Name: Avec 22 3 anticorps Anti-PD-L1 se concentrent sur la biopsie et cytologie échantillons provenant de patients atteints de Cancer de poumon Non à petites cellules (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Découvrez une méthode d'immunohistochimie utilisant le concentré d'anticorps 22C3 pour évaluer l'expression de PD-L1 sur des échantillons de biopsie et de cytologie de patients atteints de cancer du poumon non à petites cellules.

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Cette étude a été commanditée par Merck & Co., Inc., Kenilworth, NJ, USA. Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte de données et analyse, décision de publier ou préparation du manuscrit.

Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité d’éthique local (Human Research Ethics Committee, Centre Hospitalier Universitaire de Nice/Tumorothèque BB-0033-00025).
Remarque : Ce protocole est réglé spécifiquement pour l’utilisation du concentré 22 3 anticorps sur un stainer d’IHC automatisé disponible dans le commerce (appelée pour comme autostainer ici, voir la Table des matières) pour biopsie de la tumeur et les échantillons de cytologie.
1. préparation des échantillons de tissu de tumeur
<ol><li>Fixer un tissu tumoral dans 10 % de formol tamponné neutre (NBF) dans une cassette. Remarque : Un tissu tumoral de tumeurs pulmonaires proximales est généralement obtenu par bronchoscopie, effectuée sous sédation modérée par un pneumologue ou un pneumologue. Pour les lésions périphériques et pneumopathie diffuse, une biopsie transbronchique ou aiguille est indiquée. Ces procédures sont généralement effectués dans une salle de chirurgie ou de soins intensifs.</li>
	<li>Incorporer la cassette à la paraffine. NOTE : Fixation peut être réalisée par perfusion ou immersion immédiatement après dissection et nécessite généralement 8 à 10 h. Le volume du fixateur doit être 15 à 20 fois plus élevé que le volume de l’échantillon. Il n’est pas recommandé de fixer le tissu biopsie pendant plus de 10 heures, parce qu’overfixation peut provoquer le masquage de l’antigène. La vitesse de fixation est environ 1 mm/h à température ambiante.</li>
	<li>S’infiltrer dans l’échantillon de tissu fixe avec de la cire dans le processeur de tissu (voir Table des matières). NOTE : Déshydratation est effectuée dans trois bains d’alcool avec augmentation des concentrations de 70 %, 85 % et 90 %. Enfin, l’eau est enlevée par trois bains final d’alcool absolu. La compensation est effectuée dans trois bains de toluène et l’infiltration de cire dans les bains de cire chaude (44 à 60 ° C).</li>
	<li>Incorporer le tissu à l’intérieur d’un moule rempli avec de la paraffine fondue (voir Table des matières) et attendez de solidification.</li>
	<li>Article les tissus inclus en paraffine à une épaisseur de 3 μm sur un microtome.</li>
	<li>Transfert le ruban de paraffine pour un verre de microscope chargés positivement glisser (voir Table des matières).</li>
	<li>Sécher la lame pendant 1 h à 37 ° C. Note : Stocker les coupes de tissus à 2 et 8 ° C (de préférence) ou à température ambiante jusqu'à 25 ° C pour préserver l’antigénicité et tache au bout de 15 jours de sectionnement.</li>
</ol>2. préparation des échantillons de cytologie
<ol><li>
Recueillir des lavages bronchiques dans une solution d’agent de conservation (voir Table des matières). Remarque : Pour ce faire, technique de bronchoscopie standard est utilisée.<ol>
<li>Lavage de la distribution de la bronche à échantillonner. Recueillir le lavage dans un récipient propre. Étiquette du récipient avec le patient premier et nom de famille, date de naissance et source du spécimen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transférer les lavages bronchiques dans un tube conique de 50 mL et ajouter 2 g de DL-le dithiothréitol (poudre) (voir la Table des matières), vortex le tube pendant 30 min et centrifuger à 250 x g pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Retirez le surnageant et ajouter 10 mL d’une solution mucolytique (voir Table des matières).</li>
	<li>Agiter l’échantillon pendant 20 min à vitesse moyenne (niveau 9) et il centrifuger à 250 x g pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Retirez le surnageant et le culot de dépôt dans les tubes de prélèvement contenant 10 % NBF.</li>
	<li>Ajouter 4 gouttes d’un réactif de préparation du bloc cellulaire (voir Table des matières) pour le culot cellulaire.</li>
	<li>Transférer le culot cellulaire sur une cassette, de fixer à 10 % NBF et paraffine-incorporez-le à la préparation de bloc de cellules et de sectionnement (voir étapes 1,1 à 1,7).</li>
</ol>3. test de coloration PD-L1
<ol><li>Allumez l’appareil et l’ordinateur.</li>
	<li>Double-cliquez sur l’icône de l’appareil et choisir l’utilisateur.</li>
	<li>Cliquez sur « Create label » puis sur « Protocole ».</li>
	<li>Double-cliquez sur le protocole 22 3. Remarque : Le protocole est tout d’abord installé sur l’ordinateur de l’appareil en cliquant sur « créer le protocole ». Le protocole complet est fourni comme supplémentaire 1 fichier.</li>
	<li>Écrire l’ID du patient sur l’étiquette et cliquer sur « Imprimer ».</li>
	<li>Coller l’étiquette sur la diapositive.</li>
	<li>Ouvrir le tiroir de la diapositive en appuyant sur le bouton du tiroir qui a été choisi.</li>
	<li>Mettre la lame marquée sur le pad thermique avec l’étiquette orientée vers l’amont et vers l’intérieur.</li>
	<li>Fermer le tiroir de la diapositive.</li>
	<li>Enlever les bouchons des distributeurs et charger les réactifs sur les grilles des réactifs.</li>
	<li>Ouvrez le capot de la passoire et placez les grilles sur le carrousel des réactifs en s’assurant qu’ils s’adapter et maintenir en position.</li>
	<li>Fermez le capot.</li>
	<li>Dans le logiciel, cliquez sur l’instrument qui sera utilisé et cliquez sur « Running ».</li>
	<li>À la fin de la procédure de l’IHC, rincer la lame pendant quelques secondes avec l’eau du robinet et une goutte d’une solution de nettoyage.</li>
	<li>Réhydrater la diapositive avec un bain d’éthanol 100 % et un second bain d’éthanol à 95 % pendant plusieurs secondes.</li>
	<li>Placez la lame dans la machine de recouvrement pour un chargement automatique de la lamelle.</li>
</ol>4. l’interprétation de la coloration de PD-L1
Remarque : Un pathologiste qualifié doit effectuer l’interprétation du test IHC PD-L1.
<ol><li>Évaluer la qualité de la coloration de PD-L1 en analysant les contrôles positifs et négatifs avant l’examen de l’échantillon du patient. NOTE : Les résultats obtenus sur l’échantillon du patient sont considérés comme non valides si la coloration des contrôles n’est pas acceptable.</li>
	<li>Confirmer la présence d’au moins 100 cellules de tumeur viable sous un microscope. NOTE : Le rapport lorsque l’échantillon du patient a moins de 100 cellules tumorales.</li>
	<li>À un faible grossissement de 4 X, évaluer tous les secteurs tumeur bien préservé de positifs et négatifs. Remarque : À un faible grossissement, coloration de la membrane partielle ou coloration de membrane de faible intensité (1 +) peut être difficile à reconnaître.</li>
	<li>Score de coloration de la membrane cellulaire partielle ou complète. NOTE : La coloration cytoplasmique doit être exclu d’interprétation.</li>
	<li>Calculer la TPS en évaluant la proportion de cellules tumorales positif PD-L1 par rapport à toutes les cellules de tumeur présents dans les zones de tumeur bien préservé. Remarque : Seules les cellules tumorales viables devraient être examinées. Tous les autres éléments cellulaires, tels que les cellules immunitaires, les cellules nécrotiques, les cellules normales et artefacts, doivent être exclus de l’examen.</li>
</ol>

<ol><li>Garon, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pembrolizumab+for+the+treatment+of+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pembrolizumab for the treatment of non-small-cell lung cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (21), 2018-2028 (2015).</li>
<li>Herbst, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pembrolizumab+versus+docetaxel+for+previously+treated%2C+PD-L1-positive%2C+advanced+non-small-cell+lung+cancer+%28KEYNOTE-010%29%3A+a+randomised+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Pembrolizumab versus docetaxel for previously treated, PD-L1-positive, advanced non-small-cell lung cancer (KEYNOTE-010): a randomised controlled trial.</a> The Lancet. 387 (10027), 1540-1550 (2016).</li>
<li>Reck, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pembrolizumab+versus+Chemotherapy+for+PD-L1-Positive+Non-Small-Cell+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pembrolizumab versus Chemotherapy for PD-L1-Positive Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 375 (19), 1823-1833 (2016).</li>
<li>Langer, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carboplatin+and+pemetrexed+with+or+without+pembrolizumab+for+advanced%2C+non-squamous+non-small-cell+lung+cancer%3A+a+randomised%2C+phase+2+cohort+of+the+open-label+KEYNOTE-021+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Oncology%22%5BJournal%5D)">Carboplatin and pemetrexed with or without pembrolizumab for advanced, non-squamous non-small-cell lung cancer: a randomised, phase 2 cohort of the open-label KEYNOTE-021 study.</a> The Lancet Oncology. 17 (11), 1497-1508 (2016).</li>
<li>Buttner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+Death-Ligand+1+Immunohistochemistry+Testing%3A+A+Review+of+Analytical+Assays+and+Clinical+Implementation+in+Non-Small-Cell+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Programmed Death-Ligand 1 Immunohistochemistry Testing: A Review of Analytical Assays and Clinical Implementation in Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 35 (34), 3867-3876 (2017).</li>
<li>Folch, E., Costa, D. B., Wright, J., VanderLaan, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+cancer+diagnosis+and+staging+in+the+minimally+invasive+age+with+increasing+demands+for+tissue+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Lung+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Lung cancer diagnosis and staging in the minimally invasive age with increasing demands for tissue analysis.</a> Translational Lung Cancer Research. 4 (4), 392-403 (2015).</li>
<li>Padmanabhan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+Adequacy+of+Small+Biopsy+and+Fine-Needle+Aspiration+Specimens+for+Molecular+Testing+by+Next-Generation+Sequencing+in+Patients+With+Lung+Cancer%3A+A+Quality+Improvement+Study+at+Dartmouth-Hitchcock+Medical+Center%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Improving Adequacy of Small Biopsy and Fine-Needle Aspiration Specimens for Molecular Testing by Next-Generation Sequencing in Patients With Lung Cancer: A Quality Improvement Study at Dartmouth-Hitchcock Medical Center.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 141 (3), 402-409 (2017).</li>
<li>Tsao, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTsao%2C+MS+%22IASLC+ATLAS+of+PD-L1+Immunohistochemistry+Testing+in+Lung+Cancer%22">IASLC ATLAS of PD-L1 Immunohistochemistry Testing in Lung Cancer</a>. , International Association for the Study of Lung Cancer (IASLC) Press. (2017).</li>
<li>Thunnissen, E., de Langen, A. J., Smit, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-L1+IHC+in+NSCLC+with+a+global+and+methodological+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">PD-L1 IHC in NSCLC with a global and methodological perspective.</a> Lung Cancer. , 102-105 (2017).</li>
<li>Ilie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+22C3+anti-PD-L1+antibody+to+determine+PD-L1+expression+in+multiple+automated+immunohistochemistry+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Use of the 22C3 anti-PD-L1 antibody to determine PD-L1 expression in multiple automated immunohistochemistry platforms.</a> PLoS One. 12 (8), e0183023(2017).</li>
<li>Ilie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+22C3+anti-programmed+death+ligand+1+antibody+to+determine+programmed+death+ligand+1+expression+in+cytology+samples+obtained+from+non-small+cell+lung+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cytopathology%22%5BJournal%5D)">Use of the 22C3 anti-programmed death ligand 1 antibody to determine programmed death ligand 1 expression in cytology samples obtained from non-small cell lung cancer patients.</a> Cancer Cytopathology. 126 (4), 264-274 (2018).</li>
<li>Skov, B. G., Skov, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired+Comparison+of+PD-L1+Expression+on+Cytologic+and+Histologic+Specimens+From+Malignancies+in+the+Lung+Assessed+With+PD-L1+IHC+28-8pharmDx+and+PD-L1+IHC+22C3pharmDx%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Immunohistochemistry+%26+Molecular+Morphology%22%5BJournal%5D)">Paired Comparison of PD-L1 Expression on Cytologic and Histologic Specimens From Malignancies in the Lung Assessed With PD-L1 IHC 28-8pharmDx and PD-L1 IHC 22C3pharmDx.</a> Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 25 (7), 453-459 (2017).</li>
<li>Russell-Goldman, E., Kravets, S., Dahlberg, S. E., Sholl, L. M., Vivero, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytologic-histologic+correlation+of+programmed+death-ligand+1+immunohistochemistry+in+lung+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cytopathology%22%5BJournal%5D)">Cytologic-histologic correlation of programmed death-ligand 1 immunohistochemistry in lung carcinomas.</a> Cancer Cytopathology. 126 (4), 253-263 (2018).</li>
<li>Heymann, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-L1+expression+in+non-small+cell+lung+carcinoma%3A+Comparison+among+cytology%2C+small+biopsy%2C+and+surgical+resection+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cytopathology%22%5BJournal%5D)">PD-L1 expression in non-small cell lung carcinoma: Comparison among cytology, small biopsy, and surgical resection specimens.</a> Cancer Cytopathology. 125 (12), 896-907 (2017).</li>
<li>Stoy, S. P., Rosen, L., Mueller, J., Murgu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+death-ligand+1+testing+of+lung+cancer+cytology+specimens+obtained+with+bronchoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cytopathology%22%5BJournal%5D)">Programmed death-ligand 1 testing of lung cancer cytology specimens obtained with bronchoscopy.</a> Cancer Cytopathology. 126 (2), 122-128 (2018).</li>
<li>Ilie, M., Hofman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility+of+PD-L1+assessment+in+non-small+cell+lung+cancer-know+your+limits+but+never+stop+trying+to+exceed+them%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Lung+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Reproducibility of PD-L1 assessment in non-small cell lung cancer-know your limits but never stop trying to exceed them.</a> Translational Lung Cancer Research. 6 (Suppl 1), S51-S54 (2017).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous avons validé une LDT optimisée à l’aide du concentré d’anticorps 22 3 PD-L1, en le comparant avec les correspondants des essais commerciaux validés cliniquement10,11. Les 3 22 concentrés LDT à base d’anticorps ont montré un taux élevé de concordance entre la biopsie (~ 100 %) et les échantillons de cytologie (~ 95 %) par rapport à l’expression de PD-L1 IHC déterminée en utilisant le test IHC PD-L1 22 3 ≥ 1 % TPS tant la ≥50 % TPS points de découpage. Comme l...

Des essais cliniques récents ont démontré l’efficacité de pembrolizumab, un anticorps monoclonal IgG4 kappa isotype anticorps humanisé qui bloque l’interaction entre la mort cellulaire programmée 1 (PD-1) et ses ligands, PD-L1 et L2-PD, dans le traitement des patients atteints de Advanced NSCLC1,2,3,4.
Actuellement, pembrolizumab est approuvé pour le traitement de NSCLC PD-L1-exprimant chez les deux patients naïfs de tout traitement avec une expression de PD-L1 TPS de ≥50 % et aucun récepteur de facteur de croissance épidermique (EGFR) ou les aberrations de génomique tumorale anaplastic lymphoma kinase (ALK)3 et pour précédemment traités avec un TPS de PD-L1 de ≥ 1 %1.
PD-L1 expression de la protéine détectée par IHC a été largement utilisée comme un dosage de biomarqueurs prédictifs des thérapies anti-PD-1/PD-L1. Dans les essais cliniques pembrolizumab, le TPS de PD-L1 obtenue avec fixés au formol des échantillons de tissus (FFIP) paraffine a déterminé en utilisant le PD-L1 IHC 22 3 compagnon essai5. Cet essai a été approuvé par la Food and Drug Administration (FDA) et a été marqué en Europe pour la détermination de la tumeur PD-L1 TPS5.
Les options globales supplémentaires dans des institutions pour des évaluations fiables et de qualité de la TPS de PD-L1 avec tdl qui utilisent le concentré d’anticorps 22 3 sont essentielles pour appuyer les décisions cliniques concernant le patient d’admissibilité pour pembrolizumab traitement. Un grand nombre de laboratoires de pathologie n’ont pas accès à l’analyse de l’IHC PD-L1 22 3 diagnostic compagnon. Par conséquent, le développement des TDL fiable et cohérent compatible avec les plateformes d’autostainer IHC supplémentaires, largement disponibles est essentiel.
Par ailleurs, il y a une nécessité d’établir des TDL en utilisant des échantillons de cytologie qui sont le seul spécimen type fréquemment disponible de patients atteints de CBNPC. L’essai de compagnon de PD-L1 IHC 22 3 est validé pour les résections, biopsies à l’aiguille centrale et bronchoscopies seulement si la bronchoscopie donne 100 cellules tumorales. Bien que les types d’échantillon ci-dessus sont souvent obtenus, échantillons cytologiques sont plus facilement perçus et sont le type d’échantillon plus couramment disponible dans certains établissements6,7. Cependant, il n’y a actuellement aucun test diagnostique validé disponibles pour l’évaluation de l’expression de PD-L1 dans des échantillons de cytologie ; TDL fiable compatible avec les échantillons de cytologie faciliterait davantage qualité PD-L1 test.
En outre, lors de l’établissement la validation clinique d’une LDT, l’IHC doit être effectuée de façon similaire au test commercial cliniquement validé correspondant8. Par exemple, plusieurs étapes critiques doivent être vérifiées pour obtenir le même signal dans des coupes sériées comme un titrage d’anticorps, retards de prétraitement, temps d’incubation et amplification systèmes9.
Nous avons récemment développé une LDT optimisée qui utilise le concentré 22 3 anticorps pour évaluer l’expression de PD-L1 sur les biopsies de tumeurs et cytologie échantillons10,11. Nous avons constaté une forte concordance avec la LDT contre le « gold standard » PD-L1 IHC 3 22 dosage10,11. Ce protocole cliniquement validé soutiendra PD-L1 fiables et de haute qualité, stable dans toutes les régions dans le monde.

<table><tbody><tr><td>NovaPrep HQ1</td><td>Novacyt</td><td>NA</td><td>Solution de conservation pour échantillons de cytologie</td></tr><tr><td>Novaprep&reg ; HQ+ B</td><td>Novacyt</td><td>NA</td><td>Solution mucolytique</td></tr><tr><td>Tissue-Tek VIP 6</td><td>Sakura</td><td>6042 VIP 6</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek TEC 5 Système de console d’enrobage tissulaire</td><td>Sakura</td><td>5229 TEC 5</td><td></td></tr><tr><td>lame de microscope en verre SuperFrost Plus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4951PLUS4</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>poudre Sigma-Aldrich</td><td>D3801</td><td></td></tr><tr><td>Heidolph Multi Reax Vortex Shaker</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-889-410</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Cytoblock</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7401150</td><td></td></tr><tr><td>22C3 anti--L1 concentré</td><td>anticorps Agilent Dako</td><td>#M365329</td><td></td></tr><tr><td>-L1 IHC 22C3 pharmDx</td><td>Agilent Dako</td><td>SK006</td><td></td></tr><tr><td>Autostainer Link 48</td><td>Agilent Dako</td><td>AS480</td><td></td></tr><tr><td>BenchMark ULTRA autostainer</td><td>Ventana</td><td>#750-600</td><td></td></tr><tr><td>OptiView HQ Universal Linker</td><td>Ventana</td><td>#760-700</td><td></td></tr><tr><td>OptiView HRP</td><td>Multimer Ventana</td><td>#760-700</td><td></td></tr><tr><td>OptiView Amplification H2O2</td><td>Ventana</td><td>#760-099</td><td></td></tr><tr><td>OptiView Amplifier</td><td>Ventana</td><td>#760-099</td><td></td></tr><tr><td>OptiView Amplification Multimère</td><td>Ventana</td><td>#760-100</td><td></td></tr><tr><td>OptiView DAB</td><td>Ventana</td><td>#760-700</td><td></td></tr><tr><td>OptiView Copper</td><td>Ventana</td><td>#760-700</td><td></td></tr><tr><td>Hématoxyline II</td><td>Ventana</td><td>#790-2208</td><td></td></tr><tr><td>Réactif de bleuissement</td><td>Ventana</td><td>#760-2037</td><td></td></tr><tr><td>Cell Conditioning 1 (CC1)</td><td>Ventana</td><td>#950-124</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Film Coverslipper</td><td>Sakura</td><td>4742</td><td></td></tr></tbody></table>

avec 22 3 anticorps anti-pd-l1 se concentrent sur la biopsie et cytologie échantillons provenant de patients atteints de cancer de poumon non à petites cellules

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

Pembrolizumab en monothérapie a été approuvé pour le traitement de première et deuxième ligne des patients atteints de cancer PD-L1-exprimant avancé de poumon de non à petites cellules (CPNPC). Essais pour PD-L1 expression avec le PD-L1 immunohistochimie (IHC) 22 3 test diagnostique compagnon, qui donne une proportion de tumeur marquer (TPS), a été validé sur un tissu tumoral. Nous avons développé un optimisé test laboratoire avancés (LDT) qui utilise le concentré 22 3 anticorps (AC) sur un appareil IHC largement disponible pour les spécimens de biopsie et cytologie. Le TPS de PD-L1 a été évalué avec 120 sections appariées ensemble-tumeur tissulaire et des échantillons de biopsie et avec 70 appariés échantillons de biopsie et cytologie (lavages bronchiques, n = 40 ; des épanchements pleuraux, n = 30). Les 22 3 que LDT axée sur le concentré a montré un taux élevé de concordance entre la biopsie (~ 100 %) et de la cytologie des spécimens (~ 95 %) en comparaison avec PD-L1 IHC expression déterminée à l’aide du test de 22 3 compagnon PD-L1 IHC à deux TPS Découpez points (≥ 1 % et ≥ 50 %). La LDT optimisée présentée ici, à l’aide du concentré de Ab 22 3 déterminer l’expression de PD-L1 dans les deux tissus tumoraux et dans les échantillons de cytologie, augmentera la capacité des laboratoires dans le monde entier pour évaluer l’admissibilité des patients atteints de CBNPC pour un traitement par pembrolizumab en monothérapie d’une manière fiable et reproductible.

À l’aide de la procédure présentée ici et comme le décrit en détail dans récentes publications10,11 de ce groupe, la LDT optimisée a été cliniquement validée avec 120 échantillons de biopsie FFPE NSCLC d’archives provenant de patients ayant subi une chirurgie résection ou une biopsie à l’hôpital universitaire de Pasteur, Nice, entre mars 2007 et mars 2016. En outre, pour l’évaluation d’expression PD-L1 des échantillons de cytologi...

Pour développer la capacité des laboratoires dans le monde entier pour évaluer l’admissibilité des patients atteints de cancer du poumon pour un traitement par pembrolizumab, d’une manière fiable et reproductible, nous avons développé un test qui utilise le concentré 22 3 anticorps sur un largement disponible autostainer immunohistochimique, pour les spécimens de biopsie et la cytologie.

Avec 22 3 anticorps Anti-PD-L1 se concentrent sur la biopsie et cytologie échantillons provenant de patients atteints de Cancer de poumon Non à petites cellules

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer ...

Cette méthode utilisant le concentré d’anticorps 22C3 pour déterminer l’expression de PD-L1 dans le tissu de tumeur et le spécimen de cytologie élargira la capacité des laboratoires d’évaluer la sélection des patients présentant le cancer de poumon non-petites cellules pour l’immunothérapie d’une manière fiable et reproductible. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est très concordante avec l’analyse de l’étalon-or et qu’elle prendra en charge des tests PD-L1 fiables et de haute qualité dans toutes les régions du monde. En général, les pathologistes nouveaux à cette méthode auront du mal en raison de la coloration granulaire parfois observée.En outre, la coloration des cellules humaines est un peu plus intense que celle observée avec l’étalon-or. Par conséquent, la formation des pathologistes est nécessaire pour obtenir une interprétation correcte de la coloration PD-L1 avec le LDT 22C3. La démonstration de la procédure sera MmeMarame Hamila, technicienne de mon labo. Pour commencer, fixez le tissu tumoral en formaline tamponnée à 10 % dans une cassette et intégriez la cassette dans la paraffine telle qu’elle est décrite dans le protocole textuel. Intégrer le tissu infiltré à l’intérieur d’un moule rempli de paraffine fondue.Laissez le tissu rester dans le moule jusqu’à ce que la paraffine se soit solidifiée. Après cela, utilisez une microtome pour sectionner le tissu incorporé paraffine à une épaisseur de trois micromètres. Transférer le ruban de paraffine sur une lame de microscope en verre chargée positivement.Ensuite, séchez la glissade pendant une heure à 37 degrés Celsius. Tout d’abord, recueillir les lavages bronchiques dans une solution de conservation. Transférer les lavages dans un tube conique de 50 millilitres.Ajouter deux grammes de DL-Dithiothreitol et vortex le tube pendant 30 minutes, puis centrifugeuse à 250 fois g pendant cinq minutes à température ambiante. Retirer le supernatant et ajouter 10 millilitres d’une solution mucolytique. Agiter l’échantillon à vitesse moyenne pendant 20 minutes et centrifuger à 250 fois g pendant cinq minutes à température ambiante.Après cela, retirez le supernatant et déposez la pastille cellulaire dans un tube de collecte contenant de la formaline tamponnée à 10 %. Ajouter quatre gouttes d’un agent de préparation du bloc cellulaire. Transférer la pastille cellulaire sur une cassette.Fixer la pastille cellulaire pour l’intégration de la paraffine et la sectionnement en utilisant le processus précédemment décrit pour la préparation des échantillons de tissu tumoral. Pour commencer, la puissance sur l’autostainer et l’ordinateur. Double clic sur l’icône autostainer et choisissez l’utilisateur.Cliquez sur Créer l’étiquette, puis sur protocole. Double clic sur le protocole 22C3. Remplissez l’iD du patient et cliquez sur Imprimer.Après cela, coller l’étiquette sur la diapositive. Appuyez sur le bouton sur le tiroir à glissière choisi pour l’ouvrir et placez la glissière étiquetée sur la garniture thermique avec l’étiquette orientée vers le haut et vers l’intérieur. Fermez le tiroir à glissière.Ensuite, retirez les bouchons des distributeurs. Chargez les reagents sur le rack des reagents. Ouvrez le capot du stainer et placez les supports de reagent sur le carrousel des reagents, en vous assurant qu’ils s’adaptent correctement et se tiennent en position, puis fermez le capot.Dans le logiciel, cliquez sur l’instrument qui sera utilisé, puis cliquez sur Exécution. À la fin de la procédure IHC, utilisez l’eau du robinet avec une seule goutte de solution de nettoyage pour rincer la lame pendant plusieurs secondes. Déshydratez la glissière en l’immergeant séquentiellement dans deux bains d’éthanol pendant plusieurs secondes chacun, puis placez la glissière dans une machine à couvrir pour charger automatiquement le glissement du couvercle.Pour commencer à évaluer la qualité de la coloration PD-L1, analyser les contrôles positifs et négatifs avant d’examiner l’échantillon du patient. À l’aide d’un microscope, confirmer la présence d’au moins 100 cellules tumorales viables. À un grossissement bas de 4 fois, évaluez tous les secteurs positifs et négatifs bien préservés de tumeur.Après ceci, marquez la coloration partielle ou complète de membrane cellulaire et calculez le score de proportion de tumeur en évaluant la proportion des cellules tumeurs PD-L1-positives par rapport à toutes les cellules de tumeur présentes dans les secteurs bien préservés de tumeur. Dans cette étude, le score de proportion de tumeur ou TPS est évalué pour des échantillons jumelés de biopsie de tissu dans les blocs de cellules préparés des lavages bronchiques ou des effusions pleurales. Des modèles représentatifs de coloration avec des spécimens de biopsie sont utilisés pour comparer le concentré d’anticorps 22C3 contre l’analyse compagnon PD-L1 IHC 22C3.Le coefficient de corrélation intraclassique, qui est utilisé pour mesurer la corrélation du score TPS en tant que variable continue, est de 99 % entre le LDT et l’étalon-or. Des modèles de coloration représentatifs avec des spécimens de cytologie sont également utilisés pour comparer le concentré d’anticorps 22C3 contre l’analyse compagnon PD-L1 IHC 22C3. Le taux de concordance des échantillons de biopsie et de cytologie avec le LDT est supérieur à 95 % lors de l’utilisation de l’un ou l’autre des points de coupe TPS.Le coefficient de corrélation intraclassique tout en utilisant TPS comme variable continue se situe entre 0,88 et 0,90. Une fois maîtrisée, cette technique donne un taux de concordance élevé avec l’étalon-or dans l’évaluation de la coupure pour la positivité ou l’histologie tumorale pour les échantillons de tissu et de cytologie. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler que les échantillons doivent être évalués en référence à la diapositive HE et dans certains cas difficiles taches complémentaires pour évaluer les cellules immunitaires peuvent être effectuées pour exclure une mauvaise interprétation de l’expression PD-L1 dans les cellules tumorales seulement.Suite à cette procédure, d’autres spécimens comme les biopsies à aiguilles fines, les EUS-FNA ou les brosses bronchiques peuvent être évalués. Après sa mise en place dans les cliniques, la robustesse de l’analyse doit être maintenue au fil du temps en demandant l’accréditation, en suivant les procédures d’exploitation normalisées et en participant régulièrement à des programmes externes d’évaluation de la qualité. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mettre en œuvre le protocole optimisé en utilisant l’anticorps anti-PD-L1 22C3 se concentrer sur un autostainer IHC largement disponible à la fois des échantillons de biopsie et de cytologie de patients atteints d’un cancer du poumon non à petites cellules.

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