Name: Isolement, caractérisation et axée sur les micro-ARN de la Modification génétique des cellules souches humaines follicule dentaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Découvrez l'ingénierie génétique transitoire des cellules souches du follicule dentaire humain par introduction de microARN. Cette méthode non virale améliore les propriétés thérapeutiques sans intégration génomique stable.

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Ce travail a été soutenu par le programme FORUN de l’Université de Rostock Medical Centre (889018) et la Fondation humide (2016-11). En outre, h. et R.D. sont pris en charge par le BMBF (VIP + 00240).

HDFSCs sont isolées des follicules dentaires des dents de sagesse extraites fournies par le ministère d’orale et maxillo-faciale chirurgie plastique du centre médical de l’Université de Rostock. Consentement et autorisation écrite a été obtenue chez tous les patients. Cette étude a été autorisée par le Comité local d’éthique de l’Université de Rostock (autorisation No. A 2017-0158).
1. isolement de hDFSCs
Remarque : Pour éviter la contamination bactérienne, dents de sagesse ne devrait pas être éclatés avant extraction
<ol><li>
Préparation de solutions requises
	<ol>
<li>Préparer une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) / solution de pénicilline-streptomycine-Glutamine (P-S-G) : mélanger 495 mL de PBS avec 5 mL de solution de P-S-G. Stocker les aliquotes de 50 mL à 4 ° C.</li>
		<li>Préparer le milieu de culture hDFSC : mélanger 445 mL du milieu basal avec 5 mL d’agent antibiotique et 50 mL de sérum fœtal (SVF). Conserver à 4 ° C.</li>
		<li>Type de collagénase de préparer je stock solution (30 mg/mL) : diluer 300 mg de type collagénase I dans 10 mL de milieu de base additionné de 1 % agent antibiotique. Mélanger vigoureusement la solution. Filtrer la solution à l’aide d’un filtre de 0,2 µm. Magasin aliquotes de 500 µL de collagénase de type I solution stock à-20 ° C.</li>
		<li>Préparer la solution mère a II (40 mg/mL) : diluer 40 mg de II a dans 10 mL de milieu de base additionné de 1 % agent antibiotique. Mélanger vigoureusement la solution. Filtrer la solution à l’aide d’un filtre de 0,2 µm. Stocker les aliquotes de 500 µL de solution-mère a II à-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Intervention chirurgicale
	<ol>
<li>Injecter une quantité suffisante (maximum : 2 mL) d’anesthésique local.</li>
		<li>Créer et élever un lambeau de mucoperiosteal à trois lobes. Soulevant un rabat lingual n’est pas nécessaire.</li>
		<li>Protéger l’aspect multilingue avec un ascenseur périoste.</li>
		<li>Doucement mill osseuse vestibulaire et distale avec un rond burr métal dur.</li>
		<li>Desserrer le tissu du follicule avec un ascenseur périoste. Retirez soigneusement les dents (le germe) et follicule en tirant la Couronne (et follicule) avec postérieures forceps (tiers-molaire).</li>
		<li>Débrider et irriguer la prise soigneusement avec une solution NaCl.</li>
		<li>Remplacez le rabat mucoperiosteal par sutures vicryl (voir Table des matières).</li>
		<li>Retirez le follicule de la dent de la cavité buccale et rangez-les dans une partie aliquote de 50 mL de solution de PBS/P-S-G. Remarque : L’échantillon peut être stocké à 4 ° C jusqu'à ce que la poursuite de la procédure.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Digestion enzymatique du follicule dentaire
	<ol>
<li>Milieu de culture hDFSC Préchauffez et PBS/P-S-G de la solution à température ambiante (RT).</li>
		<li>Décongeler une aliquote de chaque type de collagénase I et a II solutions stocks. Préparer une solution de digestion de collagénase de type 3 mg/mL I et 4 mg/mL a II en ajoutant 500 µL de chaque collagénase de type I et solution-mère à 4 mL de basale moyenne contenant 1 % agent antibiotique a II.</li>
		<li>Placez le follicule extrait dans une boîte de Petri stérile et ajouter 10 mL de solution de PBS/P-S-G pour laver les tissus extraits. Répétez cette étape de laver deux fois.</li>
		<li>Émincer le follicule extrait en morceaux d’environ 1 mm x 1 mm avec un scalpel stérile dans la boîte de Pétri contenant 10 mL de solution de PBS/P-S-G.</li>
		<li>Transfert en tissu haché et solution de PBS/P-S-G de la boîte de Pétri dans un tube à centrifuger conique 50 mL. Laver le plat de Pétri avec 10 mL de solution de PBS/P-S-G et transvaser la solution dans le même tube.</li>
		<li>Centrifuger le tube à centrifuger conique pendant 10 min à 353 x g à RT et éliminer le surnageant.</li>
		<li>Ajouter 5 mL de solution de digestion du même tissu. Mélanger délicatement la solution et le tissu. Incuber à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 2 h dans un incubateur à agitation mélange.</li>
		<li>Centrifugeuse digéré la suspension cellulaire/tissulaire à 353 x g pendant 10 min à RT. jeter le surnageant et Resuspendre le culot obtenu en 6 mL de milieu de culture hDFSC.</li>
		<li>Suspension de cellules de graines dans un 25 cm2 flacon de culture de cellules et incuber les cellules à 37 ° C, 5 % de CO2 et 20 % O2. Remarque : Si le tissu n’est pas complètement digéré, transférer le tissu restant à ainsi le flacon de culture cellulaire.</li>
		<li>Changer support soigneusement 24h après l’ensemencement de la cellule. Changez ensuite le milieu tous les trois jours jusqu'à la confluence. Remarque : HDFSCs doivent être plastique-adhérent 24 h après l’ensemencement de la cellule et se distingues des cellules non adhérentes et des composants sanguins en changeant simplement le milieu.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Récolte des cellules
	<ol>
<li>Préchauffer le milieu de culture hDFSC, solution de PBS/P-S-G et la trypsine/éthylènediaminetétraacétique solution d’acide (EDTA) RT.</li>
		<li>Jeter le surnageant du flacon de culture et laver les cellules confluentes avec 5 mL de solution de PBS/P-S-G.</li>
		<li>Ajouter 1 mL de solution de trypsine/EDTA dans le flacon de culture et incuber pendant 3 min à 37 ° C. Arrêter le processus de digestion en ajoutant 3 mL de milieu de culture de hDFSC dans le flacon de culture.</li>
		<li>Transfert dans un tube à centrifuger conique 15 mL de suspension cellulaire et centrifuger la suspension pendant 10 min à 353 x g à RT. jeter le surnageant et Resuspendre le culot dans une quantité appropriée de milieu de culture hDFSC.</li>
		<li>Compter les cellules : mélanger doucement 10 µL de suspension cellulaire à 10 µL de solution de bleu de Trypan. Appliquer 10 µL dans une chambre de comptage et de calculer la quantité de cellules hDFSC.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. caractérisation des hDFSCs
<ol><li>
Immunophénotypage
	<ol>
<li>Préparation des cellules pour cytométrie<ol>
<li>Préparation de solutions requises<ol>
<li>Préparer les PBS/EDTA (2 mM) : mélanger 996 mL de PBS avec 4 mL d’EDTA (0,5 M).</li>
				<li>Préparer la coloration tampon : mélangez 995 mL de PBS/EDTA (2 mM) avec 5 g de BSA. Filtrer la solution à l’aide d’un filtre de 0,22 µm et conserver à 4 ° C jusqu'à l’utilisation.</li>
				<li>Préparer la solution mère de paraformaldéhyde (PFA) (4 %) : diluer 4 g PFA dans 100 mL de PBS et chauffer la solution à 80 ° C. Mélanger la solution et ajuster le pH de 7,3. Aliquote obtenu solution PFA en proportions respectives (1,5 mL) et de conserver à-20 ° C jusqu'à son utilisation. ATTENTION : Parce que PFA vapeurs sont toxiques, préparez la solution de PFA sous une hotte ventilée.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Après la récolte (1.4), transférer 14 échantillons de 5 x 104 cellules dans des tubes de microcentrifuge de 1,5 mL. Centrifuger les suspensions à 300 x g pendant 10 min à 4 ° C. Jeter le surnageant. Remarque : Réaliser les travaux suivants dans une pièce plutôt ombragée. Garder les cellules et réactifs sur glace sauf indication contraire.</li>
			<li>Remettre en suspension des cellules dans certains montants de coloration tampon (4 ° C) et ajouter FcR blocage réactif (4 ° C) comme indiqué dans le tableau 1.</li>
			<li>Ajouter les anticorps suivants sur la face interne de l’échantillon respectif comme il est indiqué dans le tableau 1: anti-l’homme souris Allophycocyanin (APC) CD29 ; Souris APC contrôle des isotypes IgG1 κ ; Péridinine-chlorophylle, protéines (PerCP)-Cyanine5.5 anti-homme de souris CD44 ; PerCP-Cyanine5.5 souris le contrôle IgG2b κ isotype ; V500 anti-homme de souris CD45 ; V500 souris contrôle des isotypes IgG1 κ ; Phycoérythrine (PE) souris anti-humain CD73 ; Souris de PE contrôle des isotypes IgG1 κ ; PerCP-Cyanine5.5 anti-homme de souris CD90 ; PerCP-Cyanine5.5 souris contrôle des isotypes IgG1 κ ; la souris anti-humain CD105 : Alexa Fluor (AF) 488 ; contrôle négatif IgG1 de souris : AF488 ; PE-Cyanine7 anti-homme de souris CD117 ; PE-Cyanine7 souris IgG1, contrôle d’isotype κ. Après que les anticorps ont été ajoutés à chaque échantillon, tournez en bas des anticorps et mélanger doucement. Incuber les solutions pendant 10 min à 4 ° C.</li>
			<li>Ajouter 1 mL de PBS (4 ° C) et centrifuger les échantillons à 300 x g pendant 10 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.</li>
			<li>Remettre en suspension les cellules dans 100 µL de PBS (4 ° C) et ajouter 33 µL de l’IFP (4 %). Mélanger les solutions et les conserver sur la glace ou à 4 ° C jusqu'à l’analyse en cytométrie en flux.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Mesure de débit par cytométrie en flux des cellules Remarque : Réaliser les travaux suivants dans une pièce plutôt ombragée. Garder les cellules sur la glace jusqu'à la mesure.<ol>
<li>Afin d’étudier l’expression des antigènes de surface, transférer les échantillons dans des tubes adaptés aux mesures de cytométrie en flux.</li>
			<li>Mesurer au moins 2 x 104 événements à l’aide d’un cytomètre en flux. Analyser tel que représenté dans la Figure 2.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Potentiel de différenciation multipotentes de hDFSCs
	<ol>
<li>Utilisez un disponible dans le commerce humaine Mesenchymal Stem Cell fonctionnelle Identification Kit pour confirmer adipocytaire, ostéogénique et potentiel de différenciation chondrogéniques de hDFSCs. Appliquer l’anticorps secondaire de AF488 anti-chèvre âne pour la coloration de la protéine acide gras 4 (FABP4) et AGGRECANE ainsi que de l’âne d’AF488 secondaires anticorps anti-souris pour la coloration de l’ostéocalcine. Pour la coloration des noyaux, utiliser le milieu de montage avec 4', 6-Diamidino-2-phénylindole (DAPI). Remarque : Préparer les échantillons sans anticorps primaire comme témoins négatifs d’analyses microscopiques.</li>
		<li>Analyser l’expression des protéines par microscopie confocale à balayage laser. Paramètres de microscopie : objectif 40 x avec immersion dans l’huile ; excitation laser 488 nm (pour AF488) et 405 nm (pour DAPI).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. la transfection de hDFSCs
<ol><li>Après la récolte (1.4), graines hDFSCs sur une plaque de culture cellulaire de 24 puits 24h avant la transfection. Remarque : À partir de la densité cellulaire est environ 4 x 104 cellules par puits. Cellules devraient atteindre environ 80 % confluence le jour de la transfection. Remarque : Une cellule supplémentaire échantillon comme contrôle pour analyse en cytométrie en flux.</li>
	<li>Préparation de transfection complexes Remarque : Pour empêcher la contamination par les RNases, nettoyer l’espace de travail directement avant la préparation de transfection complexes à l’aide de la solution de décontamination de RNase. Utilisez seulement le matériau sans RNase et solutions. Remarque : Réaliser les travaux suivants dans une pièce plutôt ombragée.<ol>
<li>Préparer la solution mère de miR (50 µM) : remettre en suspension miR précurseur marqué Cy3 (5 nmol) dans de l’eau exempte de nucléase 100 µL. Solution mère de l’aliquote miR obtenus en magasin à-20 ° C jusqu'à son utilisation dans l’obscurité et les montants respectifs (5 µL).</li>
		<li>Diluer 40 pmol de miR (0,8 µL de la solution mère de miR de 50 µM) à 66,7 µL de milieu de sérum réduit. Mélanger la solution doucement</li>
		<li>Diluer 0,67 µL de réactif de transfection de base de lipides cationiques à 66,7 µL de milieu de sérum réduit. Mélanger la solution doucement et laisser incuber 5 min à température ambiante.</li>
		<li>Après l’incubation, ajouter le réactif de transfection préalablement dilué au préalable diluée SEM. Mélanger la solution doucement et incuber pendant 15 min à température ambiante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajouter goutte à goutte les complexes de transfection préparés directement au milieu de culture sur cellules. Mélanger doucement en balançant la plaque de culture cellulaire de 24 puits en arrière.</li>
	<li>Incuber les cellules à 37 ° C, 5 % de CO2et 20 % O2 pendant 24 h.</li>
</ol>4. analyse de la Transfection
Remarque : Réaliser les travaux suivants dans une pièce plutôt ombragée.
<ol><li>
Récolte après la transfection de cellules Remarque : Collecter toutes les solutions de la cellule d’un échantillon dans le tube à centrifuger conique 15 mL même.<ol>
<li>24h après la transfection, recueillir le liquide surnageant des échantillons dans des tubes à centrifuger respectifs.</li>
		<li>Laver les cellules avec 1 mL de PBS, PBS de transfert dans le tube à centrifuger respectifs et ajouter 500 µL trypsine/EDTA (RT) aux cellules. Incuber les solutions pendant 3 min à 37 ° C.</li>
		<li>Arrêter la trypsinisation en ajoutant 1 mL de milieu de culture (RT) aux cellules et transvaser la solution dans le tube à centrifuger respectifs. Cellules de centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 ° C. Remarque : Dès cette époque, garder les cellules et réactifs sur glace sauf indication contraire.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation des cellules pour cytométrie
	<ol>
<li>Jeter le surnageant. Remettre en suspension les cellules dans 100 µL de tampon de marquage (4 ° C) et transférer cellule solution dans un tube de microtubes de 1,5 mL.</li>
		<li>Ajouter 0,5 µL de colorant réactif amine aux échantillons afin de distinguer entre des cellules vivantes et mortes. Doucement, mélanger la solution et incuber pendant 10 min à 4 ° C.</li>
		<li>Ajouter 1 mL de PBS (4 ° C) dans les cellules et centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.</li>
		<li>Remettre en suspension les cellules dans 100 µL de PBS (4 ° C) et ajouter 33 µL de l’IFP (4 %). Mélanger les solutions et les conserver sur la glace ou à 4 ° C jusqu'à l’analyse en cytométrie en flux.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mesure de débit par cytométrie en flux des cellules Remarque : Réaliser les travaux suivants dans une pièce plutôt ombragée. Garder les cellules sur la glace jusqu'à la mesure.<ol>
<li>Transférer les échantillons dans des tubes adaptés aux mesures de cytométrie en flux.</li>
		<li>Examiner la viabilité cellulaire et l’efficacité d’absorption de miR à l’aide d’un cytomètre en flux. Mesurer au moins 2 x 104 événements. Utiliser la stratégie de blocage représentée à la Figure 4. Remarque : Utiliser les cellules celllulaire comme contrôle négatif pour organiser le processus de blocage pour les cellules positives Cy3 et de calculer la mort cellulaire provoquée par transfection.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les cellules souches adultes sont actuellement en discussion pour le traitement de plusieurs maladies dégénératives. En particulier, OS a moelle (BM)-dérivées de cellules souches, y compris les cellules souches hématopoïétiques (CSH) et MSCs, sont sous investigation clinique intensive47. Cependant, récolte de BM est une procédure invasive provoquant une douleur sur le site de don et peut conduire à des effets indésirables,48. Récemment, le tissu dentaire postnatal a émergé ...

Le follicule dentaire humain est un tissu conjonctif lâche dérivé ectomesenchymally entourant la dent en développement1,2. À côté de sa fonction de coordonner osteoclastogenesis et ostéogenèse pour le processus d’éruption de dent, ce tissu contenant des cellules souches et progénitrices en particulier pour le développement du parodonte3,4,5. Par conséquent, le follicule dentaire est considéré comme une source alternative de récolter les cellules souches humaines adultes6,7.
Plusieurs études ont démontré que les cellules souches humaines follicule dentaire (hDFSCs) sont capables de différencier dans la lignée parodontale incluant des ostéoblastes, les fibroblastes du ligament et les cémentoblastes8,9,10 . En outre, ces cellules ont été montrés pour correspondre à toutes les caractéristiques des cellules stromales mésenchymateuses (CSM), y compris capacité autorenouvellement, adhérence plastique, expression des marqueurs de surface spécifiques (par exemple, CD73, CD90, CD105) aussi bien qu’ostéogénique, adipocytaire et chondrogéniques différenciation potentiels11,12,13. D’autres études ont également révèlent un potentiel de différenciation neurale de hDFSCs2,14,15,16,17,18.
En raison de leurs propriétés prometteuses et un accès facile, hDFSCs est devenu récemment pertinentes pour tissus techniques19,20,21. Les premières études se concentrent sur le potentiel de DFSCs de régénération osseuse, parodontale et dent racines19,22,23,24,25,26, 27,28,29,30. La connaissance de la capacité neurogène de hDFSCs, leur application comme traitement potentiel pour les maladies neurodégénératives depuis enquête31,32,,33. HDFSCs ont également gagné en importance à la régénération des autres tissus (p. ex., l’épithélium cornéen)34,35. Le potentiel thérapeutique des hDFSC ne repose pas seulement sur leur potentiel de différenciation direct mais aussi sur leur activité paracrine. Récemment, il a été démontrés que hDFSCs sécrètent une multitude de facteurs bioactifs tels que les métalloprotéinases matricielles (MMP), facteur de croissance analogue à l’insuline (IGF), facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF), facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF) et croissance hépatocyte facteur (HGF), qui jouent un rôle crucial dans l’angiogenèse, immunomodulation, remodelage de la matrice extra-cellulaire et processus réparateur36.
Cependant, large traduction clinique de thérapie de cellules souches est encore affaiblie par plusieurs défis, comme la mort massive de cellules initiales et bas les cellules souches bénéfiques effets37,38. Le génie génétique prévoit une stratégie prometteuse pour relever ces défis et donc peut améliorer grandement l’efficacité thérapeutique de cellules souches38,39,40. Pour la manipulation de cellules transitoires, microARN (miRs) sont des candidats, comme ces petits régulateurs translationnelles contrôlent le devenir et le comportement des cellules souches sans le danger du génome stable intégration41,,42, 43. a ce jour, plusieurs miRs bénéfiques ont été identifiés en favorisant la prolifération des cellules souches, survie, homing, activité paracrine ainsi que leur différenciation en plusieurs lignées44. Par exemple, miR-133 a machiné MSCs ont montré une augmentation de la survie et la prise de greffe dans les coeurs de rats infarci résultant en une amélioration de la fonction cardiaque par rapport aux non modifiées MSCs45. De même, miR-146 a MSCs sur-exprimant apparaissaient à sécréter des quantités plus élevées de VEGF qui a conduit à un renforcement de l’efficacité thérapeutique dans les tissus ischémiques46.
Ce manuscrit présente un protocole détaillé pour l’extraction sélective et l’ingénierie génétique des hDFSCs. À cette fin, nous avons décrit la digestion enzymatique et récolte des follicules dentaires humains, ainsi que l’isolation ultérieure de hDFSCs. Afin de caractériser les cellules isolées, des instructions importantes pour la vérification des propriétés MSC ont été incluses conformément aux directives de la société internationale de thérapie cellulaire13. En outre, nous fournissons une description détaillée pour la génération de hDFSCs miR-modifiée en appliquant une stratégie axée sur les lipides cationiques de la transfection et l’évaluation de l’efficacité de transfection et cytotoxicité.

<table><tbody><tr><td>Souris anti humaine CD105 Anticorps : Alexa Fluor 488</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA1557A488</td><td>Clone SN6, souris monoclonale</td></tr><tr><td>IgG1 Contrôle négatif Anticorps : Alexa Fluor 488</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA928A488</td><td>monoclonal</td></tr><tr><td>APC Souris Anti-Human CD29 Anticorps</td><td>BD Biosciences</td><td>559883</td><td>Clone MAR4, monoclonal</td></tr><tr><td>APC Souris IgG1, &kappa ; Anticorps de contrôle des isotypes</td><td>BD Biosciences</td><td>555751</td><td>Clone MOPC-21, monoclonal</td></tr><tr><td>PE Souris Anti-humain CD73 Anticorps</td> BD <td>Biosciences</td><td>550257</td><td>Clone AD2, monoclonal</td></tr><tr><td>PE Souris IgG1, &kappa ; Anticorps de contrôle des isotypes</td><td>BD Biosciences</td><td>555749</td><td>Clone MOPC-21, monoclonal</td></tr><tr><td>PE-Cy7 Souris Anti-humain CD117 Anticorps</td><td>BD Biosciences</td><td>339217</td><td>Clone 104D2, monoclonal</td></tr><tr><td>PE-Cy7 Souris IgG1, &kappa ; Isotype Control Anticorps</td><td>BD Biosciences</td><td>557872</td><td>Clone MOPC-21, monoclonal</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 Souris Anti-humain CD44 Anticorps</td> BD <td>Biosciences</td><td>560531</td><td>Clone G44-26, monoclonal</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 Souris IgG2b, &kappa ; Isotype Control Anticorps</td><td>BD Biosciences</td><td>558304</td><td>Clone 27-35, monoclonal</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 Souris Anti-Humain CD90&nbsp ; Anticorps</td><td>BD Biosciences</td><td>561557</td><td>Clone 5E10, monoclonal</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 Souris IgG1, &kappa ; Isotype Control Anticorps</td><td>BD Biosciences</td><td>55095</td><td>Clone MOPC-21, monoclonal</td></tr><tr><td>V500 Souris Anti-humain CD45 Anticorps</td> BD <td>Biosciences</td><td>560777</td><td>Clone HI30, monoclonal</td></tr><tr><td>V500 Souris IgG1, &kappa ; Isotype Control</td><td>Anticorps BD Biosciences</td><td>560787</td><td>Clone X40, réactif de blocage FcR monoclonal</td></tr><tr><td>, humain</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575-020</td><td>0,5M, pH 8,0</td></tr><tr><td>Steritop</td><td>Merck Millipore</td><td>SCGPT05RE</td><td>0,22 &micro ; m, radio-stérilisé, polyéthersulfone</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Merck Millipore</td><td>1040051000</td><td></td></tr><tr><td>Kit d’identification fonctionnelle des cellules souches mésenchymateuses humaines</td><td>R& D Systems</td><td>SC006</td><td></td></tr><tr><td>Solution de décontamination RNase ; RNaseZap Solution de décontamination de la RNase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Précurseur marqué au Cy3 miR ; Cy3 Contrôlé négatif Pre-miR marqué par un colorant #1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM17120</td><td>5 nmol</td></tr> Contrôle <tr><td>négatif du précurseur de miARN Pre-miR #1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM17110</td><td>5 nmol</td></tr><tr><td>Réactif de transfection à base de lipides cationiques ; Lipofectamine 2000 Réactif de transfection</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Milieu sérique réduit ; Opti-MEM I Sérum réduit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Goat IgG (H+L) Anticorps secondaire à adsorption croisée, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11055</td><td>polyclonal</td></tr><tr><td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Anticorps secondaire à adsorption croisée élevée, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21202</td><td>polyclonal</td></tr><tr><td>Milieu de montage ; Fluoroshield avec DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6057-20ML</td><td>support de montage histologique</td></tr><tr><td>ELYRA PS.1 LSM 780 microscope confocal</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACS LSRII cytomètre en flux</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva Software 6.1.2</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZEN2011 software</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA solution (0.05 %/ 0,02 %)</td><td>Biochrom</td><td>L2143</td><td>dans le PBS, sans : Ca2+, Mg2+</td></tr><tr><td>colorant réactif amine ; VIVRE/MORT&ÉCHANGER ; Kit de coloration à cellules mortes fixable dans le proche infrarouge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td>pH : 7,4 ; sans : Ca et Mg</td></tr><tr><td>P-S-G (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>Milieu basal ; Dulbecco’s Modified Eagle Mélange de milieux et de nutriments F-12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11039021</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotique, ZellShield</td><td>Biochrom</td><td>W 13-0050</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase de type I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17100017</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>Filtre, filtre seringue Sterifix 0.2 & micro ; m</td><td>Braun</td><td>4099206</td><td></td></tr><tr><td>50&nbsp ; mL Tube à centrifuger conique</td><td>Sarstedt</td><td>62 547 254</td><td></td></tr><tr><td>Tube à centrifuger conique 15 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62 554 502</td><td></td></tr><tr><td>Fiole de culture cellulaire 75 cm2</td><td>Sarstedt</td><td>833 910 002</td><td></td></tr><tr><td>Gourde de culture cellulaire 25 cm2</td><td>Sarstedt</td><td>833 911 002</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de congélation, Biofreeze</td><td>Biochrom</td><td>F 2270</td><td></td></tr><tr><td>Cryotubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>377267</td><td>1,8 mL</td></tr><tr><td>Trypan blue solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>0,4 %</td></tr><tr><td>Chambre de comptage</td><td>Paul Marienfeld</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anesthésique local, xylocitine (chlorhydrate de lidocaïne) 2 % avec épinéphrine (adrénaline) 0,001 %</td> <td>Mibe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl solution</td><td>Braun</td><td></td><td>0.9 %</td></tr><tr><td>Vicryl satures, Vicryl rapide</td><td>Ethicon</td><td></td><td>3 - 0</td></tr></tbody></table>

isolement, caractérisation et axée sur les micro-arn de la modification génétique des cellules souches humaines follicule dentaire

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

A ce jour, plusieurs types de cellules souches à différents stades de développement sont dans la mise au point pour le traitement des maladies dégénératives. Pourtant, certains aspects, tels que la mort cellulaire massive initiale et faible d’effets thérapeutique, avec facultés affaiblies à leur traduction clinique large. Génie génétique des cellules souches avant la greffe a émergé comme une méthode prometteuse pour optimiser les effets thérapeutiques des cellules souches. Cependant, les systèmes de prestation sûre et efficace de gène manquent encore. Par conséquent, le développement de méthodes appropriées peut fournir une approche pour résoudre les défis actuels dans les thérapies à base de cellules souches.
Le présent protocole décrit l’extraction et la caractérisation des cellules souches de follicule dentaire humaine (hDFSCs) ainsi que leur modification génétique non viraux. Le follicule dentaire postnatal dévoilé comme une source prometteuse et facilement accessible pour la récolte des cellules souches multipotentes adultes possédant le potentiel élevé de prolifération. La technique d’isolation décrit présente une méthode simple et fiable pour récolter des hDFSCs de dents de sagesse. Ce protocole comprend également des méthodes pour définir les caractéristiques des cellules souches de cellules isolées. Génie biomoléculaire de hDFSCs, une stratégie optimisée transfection de base de lipides cationiques est présentée habilitante introduction microARN hautement efficace sans causer d’effets cytotoxiques. MicroARN sont des candidats appropriés pour la manipulation de cellules transitoires, comme ces petits régulateurs translationnelles contrôlent le devenir et le comportement des cellules souches sans danger d’intégration génome stable. Par conséquent, ce protocole représente une procédure sûre et efficace pour l’ingénierie des hDFSCs qui peut devenir important pour optimiser leur efficacité thérapeutique.

Nous présentons ici, une instruction détaillée d’isolement à la récolte des hDFSCs du tissu humain follicule dentaire. En raison de l’accès facile du follicule dentaire pendant la chirurgie de routine, il est une source prometteuse pour l’extraction des cellules souches adultes.
Le hDFSCs isolées ont montré toutes les caractéristiques décrites pour la définition de MSCs13. En fait, les cellules étaient ad...

Ce protocole décrit le génie génétique transitoire dentaire des cellules souches extraites du follicule dentaire humaine. La stratégie appliquée modification non viraux peut-être devenir une base pour l’amélioration des produits thérapeutiques des cellules souches.

Isolement, caractérisation et axée sur les micro-ARN de la Modification génétique des cellules souches humaines follicule dentaire

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la médecine régénérative, comme lorsqu’une cellule souche du follicule dentaire humain pourrait être génétiquement modifiée pour améliorer leurs propriétés thérapeutiques. Le principal avantage de cette technique est que les cellules souches peuvent être modifiées par introduction de microARN sans risque d’intégration stable du génome. Commencez la procédure de digestion enzymatique des deux follicules, par préchauffage à température ambiante, cellule souche follicule dentaire humain ou milieu de culture hDFSC et solution PBSPSG.Décongelez un aliquot chacun des solutions de stock de type I et Dispase II de Collagenase. Préparez une solution de digestion en ajoutant 500 microlitres de la solution de stock de type I de Collagène et 500 microlitres de la solution de stock Dispase II à 4 millilitres de basal medium contenant 1% d’agent antibiotique. Pour éviter la contamination du site pendant l’isolement des follicules dentaires humains, les tampons de lavage et les supports de culture utilisés doivent contenir des agents antibiotiques.Placer un follicule dentaire extrait dans une boîte de Pétri stérile. Ajout

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La méthode décrite isolement et la caractérisation de l'homme dentaires cellules souches de pulpe (hDPSCs) en utilisant...

Différenciation isolement, caractérisation et comparative de l&#39;homme dentaires cellules souches de pulpe Dérivé de dents permanentes à l&#39;aide de deux méthodes différentes

L'incisive de la souris en croissance continue fournit un modèle pour l'étude de renouvellement des tissus dentaires à partir de cellules souches épithéliales dentaires (DESCs). Un système solide de façon cohérente et fiable obtention de ces cellules de l'incisive et leur expansion in vitro est rapporté ici.

Isolement et culture des cellules souches épithéliales dentaire de l&#39;adulte de souris Incisive

Nous avons établi une technique pour l'isolement, la caractérisation phénotypique et l'analyse fonctionnelle des cellules immunitaires de gencive murin.

L&#39;isolement, la caractérisation et de l&#39;examen fonctionnel du Réseau de cellules gingivale immunitaire

Le follicule pileux de souris est un modèle idéal pour étudier la biologie des cellules souches adultes. Nous présentons ici un protocole permettant d’isoler différentes populations de follicules pileux, de cellules souches et de kératinocytes épidermiques, en utilisant la digestion enzymatique de la peau dorsale de souris suivie d’une analyse FACS.

Isoler follicule pileux cellules souches et kératinocytes épidermiques de la peau Dorsale Souris

Nous présentons ici un protocole pour humain isolement des cellules souches pulpe dentaire et propagation afin d’évaluer l’expression de la protéine prion au cours du processus de différenciation neuronale.

Isolement, Propagation et Expression de la protéine Prion au cours de la différenciation neuronale de cellules souches humaines pulpe dentaire

La reprogrammation cellulaire nécessite l'introduction de gènes clés, qui régulent et maintiennent l'état cellulaire pluripotent. Le protocole décrit permet la formation de colonies de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) à partir de fibroblastes dermiques humains sans méthodes virales/intégratrices, mais en utilisant des ARN non modifiés (NM-ARN) combinés à des facteurs d'évasion immunitaire réduisant les mécanismes de défense cellulaire.

Isolement des fibroblastes dermiques humains adultes de la peau abdominale et génération de cellules souches pluripotentes induites à l'aide d'une méthode de non-intégration

Le follicule dentaire contient une population épithéliale et des cellules mésenchymateuses. La population épithéliale a été sélectionnée parmi la population hétérogène de cellules folliculaires dentaires en fournissant un milieu de culture distinct. Les cellules épithéliales ont survécu et ont formé des colonies dans un milieu sans sérum.

Isolement des cellules épithéliales du follicule dentaire humain

Cet article fournit un guide par étapes pour établir une culture primaire de cellules souches de pulpes dentaires à l’aide de la méthode de culture d’explants et la caractérisation de ces cellules basée sur les directives de l’ICSCRT. Les cellules isolées par ce protocole peuvent être considérées comme des cellules souches mésenchymateuses pour d’autres applications.

Culture primaire de cellules souches de la pulpe dentaire

Ce protocole met l’accent sur l’extraction, la culture et la préservation de cellules souches multipotentes de la pulpe dentaire par digestion enzymatique. De plus, il démontre leur potentiel à se différencier en ostéoblastes, adipocytes et chondrocytes, soulignant l’importance de la précision et de la cohérence dans le processus.

Isolement, culture et caractérisation de cellules souches de la pulpe dentaire à partir de dents de lait et permanentes humaines

L’isolementdes CSM BAMBIà hauteMFGE8, l’un des trois principaux sous-groupes constituant les CSM-UC humaines hétérogènes, est utile pour bien comprendre les caractéristiques et les fonctions de ce sous-type en vue de son application future pour améliorer l’efficacité clinique dans des maladies spécifiques. Nous présentons ici une méthode de tri des UC-MSCBAMBI highMFGE8.

Isolement de cellules stromales mésenchymateuses dérivées du cordon ombilical BAMBIhumain

Découvrez l'ingénierie génétique transitoire des cellules souches du follicule dentaire humain par introduction de microARN. Cette méthode non virale améliore les propriétés thérapeutiques sans intégration génomique stable.

Isolement, caractérisation et axée sur les micro-ARN de la Modification génétique des cellules souches humaines follicule dentaire (Vidéo) | JoVE Journal

Isolement, caractérisation et axée sur les micro-ARN de la Modification génétique des cellules souches humaines follicule dentaire

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