Name: In Vitro Formation canine piège extracellulaire neutrophiles : Analyse dynamique et Quantitative par microscopie de Fluorescence (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Découvrez la formation des pièges extracellulaires neutrophiles (NETs) chez le chien par microscopie à fluorescence. Cette méthode permet la visualisation en temps réel et la quantification des NETs et de l'histone H3 citrullinée.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

L’auteur-correspondant a été financé par la Fondation d’Animal de Morris (D15CA-907). L’étude a été financée par des fonds de l’Université de Californie à Davis, centre de santé équine et Center for Companion Animal Health (2016-24-F). Les auteurs aimerait Geena Ng pour son aide avec les chiffres et Nghi Nguyen pour son aide avec la vidéo.

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité de l’urbanisme à l’Université de Californie à Davis et d’institutionnels animalier (protocole numéro : 18338).
1. collecte de sang
<ol><li>Tirer 10 mL de sang soit la veine céphalique ou jugulaire à l’aide d’une aiguille de 21 G par aspiration de la seringue.</li>
	<li>Pour éviter des contraintes de cisaillement excessives, retirer l’aiguille de la seringue avant de transférer le sang dans des tubes contenant de l’héparine de sodium (USP 75). Retourner doucement les tubes plusieurs fois afin d’assurer un mélange adéquat d’anticoagulant et de sang. Recherchez les signes de caillots ou d’agrégats de globules rouges avant de placer les échantillons sur la glace.</li>
</ol>2. neutrophil isolement
<ol><li>Diluer le sang non coagulé avec un volume égal de tampon phosphate salin de glacé Dubecco (SPD) (pH 7,4, sans les cations divalents). Transfert 8 mL de sang dilué dans un tube conique polypropylène de 50 mL contenant 25 mL de dextran de 3 % (à partir de Leuconostoc spp., dissous dans la solution de chlorure de sodium 0,9 %). Disposer le tube debout à température ambiante pendant 30 min permettre l’agrégation et sédimentation des érythrocytes.</li>
	<li>Soigneusement la couche 5 mL de plasma leucocyte-riche (Figure 1) sur le dessus de 5 mL de média gradient de densité dans un tube en polypropylène à fond rond 14 mL. Veillez à ne pas mélanger les 2 solutions11.</li>
	<li>Centrifuger les tubes à 400 x g avec accélération/décélération (A/D) la valeur 0 (pas de frein) pendant 30 min à température ambiante.</li>
	<li>À l’aide de 5 mL pipette sérologique recueillir la couche de cellules de granulocytes en contournant le plasma et les couches de cellules mononucléaires (PBMC) du sang périphérique (Figure 1). Utilisez une nouvelle pipette chaque fois pour minimiser la contamination.</li>
	<li>Dans un tube conique polypropylène 50 mL, placer 4 à 6 mL de la couche de cellules polymorphnuclear (PMN). Car une petite quantité de granulats érythrocytaire peut être aspirée avec la couche PMN, utiliser une pipette sérologique de 1 mL pour retirer délicatement les agrégats d’érythrocytes qui sont réglées au fond du tube.</li>
	<li>Lyse des érythrocytes restants avec 20 mL d’eau ultrapure froid. Retourner doucement le tube plusieurs fois pendant 30 à 60 s pour lyse adéquate avant d’ajouter un volume égal de solution de chlorure de sodium 1,8 % glacée.</li>
	<li>Centrifuger à 112 x g pendant 10 min à 4 ° C, A/D la valeur 0.</li>
	<li>Répétez l’étape de lyse des érythrocytes si ce pellet apparaît rouge. Jeter le surnageant soigneusement avec une pipette sérologique et doucement Resuspendre le culot dans 100 µL de SPD (dextrose 5 mM, 0. 9 mM MgCl2, 1,9 mM CaCl2 et 1 % d’albumine sérique bovine, pH 7,3). Combiner tous les cellules resuspendues et placez sur la glace.</li>
	<li>Effectuer un nombre de cellules à l’aide d’un analyseur de cellules automatisées et vérifier le compteur par un hémocytomètre. Si nécessaire, se concentrer APF sur une lame de verre à l’aide d’un cytocentrifuge (1 000 tr/min, 5 min) et détermine le pourcentage des neutrophiles en comptant le nombre de neutrophiles sur le nombre total de cellules.</li>
	<li>Déterminer la viabilité des neutrophiles en effectuant un test d’exclusion bleu trypan tels que décrits par Strober et al. 12 isolation réussie cède une viabilité de 95 à 100 % et neutrophiles doivent être supérieures à 95 %.</li>
	<li>Déterminer la concentration des neutrophiles en multipliant le nombre total de cellules avec la viabilité pour cent et les neutrophiles pour cent. Réussite de l’isolement devrait produire une concentration de neutrophiles de 1,5 à 6 x 106/ml.</li>
	<li>Diluer les neutrophiles à une concentration finale de 1 x 106/ml avec SPD contenant dextrose 5 mM, 0. 9 mM MgCl2, 1,9 mM CaCl2et 1 % d’albumine sérique bovine avec pH ajusté à 7,3.</li>
</ol>3. fluorescente microscopie des neutrophiles direct
<ol><li>Place de 200 à 400 μL de neutrophiles (1 x 106/ml) dans chaque puits d’une poly-L-lysine enduit plaque de 12 puits de culture. Permettre aux neutrophiles à adhérer au fond des puits en incubant les cellules à 37 ° C pendant 30 min.</li>
	<li>L’étiquette des acides nucléiques avec 1 μM d’un des deux colorants acides nucléiques, celui des taches dans les cellules à membranes intactes et que les taches dans les cellules des membranes semi-perméables (voir Table des matières), pendant 10 min à température ambiante.</li>
	<li>Activer les neutrophiles à lipopolysaccharide (LPS) (e. coli O55 de 100 μg/mL. B5), 100 nM phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) comme contrôle positif, ou un volume équivalent de SPD comme contrôle négatif pendant 180 minutes à 37 ° C.</li>
	<li>Acquisition d’images à l’aide de la GFP (Excitation : 470/22 nm, émission : 525/50 nm) et Texas Red channels (Excitation : 585/29 nm, émission : 628/32 nm) sur une microscopie à fluorescence à un grossissement de X 40 aux points temps suivants : 30, 90, 120 et 180 min.</li>
</ol>4. NET Quantification et détection de composants NET à l’aide d’Immunofluorescence
<ol><li>Placer soigneusement 18 mm diamètre Poly-D-lysine enduite de lamelles dans les puits d’une plaque de 12 puits de culture. Étiqueter correctement les puits.</li>
	<li>Semence 100 à 200 μL d’isolé des neutrophiles (1 x 106/ml) directement sur les lamelles et laissez neutrophiles respecte les lamelles en incubant les cellules à 37 ° C pendant 30 min.</li>
	<li>Activer les neutrophiles comme décrit à la 3.3. Inhiber la formation nette par un pré-traitement des neutrophiles à µΜ 200 Cl-amidine (15 min, 37 ° C) avant l’activation, comme décrit plus haut par Li et al. 13 s’assurer que le contrôle du véhicule approprié (DMSO) est compris dans le test.</li>
	<li>Retirer délicatement les lamelles avec une pince fine. Une feuille de film de paraffine de couche sur un support de tube à essai pour créer des puits peu profonds et mettre 2 à 3 gouttes de 4 % PFA dans chaque puits10. Étiqueter les puits correctement et poser délicatement les lamelles à l’envers sur les puits remplis de PFA. Permettre aux cellules qui sera fixée à température ambiante pendant 20 min.</li>
	<li>Laver les cellules 3 fois au SPD pendant 5 min, en les déplaçant d’un puits à l’autre.</li>
	<li>Si immunomarquage ne peut pas être effectuée peu de temps après la fixation et l’activation neutrophile, permettent de lamelles d’être séchés en plaçant le lamelles face vers le haut sur un morceau de papier de l’absorbance à l’air. Lamelles peut être conservés pendant jusqu'à 1 semaine face vers le haut dans une plaque de culture de 12 puits marqué à 4 ° C jusqu'à l’analyse plus loin. Laver les cellules 3 fois au SPD pendant 1 min, utilisant la même technique, comme décrit dans 4.4 avant de passer à l’étape suivante.</li>
	<li>Pour permeabilize des cellules, poser délicatement la lamelle couvre-objet à l’envers sur une baisse de 1 %, NP-40 pour 1 min en utilisant la technique décrite en 4.4. Laver 3 fois au SPD pendant 1 min sur un rocker.</li>
	<li>Au hasard affecter chaque échantillon à un certain nombre et utiliser un marqueur de point de diamant pour étiqueter les lamelles en conséquence.</li>
	<li>Préparer et étiquette individuelle Pétri bordée de film de paraffine et la place de 100 à 200 μL de sérum de chèvre de 5 % sur le film (tampon de blocage). Poser les lamelles à l’envers sur le tampon de blocage. Placer sur une bascule et incuber pendant 1 heure à 37 ° C.</li>
	<li>Laver 3 fois au SPD pendant 5 min sur un rocker.</li>
	<li>Diluer l’anticorps primaire (histone de 1 : 400 lapin polyclonal anti-citrullinés H3 (citH3) à 5 % de sérum de chèvre). Incuber les cellules marquées Pétri bordée de film de paraffine. Poser chaque lamelle couvre-objet à l’envers sur 50 à 100 μL de la solution diluée d’anticorps. Placer sur une bascule et incuber pendant 1 heure à 37° C.</li>
	<li>Laver 3 fois au SPD pendant 5 min sur un rocker.</li>
	<li>Anticorps secondaire dilué conjugué à un fluorophore (1 : 200) dans le sérum de chèvre de 5 %. Incuber les cellules marquées Pétri bordée de film de paraffine. Poser chaque lamelle couvre-objet à l’envers sur 50 à 100 μL de la solution diluée d’anticorps. Sur une base berçante et incuber 1 h à 37 ° C dans l’obscurité.</li>
	<li>Laver 3 fois au SPD pendant 5 min sur une bascule dans l’obscurité.</li>
	<li>Pour la détection simultanée de la myéloperoxydase (MPO), suivez les étapes suivantes pour un protocole modifié immunomarquage double telle que décrite par Li et al. 13
</li>
	<li>Incuber les cellules marquées Pétri bordée de film de paraffine. Poser chaque lamelle couvre-objet à l’envers sur 100 à 200 μL de lapin de 10 % sérum sous le doux balancement (une nuit ou plus, 4 ° C, dans l’obscurité).</li>
	<li>Laver 3 fois au SPD pendant 5 min sur une bascule dans l’obscurité.</li>
	<li>Incuber les cellules chez les caprins non conjuguée de 50 μg/mL des fragments Fab anti-lapin pendant 2 h à température ambiante sur une bascule dans l’obscurité.</li>
	<li>Laver 3 fois au SPD pendant 5 min sur une bascule dans l’obscurité.</li>
	<li>Diluer l’anticorps primaire (1 : 200 lapin anti-humain MPO anticorps polyclonal) dans le sérum de chèvre de 5 %. Incuber les cellules marquées Pétri bordée de film de paraffine. Poser chaque lamelle couvre-objet à l’envers sur 50 à 100 μL de la solution diluée d’anticorps. Sur une base berçante et incuber 1 h à 37° C dans l’obscurité.</li>
	<li>Diluer l’anticorps secondaire conjugué à un fluorophore dans 5 % de sérum de chèvre et incuber tel que décrit dans 4,8</li>
	<li>Laver 3 fois au SPD pendant 5 min sur une bascule dans l’obscurité.</li>
	<li>Contrôles d’interférence doivent être préparés par l’exclusion d’incubation avec deux anticorps primaires dans la deuxième étape pour le label immunitaire.</li>
	<li>Tache d’ADN avec 300 nM de 4', 6-Diamidion-2-phénylindole, dichlorhydrate (DAPI) pendant 5 min dans l’obscurité à température ambiante.</li>
	<li>Laver 3 fois au SPD pendant 1 min sur une bascule dans l’obscurité.</li>
	<li>Appliquez une goutte (~ 50 μl) d’antifade mountant sur une lame de verre. Tapotez doucement le bord de la lamelle sur un papier absorbant pour enlever l’excès de tampon avant de monter la lamelle avec les cellules à l’envers. Le milieu de montage doit former une fine couche entre la lamelle et la lame de verre. Pour enlever les bulles d’air, appuyez très légèrement sur la lamelle couvre-objet avec une pince fine.</li>
	<li>Laisser les échantillons guérir du jour au lendemain dans l’obscurité à 4 ° C. Le milieu de montage devrait durcir pendant l’analyse au microscope avec des lentilles d’immersion. Conserver les échantillons à 4 ° C dans l’obscurité.</li>
</ol>5. neutrophiles piège extracellulaire Quantification
<ol><li>L’ou les opérateurs acquisition et l’analyse des images de microscope pour les conditions expérimentales de l’aveugle.</li>
	<li>À l’aide d’un microscope à fluorescence avec grossissement de 40 X, prendre 10 images au hasard des différentes régions de chaque lamelle lors d’une expérience dans les canaux. S’assurer que la durée d’exposition, la luminosité et le contraste de chaque canal sont cohérentes au cours de l’acquisition d’images.</li>
	<li>Analyser les images à l’aide de logiciels disponibles comme ImageJ (NIH). Identifier les filets basés sur la co-localisation de cfDNA, de citH3 et de MPO (Figure 3 a, B). Quantifier le nombre de filets et de neutrophiles dans 10 champs aléatoires pour chaque condition expérimentale. Nombres de filets libéré peut être exprimées sous forme de ratio (nombre de filets : nombre de neutrophiles) pour chaque condition expérimentale.</li>
	<li>Pour évaluer les effets du traitement sur l’expression citH3 intracellulaire, compter le nombre de neutrophiles à citH3 intracellulaire et le nombre de neutrophiles sans citH3 intracellulaires dans 10 champs au grossissement de X 40 sous les canaux ( Figure 3, flèches rouges). Expression citH3 intracellulaire peut être exprimée comme le ratio du nombre de neutrophiles à intracellulaire citH3 au nombre de neutrophiles sans citH3 intracellulaires.</li>
</ol>

<ol><li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+and+immunity%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).</li>
<li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beneficial+suicide%3A+why+neutrophils+die%2C+to+make+NETs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Beneficial suicide: why neutrophils die, to make NETs.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).</li>
<li>Kaplan, M. J., Radic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+Double-edged+swords+of+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: Double-edged swords of innate immunity.</a> The Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).</li>
<li>Czaikoski, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Extracellular+Traps+Induce+Organ+Damage+during+Experimental+and+Clinical+Sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Extracellular Traps Induce Organ Damage during Experimental and Clinical Sepsis.</a> PLoS One. 11 (2), e0148142(2016).</li>
<li>Dwivedi, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+utility+and+characterization+of+cell-free+DNA+in+patients+with+severe+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Prognostic utility and characterization of cell-free DNA in patients with severe sepsis.</a> Critical Care. 16 (4), R151(2012).</li>
<li>Mai, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+but+not+Early+Treatment+with+DNase+Reduces+Organ+Damage+and+Improves+Outcome+in+a+Murine+Model+of+Sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Delayed but not Early Treatment with DNase Reduces Organ Damage and Improves Outcome in a Murine Model of Sepsis.</a> Shock. 44 (2), 166-172 (2015).</li>
<li>Jeffery, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dogs+cast+NETs+too%3A+Canine+neutrophil+extracellular+traps+in+health+and+immune-mediated+hemolytic+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Immunology+and+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia.</a> Veterinary Immunology and Immunopathology. 168 (3-4), 262-268 (2015).</li>
<li>Letendre, J. A., Goggs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+plasma+cell-free+DNA+concentrations+in+dogs+with+sepsis%2C+trauma%2C+and+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Emergency+and+Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Measurement of plasma cell-free DNA concentrations in dogs with sepsis, trauma, and neoplasia.</a> Journal of Veterinary Emergency and Critical Care. 27 (3), 307-314 (2017).</li>
<li>Jeffery, U., Gray, R. D., LeVine, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Fluorescence+Assay+for+Quantification+of+Canine+Neutrophil+Extracellular+Trap+Release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release.</a> J Vis Exp. (117), (2016).</li>
<li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+how+to+generate+and+visualize+them%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> Journal of Visualized Experiments. (36), (2010).</li>
<li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+isolation+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Neutrophil isolation protocol.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+Blue+Exclusion+Test+of+Cell+Viability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, (2015).</li>
<li>Li, R. H. L., Ng, G., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-induced+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+canine+neutrophils+is+dependent+on+histone+H3+citrullination+by+peptidylarginine+deiminase%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Immunology+and+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-induced neutrophil extracellular trap formation in canine neutrophils is dependent on histone H3 citrullination by peptidylarginine deiminase.</a> Veterinary Immunology and Immunopathology. 193, 29-37 (2017).</li>
<li>Masuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NETosis+markers%3A+Quest+for+specific%2C+objective%2C+and+quantitative+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers.</a> Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).</li>
<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAD4+is+essential+for+antibacterial+innate+immunity+mediated+by+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).</li>
<li>Leshner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAD4+mediated+histone+hypercitrullination+induces+heterochromatin+decondensation+and+chromatin+unfolding+to+form+neutrophil+extracellular+trap-like+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">PAD4 mediated histone hypercitrullination induces heterochromatin decondensation and chromatin unfolding to form neutrophil extracellular trap-like structures.</a> Frontiers in Immunology. 3, 307(2012).</li>
<li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+and+inactivators+of+protein+arginine+deiminase+4%3A+functional+and+structural+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization.</a> Biochemistry. 45 (39), 11727-11736 (2006).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous présentons ici un protocole afin d’observer les changements de noyaux conformation et cfDNA l’échappement vie canine neutrophiles en utilisant un colorant perméants de cellule et un colorant imperméants de la cellule. Le principal avantage de ce test, c’est qu’elle permet une détection en temps réel de formation nette par microscopie à haute résolution dans les neutrophiles direct sans fixation de la cellule, par conséquent, fournir un outil simple et utile pour l’observation in vitro la formation nette. Ét...

Les neutrophiles sont des granulocytes éphémères chargés de la défense initiale contre l’invasion des agents pathogènes. Neutrophiles, recrutés au site d’infection, éliminent les micro-organismes par phagocytose, dégranulation et génération de réactives de l’oxygène (DRO)1. En présence de bactéries ou d’endotoxines, neutrophiles libération neutrophiles extracellulaire pièges (filets), composé de chromatine extracellulaire orné de histones et des protéines granulaires comme l’élastase et contre la myéloperoxydase (FTU)2. Bien que les filets ont des propriétés antimicrobiennes indispensables, augmentant les preuves expérimentales et cliniques suggère que trop zélée formation nette au cours de l’infection peut conduire à plusieurs organes dysfonction et la mort3,4, 5 , 6.
Parce que les filets peuvent jouer un rôle physiopathologique similaire chez les chiens, les interventions thérapeutiques qui empêchent ou diminuent la formation nette peuvent servir de stratégies de nouveaux traitements chez les animaux de la fosse septique. Pour cette raison, il y a un besoin pour une technique fiable évaluer et quantifier des NETosis et des composantes nettes chez les chiens. Composantes nettes y compris ADN acellulaire (cfDNA) et les nucléosomes précédemment ont été évalués que dans les neutrophiles canines et le plasma chiens clinique7,8,9. Utilisant la fluorescence, Goggs et Letendre trouvent que septiques chiens ont des niveaux plus élevés de cfDNA que des chiens en bonne santé8. Bien que ces techniques soient très objective et quantitative, mesure des cfDNA et des nucléosomes comme marqueurs de NETosis est non spécifique car elles peuvent être dérivées de cellules nécrotiques, autres que les neutrophiles NETosing. Nous décrivons ici une technique qui utilise la microscopie de fluorescence pour étudier les comportements des vivants NETosing neutrophiles. Nous détaillons également un protocole modifié à l’aide de double-immunomarquage à quantifier subjectivement les filets et leurs composants tels que le MPO et citH3 dans les neutrophiles canine10.

<table><tbody><tr><td>Dextran de Leuconostoc spp.</td><td>Sigma</td><td>31392</td><td>Poids moléculaire 450 000 &ndash ; 650 000</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Life Sciences</td><td>17144002</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Saline tamponnée au phosphate</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific A1285801</td><td>avec cations divalents</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Saline tamponnée au phosphate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190136</td><td>Sans cations divalents</td></tr><tr><td>E. coli O55 :B5</td><td>InvivoGen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Orange Fluorescent Nucleic Acid Stain</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11368</td><td>5 mM dans le DMSO ; colorants dans les cellules à membrane perméable</td></tr><tr><td>SYTO Green 16 Fluorescent Nucleic Acid Stain</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S7578</td><td>1 mM dans le DMSO ; colorants dans les cellules avec</td></tr><tr><td>membranes intactes Surface-Amps NP-40</td><td>Pierce</td><td>28324</td><td></td></tr><tr><td>Lamelles enrobées de poly-D-Lysine</td><td>neuVitro</td><td>H-12-pdl</td><td>12 mm de diamètre</td></tr><tr><td>Anticorps anti-histone H3 citrullinée</td><td>Abcam</td><td>Ab5103</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre non conjuguée anti-lapin Fragments Fab</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-007-003</td><td>Spécificité : IgG (H+L)</td></tr><tr><td>Anticorps anti-myéloperoxydase</td><td>Dako</td><td>A0398</td><td></td></tr><tr><td>4,6-Diamidino-2-phényline (DAPI)</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>D1306</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro formation canine piège extracellulaire neutrophiles : analyse dynamique et quantitative par microscopie de fluorescence

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

En réponse à l’invasion de pathogènes, neutrophiles libèrent les pièges extracellulaires neutrophiles (filets), qui sont des réseaux extracellulaires d’ADN orné d’histones et des protéines antimicrobiennes. La formation nette excessive (NETosis) et citH3 communiqué au cours d’une septicémie est associé avec multiples dysfonctionnement organique et mortalité chez les souris et les humains, mais ses conséquences chez les chiens sont inconnus. Ici, nous décrivons une technique pour isoler les neutrophiles canines du sang total pour l’observation et quantification des NETosis. Plasma leucocyte-riche, générée par la sédimentation de dextran, est séparée par les médias de séparation gradient de densité disponible dans le commerce et granulocytes recueillis pour comte et le contrôle de viabilité des cellules. Pour observer en temps réel NETosis neutrophiles direct, cellule perméant et taches imperméants fluorescents des acides nucléiques cellulaires sont ajoutés à neutrophiles activés par lipopolysaccharide (LPS) ou phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA). Changements dans la morphologie nucléaire et de la formation nette sont observées au fil du temps par microscopie à fluorescence. In vitro NETosis se caractérise davantage par co-co-localisation d’ADN de cellules libres (cfDNA), contre la myéloperoxydase (MPO) et citrullinés histone H3 (citH3) à l’aide d’un protocole modifié de double-immunomarquage. Afin de quantifier objectivement formation nette et citH3 expression à l’aide de la microscopie en fluorescence, filets et cellules citH3-positives sont quantifiés de façon aveugle à l’aide de logiciels disponibles. Cette technique est un dosage spécifique pour évaluer la capacité in vitro des neutrophiles canines à subir une NETosis.

Utilisant ce protocole d’imagerie de cellules vivantes, les enquêteurs peuvent observer la morphologie nucléaire, l’intégrité de la membrane plasmique et la présence de cfDNA vie des neutrophiles. Un colorant nucléaire imperméants cellule taches acides noyaux rouges dans les cellules des membranes de cellules endommagées. Un autre colorant cellulaire perméable, étiquettes intracellulaire des acides nucléiques dans des cellules vivantes avec des membranes de plasma. Tous les neutrophiles i...

Nous décrivons des méthodes pour isoler canines neutrophiles du sang total et de visualiser la formation nette des neutrophiles vivants à l’aide de la microscopie de fluorescence. Également décrites sont des protocoles pour quantifier la formation nette et citrullinés histone H3 (citH3) expression à l’aide de la microscopie par immunofluorescence.

In Vitro Formation canine piège extracellulaire neutrophiles : Analyse dynamique et Quantitative par microscopie de Fluorescence

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Cette méthode peut répondre à des questions clés sur le piège extracellulaire des neutrophiles ou la formation de TNE chez le chien ou d’autres espèces. Les principaux avantages de ces techniques comprennent la détection en direct de la formation de TNE et l’identification de composants de TNE comme la peroxydase légère et l’histone H3 citrullinée. Commencez par prélever 10 à 20 millilitres de sang dans la veine jugulaire d’un donneur canin sain, en retirant l’aiguille de la seringue avant de distribuer le sang dans des tubes d’héparine de sodium pour éviter un partage excessif. Retournez doucement les tubes à quelques reprises pour assurer un mélange adéquat du sang et de l’anticoagulant, et vérifiez la présence de caillots et d’agrégats de globules rouges avant de placer les échantillons sur de la glace.Diluez le sang anticoagulé avec un volume égal de PBS Dulbecco glacé et transférez huit millilitres de sang dilué dans un tube conique en polypropylène de 50 millilitres contenant 25 millilitres de Dextran filtré à 3 %. Placez le tube à la verticale pendant 30 minutes à température ambiante pour permettre l’agrégation et la sédimentation des érythrocytes. Ensuite, superposez soigneusement cinq millilitres de plasma riche en leucocytes sur cinq millilitres de milieu à gradient de densité dans un tube à fond rond en polypropylène de 14 millilitres.Après la centrifugation par gradient de densité, utilisez une pipette sérologique de cinq millilitres pour transférer la couche intermédiaire de cellules granulocytaires en cône de 50 millilitres, et lysez tous les érythrocytes co-aspirés avec les cellules polymorphonucléaires avec 20 millilitres d’eau froide et ultra-pure. Retournez doucement le tube pendant 30 à 60 secondes pour assurer une lyse adéquate avant de laver les cellules dans un volume égal de solution glacée de chlorure de sodium à 1,8 %. Après avoir inversé le tube plusieurs fois, centrifugez-le à quatre degrés Celsius.À l’aide d’une pipette sérologique, retirez soigneusement le surnageant et remettez doucement la pastille en suspension dans 100 microlitres de tampon de culture cellulaire. Compter et confirmer leur viabilité par exclusion du bleu trypan. Diluez ensuite les neutrophiles à un fois dix à six cellules par millilitre de concentration de tampon de culture cellulaire.Il est essentiel d’utiliser une technique stérile appropriée et de manipuler les neutrophiles avec soin tout au long du processus d’isolement, car la contamination et les forces de cisaillement peuvent entraîner une nécrose in vitro et une lyse cellulaire. Pour imager les neutrophiles par microscopie à fluorescence, ajoutez 200 à 400 microlitres de cellules dans chaque puits d’une plaque de culture à 12 puits recouverte de poly-L-lysine pour une incubation de 30 minutes à 37 degrés Celsius. Lorsque les neutrophiles se sont fixés au fond des puits, étiquetez les cellules avec un colorant d’acide nucléique fluorescent approprié pendant 10 minutes à température ambiante.À la fin de l’incubation, activez les neutrophiles avec 100 microgrammes par millilitre de LPS, 100 nanomolaires de PMA comme contrôle positif, ou un volume équivalent de tampon de culture cellulaire comme témoin négatif à 37 degrés Celsius. Ensuite, imagez les cultures de neutrophiles par microscopie à fluorescence à un grossissement de 40 fois aux points temporels indiqués. Pour une quantification nette, placez soigneusement des lamelles enrobées de poly-D-lysine de 18 millimètres de diamètre dans des puits individuels d’une plaque de culture à 12 puits et étiquetez les puits en fonction du stimulus expérimental.Ensuite, ensemencez 100 à 200 microlitres de neutrophiles isolés directement sur les lamelles pour une incubation de 30 minutes à 37 degrés Celsius. Lorsque les neutrophiles ont adhéré aux lamelles, activez les neutrophiles dans chaque puits avec du LPS, du PMA ou du DPBS pendant 180 minutes, comme nous venons de le démontrer. Pendant les 30 dernières minutes de l’incubation, superposez une feuille de film de paraffine sur un support de tube à essai pour créer des puits peu profonds, et ajoutez deux à trois gouttes de paraformaldéhyde à 4 % dans chaque puits.Étiquetez les puits selon les méthodes expérimentales appropriées et utilisez des pinces fines pour transférer doucement les lamelles de chaque plaque bien à l’envers sur le puits approprié rempli de PFA. Après 20 minutes à température ambiante, laver les cellules fixes trois fois pendant cinq minutes dans deux à trois gouttes de solution saline tamponnée par lavage en déplaçant les cellules d’un puits de DPBS à l’autre. Pour perméabiliser les cellules, posez doucement les lamelles à l’envers sur une goutte de NP-40 à 1 % pendant une minute, suivie de trois lavages salins tamponnés d’une minute sur une bascule.Après le dernier lavage, placez les lamelles à l’envers dans 100 à 200 microlitres de sérum de chèvre à 5 % dans des boîtes de Pétri étiquetées individuellement et recouvertes d’un film de paraffine en plastique frais pour une incubation d’une heure à 37 degrés Celsius avec balancement. À la fin de l’incubation de blocage, laver les lamelles trois fois dans une solution saline tamponnée avec balancement comme je viens de le démontrer. Transférez les lamelles dans des boîtes de Pétri individuelles doublées d’un film de paraffine dans 50 à 100 microlitres de l’anticorps d’intérêt approprié pour une incubation d’une heure à 37 degrés Celsius avec balancement.Après le lavage, incubez les lamelles avec l’anticorps secondaire conjugué au fluorophore approprié pendant une heure à 37 degrés Celsius à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation secondaire de l’anticorps, laver les lamelles trois fois dans une solution saline tamponnée à l’obscurité avec un balancement, suivie d’une coloration à l’acide nucléique avec du DAPI pendant cinq minutes dans l’obscurité à température ambiante. Après trois lavages salins tamponnés d’une minute dans l’obscurité avec balancement, appliquez une goutte de 50 microlitres de milieu de montage anti-décoloration sur une lame de verre par échantillon, et montez soigneusement chaque lamelle séchée à l’envers sur une goutte de milieu de montage.Laissez ensuite les échantillons durcir pendant la nuit à quatre degrés Celsius à l’abri de la lumière. Le lendemain matin, obtenez 10 images au hasard à partir de différentes régions de chaque lamelle à un grossissement de 40 fois. Tous les neutrophiles intacts, quel que soit le traitement, doivent apparaître en vert et présenter les noyaux lobulés caractéristiques de zéro à 30 minutes après la stimulation.À environ 90 minutes, les noyaux des neutrophiles traités par PMA commencent à perdre leur aspect lobulé et continuent à se décondenser jusqu’à la libération d’ADN acellulaire. Le LPS, un stimulant plus lent et plus physiologique des neutrophiles canins, n’entraîne généralement pas de décondensation de la chromatine ou de NETosis avant 90 minutes après la stimulation. Au bout de 120 minutes, les neutrophiles activés par le LPS et le PMA sont entourés d’ADN acellulaire.Par rapport aux cellules stimulées par le LPS, un plus grand nombre de neutrophiles activés par la PMA perdent l’intégrité de leur membrane plasmique, comme en témoigne leur coloration avec un colorant imperméable aux cellules. Les neutrophiles non stimulés doivent conserver leurs noyaux lobulés et leurs membranes plasmiques intactes tout au long de la période d’incubation. Les neutrophiles, stimulés par le LPS pendant 180 minutes, produisent des échafaudages discrets en forme de toile à proximité des neutrophiles voisins.En revanche, les neutrophiles activés par PMA produisent de grandes quantités de TNE dont la surface est nettement plus grande. En effet, la PMA, un puissant stimulant d’une enzyme qui catalyse l’histone H3, composant essentiel des TNET, induit un nombre plus élevé de cellules exprimant l’histone H3 citrullinée intracellulaire par rapport aux neutrophiles non stimulés et stimulés par le LPS. Lors de la réalisation de ce test, il est extrêmement important que l’opérateur qui acquiert et analyse les images du microscope soit à l’insu des conditions expérimentales afin de maintenir une évaluation objective du test.La moitié de ces procédures ont leurs tests, comme l’ELISA ou la cytométrie en flux, peuvent être effectués pour quantifier davantage l’histone H3 citrullinée dans les cellules. N’oubliez pas d’inclure des témoins négatifs constitués de neutrophiles non stimulés ou de neutrophiles traités avec l’inhibiteur de la peptidylarginine, la chrolide amidine. Nous recommandons également de tester différentes dilutions d’anticorps primaires et secondaires afin de minimiser les liaisons et les interférences non spécifiques.

in-vitro-canine-neutrophil-extracellular-trap-formation-dynamic

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Neutrophiles pièges extracellulaires (NET) sont un important mécanisme immunitaire inné pour combattre les bactéries pathogènes, champignons et parasites. Nous décrivons ici les méthodes d'isoler granulocytes neutrophiles dans le sang humain et de les activer pour former NET. Nous présentons les techniques de préparation de visualiser NET en microscopie optique et électronique.

Neutrophiles pièges extracellulaires: Comment générer et de les visualiser

Cette vidéo montre l’induction et la visualisation de pièges extracellulaires de neutrophiles ou TNE dans des neutrophiles pré-marqués à l’aide de sérum de patient contenant des anticorps cytoplasmiques anti-neutrophiles. De plus, l’utilisation d’un colorant d’ADN imperméable et la microscopie à fluorescence permettent de visualiser les TNE.

Induction et visualisation de pièges extracellulaires de neutrophiles dans des neutrophiles pré-marqués

pièges extracellulaires neutrophiles (TNE) sont des réseaux d'ADN, les histones et les protéines de neutrophiles. Bien qu'une composante de la réponse immunitaire innée, TNE sont impliqués dans l'auto-immunité et de la thrombose. Ce protocole décrit une méthode simple pour l'isolement des cellules neutrophiles canins et la quantification de TNE en utilisant un dosage de fluorescence de microplaque.

A Fluorescence Assay simple pour Quantification de Canine neutrophiles extracellulaires Piège sortie

Ici, nous présentons un protocole pour générer des pièges extracellulaires neutrophiles (NET) et l'exploitation de NETQUANT, une option logicielle entièrement automatique pour la quantification des NET dans les images d'immunofluorescence.

Quantification automatisée basée sur l'image des pièges extracellulaires neutrophiles à l'aide de NETQUANT

Ce protocole décrit un dosage très sensible et très haut débit de neutrophiles piège extracellulaire (NET) pour la quantification semi-automatisé des ex vivo NET formation par microscopie confocale tridimensionnelle par immunofluorescence. Ce protocole peut être utilisé pour évaluer la formation nette et dégradation après différents stimuli et peut être utilisé pour l’étude des thérapies potentielles axés sur le NET.

Un test haut débit pour évaluer et quantifier les neutrophiles piège extracellulaire Formation

Les pièges extracellulaires de Neutrophile (NET) sont des structures tridimensionnelles produites par les granulocytes neutrophiles stimulés. Il est devenu clair ces dernières années que les ENe sont impliqués dans une grande variété de maladies. La détection des EAE dans les tissus peut avoir une pertinence diagnostique, de sorte que des protocoles normalisés pour l'étiquetage des composants NET sont nécessaires.

Immunofluorescence Étiquetage des pièges extracellulaires de l'homme et de la murine Neutrophil dans les tissus paraffins

Nous décrivons une méthode pour identifier les pièges extracellulaires neutrophiles (NET) dans le formaldéhyde-fixe et paraffin-intégré thrombi cardiogénique félin utilisant la récupération d’antigène induite par la chaleur et un protocole d’immunolabeling double.

Identification des pièges extracellulaires Neutrophil dans paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi à l’aide de la microscopie à l’immunofluorescence

Un protocole pour l’induction et l’analyse de pièges extracellulaires (TNE) in vitro est présenté. La quantification de l’ADN, de la cathélicidine (LL37) et de l’activité enzymatique a fourni des données qui montrent la variabilité de la composition et de la morphologie des TNE induites par des stimuli microbiens et chimiques dans des conditions contrôlées similaires.

Analyse morphologique et compositionnelle des pièges extracellulaires neutrophiles induits par des stimuli microbiens et chimiques

Les pièges extracellulaires neutrophiles (TNE) sont associés à diverses maladies, et l’immunofluorescence est souvent utilisée pour leur visualisation. Cependant, il existe différents protocoles de coloration et, dans de nombreux cas, un seul type de tissu est examiné. Ici, nous établissons un protocole d’application générale pour la coloration des TNE dans les tissus de souris et d’humains.

Imagerie par immunofluorescence des pièges extracellulaires des neutrophiles dans les tissus humains et murins

Nous présentons une méthode automatisée à haut débit pour quantifier les pièges extracellulaires (TNE) de neutrophiles en utilisant le système d’analyse de cellules vivantes, couplée à une approche à double colorant dépendant de la perméabilité membranaire.

Technique à haut débit en temps réel pour quantifier la formation de pièges extracellulaires à neutrophiles dans les neutrophiles humains

Ce protocole définit une approche de microscopie à haut débit en temps réel pour visualiser et quantifier la libération de pièges extracellulaires (TNE) de neutrophiles humains in vitro. La méthode reproductible permet d’étudier les caractéristiques et la cinétique de la libération de TNE lors de la stimulation avec des inducteurs de NETosis distincts et permet d’évaluer la pharmacologie des antagonistes de NETosis.

Quantification microscopique en temps réel et à haut débit de la libération de pièges extracellulaires de neutrophiles humains et évaluation de la pharmacologie des antagonistes

Découvrez la formation des pièges extracellulaires neutrophiles (NETs) chez le chien par microscopie à fluorescence. Cette méthode permet la visualisation en temps réel et la quantification des NETs et de l'histone H3 citrullinée.

In Vitro Formation canine piège extracellulaire neutrophiles : Analyse dynamique et Quantitative par microscopie de Fluorescence (Vidéo) | JoVE Journal

In Vitro Formation canine piège extracellulaire neutrophiles : Analyse dynamique et Quantitative par microscopie de Fluorescence

Explorer plus de vidéos