-culture sur le système de co-culture de lignée cellulaire stromale de moelle osseuse de type delta 4-exprimant la moelle osseuse (OP9-DL4) pour une analyse fonctionnelle plus approfondie.

Co-culture et transduction de thymocytes murins sur des cellules stromales exprimant 4-Delta-like pour étudier les oncogènes dans la leucémie à cellules T

Ce protocole décrit une méthode non enzymatique et simple pour isoler des cellules de moelle osseuse de souris néonatales âgées de 7 à 9 jours et générer des macrophages différenciés en utilisant un surnageant de cellules L929 comme source de facteur de stimulation des colonies de granulocytes (M-CSF). Les macrophages dérivés de la moelle osseuse ont été analysés plus en détail pour les antigènes de surface F4/80, CD206, CD11b et la compétence fonctionnelle.

Isolement de moelle osseuse de souris néonatale et préparation de macrophages dérivés de la moelle osseuse

Apprenez à exprimer des protéines de fusion fluorescentes dans des cellules dendritiques et des macrophages dérivés de la moelle osseuse murine. Cette méthode simple utilise la transduction rétrovirale pour visualiser la localisation protéique.

Expression des protéines de Fusion Fluorescent en Murine dérivés de la moelle osseuse des cellules dendritiques et Macrophages

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