Name: Un test In Vitro pour détecter l’activité ARNt-isopentényl transférase (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Découvrez une méthode in vitro pour caractériser l'activité de la tRNA-isopentényl transférase de la levure Mod5. Cette technique simple permet de détecter directement les modifications covalentes de l'ARN.

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Nous tenons à remercier le Dr. David Engelke pour ses conseils et commentaires utiles sur ce manuscrit. PJS - des fonds de démarrage de laboratoire de Ball State University ; DAB - accorder 1R15AI130950-01.

Remarque : Le protocole a été adapté du Réf. 24.
1. obtention de l’ARN et enzymes d’intérêt
<ol><li>Usage in vitro transcrit les ARN marqué en interne avec 32P, et His6-Mod5 recombinant exprimée en et purifié à partir de e. coli, comme précédemment décrit24.<ol>
<li>Introduire dans vitro transcrit RNAs (section 3) à l’aide d’ARN polymérase T7 en présence d’ATP sans étiquette, UTP, CTP, GTP et 10 µCi de gel purifié, a précipité l’éthanol α-ATP, resuspendu dans 1 x TE (pH 7.5, EDTA de 0,1 mM de 10 mM Tris-HCl) et conservés à-80 ° C 24.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vous pouvez également obtenir commercialement disponibles RNAs fluorescent étiquetés d’intérêt. Produire l’enzyme d’intérêt dans n’importe quel système d’expression préféré. ATTENTION : Les étiquettes fluorescentes internes dans l’ARN peuvent modifier structure d’ARN et de la reconnaissance par les enzymes.</li>
</ol>2. préparer un 20 % de Polyacrylamide Gel la dénaturation
Remarque : Afin d’obtenir une résolution suffisante de fragments d’ARN, un gel de la dalle verticale de longueur 40 cm est recommandé. La largeur du gel utilisé est déterminée par le nombre d’échantillons à analyser.
<ol><li>Bien nettoyer les plaques de verre. Tout d’abord, laver à l’eau savonneuse, rincer avec de l’eau désionisée et enfin nettoyer avec l’alcool isopropylique et chiffons non pelucheux.</li>
	<li>Assembler les plaques et les entretoises.</li>
	<li>Mélanger les réactifs suivants pour faire 100 mL de 20 % d’acrylamide, 7,5 M urée, 1 x TBE gel : 80 mL de gel de l’urée se concentrer (237,5 g/L d’acrylamide, 12,5 g/L de méthylène bisacrylamide, 7,5 M urée dans l’eau désionisée), 10 mL de diluant gel urée (7.5 mètres urée dans l’eau désionisée) et 10 mL de tampon de gel d’urée (0,89 M Tris-Borate-20 mM EDTA tampon pH 8,3 et 7,5 M urée). Remarque : Le volume de solution de gel doit être réglé selon les dimensions du gel.</li>
	<li>Ajouter 40 µL de N, N, N′, N′-tétraméthyléthylènediamine (TEMED) et 800 µL de persulfate d’ammonium 10 % fraîchement préparée (APS).</li>
	<li>Rédiger la solution de gel dans une grande seringue et répartir entre les plaques de verre. Tapez sur le verre avec les doigts tout en versant pour empêcher la formation de bulles.</li>
	<li>Laisser solidifier pendant 30 min.</li>
	<li>Pince gel solidifié sur appareil gel vertical à l’aide de pinces pour reliures.</li>
	<li>Remplissez les compartiments supérieurs et inférieurs de tampon 1 x TBE.</li>
	<li>Deux heures avant le chargement du gel, exécutez avant le gel à 20 mA, pendant 2 h permettre à la limite de tampon de courir plus vite les oligonucléotides plus petits -, sinon le plus petit nucléotides et oligonucléotides ont tendance à s’effondrer sur le devant de la mémoire tampon.</li>
</ol>3. RNA Isopentenylation Assay
<ol><li>Préparer des réactions dans un volume final de 17 µL, contenant 58 mM Tris-HCl (pH 7,2), 1,2 mM ATP, 5,8 mM MgCl2, 0,2 mM DMAPP, 10 inhibiteur de U de RNase (p. ex., SuperRNaseIn), 40 000 CPM en interne 32marqués P RNA, 5,3 µM Mod5 et 1,2 mM 2 - mercaptoéthanol.</li>
	<li>Incuber à 37 ° C pendant 1 h, les réactions.</li>
	<li>Éthanol-précipité RNAs utilisant 2,5 volumes (42,5 µL) d’éthanol à 100 % et de 1/10 volumes (1,7 µL) d’acétate de sodium 3,5 M pH 5.5 et place à-20 ° C pour 1 h ou toute une nuit.</li>
	<li>Centrifuger les échantillons d’ARN pendant 20 min à 15 400 x g et 4 ° C.</li>
	<li>Avec précaution, retirez le surnageant et laver le culot de RNA avec 500 µL d’éthanol à 70 %.</li>
	<li>Centrifuger les échantillons à pendant 5 min 15 400 x g et 4° C.</li>
	<li>Retirer délicatement les boulettes de RNA surnageants et séchage à l’air pendant 15 minutes, ou jusqu'à ce que tout l’éthanol s’est évaporée.</li>
	<li>Resuspendre les pastilles de RNA dans 10 µL d’urée 8 M.</li>
	<li>Ajouter 150 U de RNase T1 et incuber à 37 ° C pendant la nuit.</li>
	<li>Ajouter 2 µL de 6 x chargement tampon (60 % de glycérol, 0,1 % de xylène cyanol).</li>
	<li>Charger de 10 µL de chaque échantillon de RNA sur un pré exécution, 20 % polyacrylamide, gel d’urée de 7,5 M (Voir l’article 2 du protocole). NOTE : Radiomarquées RNA taille échelles peuvent être inclus comme un marqueur de mobilité supplémentaire.</li>
	<li>Exécutez le gel pendant 2 h à 25 mA.</li>
	<li>Arrêter le gel et retirer de l’appareil.</li>
	<li>Rupture conserver entre les deux plaques de verre et retirez-les d'entre les plaques de verre, avec le gel restant sur la plaque de « fond ». Remarque : prenez soin de ne pas pour déchirer le gel au cours de cette étape.</li>
	<li>Appliquer une couche de plastique sur le gel et exposer sur un écran phosphorescent pendant 3 h, alternativement, placer le gel sur papier pour chromatographie et sécher avec un sèche-cheveux avant l’exposition au phosphore écran de gel.</li>
	<li>Image écran de phosphore sur un imageur de phosphore.</li>
</ol>

<ol><li>Boccaletto, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MODOMICS%3A+a+database+of+RNA+modification+pathways.+2017+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update.</a> Nucleic Acids Research. 46 (D1), 303-307 (2018).</li>
<li>Lewis, C. J., Pan, T., Kalsotra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+modifications+and+structures+cooperate+to+guide+RNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA modifications and structures cooperate to guide RNA-protein interactions.</a> Nature Reviews: Molecular and Cellular Biology. 18 (3), 202-210 (2017).</li>
<li>Soll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+modification+of+transfer+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Enzymatic modification of transfer RNA.</a> Science. 173 (3994), 293-299 (1971).</li>
<li>Schweizer, U., Bohleber, S., Fradejas-Villar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+modified+base+isopentenyladenosine+and+its+derivatives+in+tRNA%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">The modified base isopentenyladenosine and its derivatives in tRNA.</a> RNA Biology. 14 (9), 1197-1208 (2017).</li>
<li>Persson, B. C., Esberg, B., Olafsson, O., Bjork, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+function+of+isopentenyl+adenosine+derivatives+in+tRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Synthesis and function of isopentenyl adenosine derivatives in tRNA.</a> Biochimie. 76 (12), 1152-1160 (1994).</li>
<li>Urbonavicius, J., Qian, Q., Durand, J. M., Hagervall, T. G., Bjork, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+reading+frame+maintenance+is+a+common+function+for+several+tRNA+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Improvement of reading frame maintenance is a common function for several tRNA modifications.</a> EMBO Journal. 20 (17), 4863-4873 (2001).</li>
<li>Aubee, J. I., Olu, M., Thompson, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+i6A37+tRNA+modification+is+essential+for+proper+decoding+of+UUX-Leucine+codons+during+rpoS+and+iraP+translation%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">The i6A37 tRNA modification is essential for proper decoding of UUX-Leucine codons during rpoS and iraP translation.</a> RNA. 22 (5), 729-742 (2016).</li>
<li>Caillet, J., Droogmans, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+the+Escherichia+coli+miaA+gene+involved+in+the+formation+of+delta+2-isopentenyl+adenosine+in+tRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of the Escherichia coli miaA gene involved in the formation of delta 2-isopentenyl adenosine in tRNA.</a> Journal of Bacteriology. 170 (9), 4147-4152 (1988).</li>
<li>Soderberg, T., Poulter, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+dimethylallyl+diphosphate%3AtRNA+dimethylallyltransferase%3A+essential+elements+for+recognition+of+tRNA+substrates+within+the+anticodon+stem-loop%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli dimethylallyl diphosphate:tRNA dimethylallyltransferase: essential elements for recognition of tRNA substrates within the anticodon stem-loop.</a> Biochemistry. 39 (21), 6546-6553 (2000).</li>
<li>Dihanich, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+MOD5%2C+a+gene+required+for+isopentenylation+of+cytoplasmic+and+mitochondrial+tRNAs+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of MOD5, a gene required for isopentenylation of cytoplasmic and mitochondrial tRNAs of Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 7 (1), 177-184 (1987).</li>
<li>Lemieux, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+physiological+rates+in+Caenorhabditis+elegans+by+a+tRNA-modifying+enzyme+in+the+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Regulation of physiological rates in Caenorhabditis elegans by a tRNA-modifying enzyme in the mitochondria.</a> Genetics. 159 (1), 147-157 (2001).</li>
<li>Golovko, A., Sitbon, F., Tillberg, E., Nicander, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+tRNA+isopentenyltransferase+gene+from+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of a tRNA isopentenyltransferase gene from Arabidopsis thaliana.</a> Plant Molecular Biology. 49 (2), 161-169 (2002).</li>
<li>Warner, G. J., Rusconi, C. P., White, I. E., Faust, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+sequencing+of+two+isopentenyladenosine-modified+transfer+RNAs+from+Chinese+hamster+ovary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Identification and sequencing of two isopentenyladenosine-modified transfer RNAs from Chinese hamster ovary cells.</a> Nucleic Acids Research. 26 (23), 5533-5535 (1998).</li>
<li>Golovko, A., Hjalm, G., Sitbon, F., Nicander, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+a+human+tRNA+isopentenyl+transferase%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Cloning of a human tRNA isopentenyl transferase.</a> Gene. 258 (1-2), 85-93 (2000).</li>
<li>Kernohan, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matchmaking+facilitates+the+diagnosis+of+an+autosomal-recessive+mitochondrial+disease+caused+by+biallelic+mutation+of+the+tRNA+isopentenyltransferase+%28TRIT1%29+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutations%22%5BJournal%5D)">Matchmaking facilitates the diagnosis of an autosomal-recessive mitochondrial disease caused by biallelic mutation of the tRNA isopentenyltransferase (TRIT1) gene.</a> Human Mutations. 38 (5), 511-516 (2017).</li>
<li>Yarham, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+i6A37+modification+of+mitochondrial+and+cytosolic+tRNAs+results+from+pathogenic+mutations+in+TRIT1+and+its+substrate+tRNA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Defective i6A37 modification of mitochondrial and cytosolic tRNAs results from pathogenic mutations in TRIT1 and its substrate tRNA.</a> PLoS Genetics. 10 (6), 1004424(2014).</li>
<li>Smaldino, P. J., Read, D. F., Pratt-Hyatt, M., Hopper, A. K., Engelke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytoplasmic+and+nuclear+populations+of+the+eukaryote+tRNA-isopentenyl+transferase+have+distinct+functions+with+implications+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">The cytoplasmic and nuclear populations of the eukaryote tRNA-isopentenyl transferase have distinct functions with implications in human cancer.</a> Gene. 556 (1), 13-18 (2015).</li>
<li>Lamichhane, T. N., Mattijssen, S., Maraia, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cells+have+a+limited+set+of+tRNA+anticodon+loop+substrates+of+the+tRNA+isopentenyltransferase+TRIT1+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Human cells have a limited set of tRNA anticodon loop substrates of the tRNA isopentenyltransferase TRIT1 tumor suppressor.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (24), 4900-4908 (2013).</li>
<li>Swoboda, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimelanoma+CTL+recognizes+peptides+derived+from+an+ORF+transcribed+from+the+antisense+strand+of+the+3%27+untranslated+region+of+TRIT1%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+Oncolytics%22%5BJournal%5D)">Antimelanoma CTL recognizes peptides derived from an ORF transcribed from the antisense strand of the 3' untranslated region of TRIT1.</a> Molecular Therapy Oncolytics. 1, 14009(2015).</li>
<li>Yue, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+breast+cancer+candidate+genes+using+gene+co-expression+and+protein-protein+interaction+information%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Identification of breast cancer candidate genes using gene co-expression and protein-protein interaction information.</a> Oncotarget. 7 (24), 36092-36100 (2016).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+polymorphisms+and+haplotype+in+the+region+of+TRIT1%2C+MYCL1+and+MFSD2A+with+the+risk+and+clinicopathological+features+of+gastric+cancer+in+a+southeast+Chinese+population%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Association of polymorphisms and haplotype in the region of TRIT1, MYCL1 and MFSD2A with the risk and clinicopathological features of gastric cancer in a southeast Chinese population.</a> Carcinogenesis. 34 (5), 1018-1024 (2013).</li>
<li>Spinola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+functional+characterization+of+the+candidate+tumor+suppressor+gene+TRIT1+in+human+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Identification and functional characterization of the candidate tumor suppressor gene TRIT1 in human lung cancer.</a> Oncogene. 24 (35), 5502-5509 (2005).</li>
<li>Spinola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethnic+differences+in+frequencies+of+gene+polymorphisms+in+the+MYCL1+region+and+modulation+of+lung+cancer+patients%27+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">Ethnic differences in frequencies of gene polymorphisms in the MYCL1 region and modulation of lung cancer patients' survival.</a> Lung Cancer. 55 (3), 271-277 (2007).</li>
<li>Read, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+of+Mod5+is+affected+by+tRNA+binding+with+implications+for+tRNA+gene-mediated+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Aggregation of Mod5 is affected by tRNA binding with implications for tRNA gene-mediated silencing.</a> FEBS Letters. 591 (11), 1601-1610 (2017).</li>
<li>Waller, T. J., Read, D. F., Engelke, D. R., Smaldino, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+tRNA-modifying+protein%2C+TRIT1%2C+forms+amyloid+fibers+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">The human tRNA-modifying protein, TRIT1, forms amyloid fibers in vitro.</a> Gene. 612, 19-24 (2017).</li>
<li>Suzuki, G., Shimazu, N., Tanaka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+prion%2C+Mod5%2C+promotes+acquired+drug+resistance+and+cell+survival+under+environmental+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress.</a> Science. 336 (6079), 355-359 (2012).</li>
<li>Soderberg, T., Poulter, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+dimethylallyl+diphosphate%3AtRNA+dimethylallyltransferase%3A+site-directed+mutagenesis+of+highly+conserved+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli dimethylallyl diphosphate:tRNA dimethylallyltransferase: site-directed mutagenesis of highly conserved residues.</a> Biochemistry. 40 (6), 1734-1740 (2001).</li>
<li>Lamichhane, T. N., Blewett, N. H., Maraia, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+and+diversity+of+tRNA+anticodon+determinants+of+substrate+recognition+by+eukaryotic+A37+isopentenyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22Rna%22%5BJournal%5D)">Plasticity and diversity of tRNA anticodon determinants of substrate recognition by eukaryotic A37 isopentenyltransferases.</a> Rna. 17 (10), 1846-1857 (2011).</li>
<li>Lamichhane, T. N., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23716598">Lack of tRNA modification isopentenyl-A37 alters mRNA decoding and causes metabolic deficiencies in fission yeast.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (15), 2918-2929 (2013).</li>
<li>Laten, H., Gorman, J., Bock, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isopentenyladenosine+deficient+tRNA+from+an+antisuppressor+mutant+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Isopentenyladenosine deficient tRNA from an antisuppressor mutant of Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 5 (11), 4329-4342 (1978).</li>
<li>Etcheverry, T., Colby, D., Guthrie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+precursor+to+a+minor+species+of+yeast+tRNASer+contains+an+intervening+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A precursor to a minor species of yeast tRNASer contains an intervening sequence.</a> Cell. 18 (1), 11-26 (1979).</li>
<li>Yan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+quantitative+approach+reveals+more+small+RNA+modifications+in+mouse+liver+and+their+correlation+with+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A high-throughput quantitative approach reveals more small RNA modifications in mouse liver and their correlation with diabetes.</a> Analytical Chemistry. 85 (24), 12173-12181 (2013).</li>
<li>Su, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+ribonucleoside+modifications+in+tRNA+by+HPLC-coupled+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of ribonucleoside modifications in tRNA by HPLC-coupled mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 9 (4), 828-841 (2014).</li>
<li>Jonkhout, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+modification+landscape+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Rna%22%5BJournal%5D)">The RNA modification landscape in human disease.</a> Rna. 23 (12), 1754-1769 (2017).</li>
<li>Dominissini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+N%281%29-methyladenosine+methylome+in+eukaryotic+messenger+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The dynamic N(1)-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA.</a> Nature. 530 (7591), 441-446 (2016).</li>
<li>Meyer, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+mRNA+methylation+reveals+enrichment+in+3%27+UTRs+and+near+stop+codons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons.</a> Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).</li>
<li>Squires, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+occurrence+of+5-methylcytosine+in+human+coding+and+non-coding+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA.</a> Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).</li>
<li>Schwartz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+mapping+reveals+widespread+dynamic-regulated+pseudouridylation+of+ncRNA+and+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide mapping reveals widespread dynamic-regulated pseudouridylation of ncRNA and mRNA.</a> Cell. 159 (1), 148-162 (2014).</li>
<li>Schwartz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+mapping+reveals+a+conserved%2C+widespread%2C+dynamic+mRNA+methylation+program+in+yeast+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution mapping reveals a conserved, widespread, dynamic mRNA methylation program in yeast meiosis.</a> Cell. 155 (6), 1409-1421 (2013).</li>
<li>Behm-Ansmant, I., Helm, M., Motorin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+specific+chemical+reagents+for+detection+of+modified+nucleotides+in+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Use of specific chemical reagents for detection of modified nucleotides in RNA.</a> Journal of Nucleic Acids. 2011, 408053(2011).</li>
<li>Novikova, I. V., Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tackling+structures+of+long+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tackling structures of long noncoding RNAs.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (12), 23672-23684 (2013).</li>
</ol>

Aucune à divulguer.

Modifications de RNA continuent de figurer à jouer un rôle toujours plus important et diversifié dans la fonction cellulaire et organismique. Ainsi, le développement des tests d’interroger RNA modification des enzymes est central pour mieux comprendre les aspects fondamentaux de la biologie. Ce protocole décrit une analyse haute résolution in vitro afin de caractériser l’activité de modification tRNA de Mod5.
Ce protocole a l’avantage d’offrir une lecture directe et facilement interpr...

Au moins 163 modifications de RNA post-transcriptionnel distinctes ont été identifiées, avec ces modifications conférant des fonctions variées et contextuelle à RNAs, directement influencer la structure d’ARN et qui touchent de l’ARN, des interactions avec d’autres molécules1,2. Que l’appréciation par le nombre et la variété de modifications de RNA augmente, il est essentiel d’élaborer des tests qui peuvent interroger fiable tant les modifications de RNA et les enzymes qui catalysent les.
Une des premières modifications RNA d’identifier se produit à base 37 dans les ARNt, adjacent à l’anti-codon sur les 3' côté3,4. Un groupe d’isopentényl est transféré de diméthylallylpyrophosphate (DMAPP) sur la position N6 d’adénosine 37 (j’ai6A37) 3,5 sur un sous-ensemble des ARNt cytoplasmiques et mitochondriale. J’ai6A37 améliore la fidélité de la traduction et l’efficacité en augmentant d’affinité de l’ARNt pour le ribosome4,6 et j’ai6A37 est importante pour la réponse au stress en bactéries7. Les enzymes qui effectuent cette modification sont appelés transférases isopentényl tRNA et sont hautement conservées chez les bactéries8,9, champignons10, vers11, plantes12et chez les eucaryotes supérieurs13 , y compris les humains,14.
Des mutations dans le gène humain de transférase isopentenyl de tRNA, TRIT1, sont associées à des maladies humaines. Par exemple, une mutation dans TRIT1 est corrélée avec une grave maladie mitochondriale, probablement causée par un défaut de synthèse de protéines mitochondriales15,16. Par ailleurs, TRIT1 a été décrit comme un suppresseur de tumeur gène17,18 et est impliquée dans plusieurs types de cancers dont le mélanome19, poitrine20, gastrique21et cancers du poumon22 ,,23. Enfin, TRIT1 et Mod5 (Saccharomyces cerevisiae) isopentényl transférase est sujettes à l’agrégation de protéines qui forment prion comme fibres amyloïdes24,25,26. Ces observations impliquent potentiellement transférases isopentényl tRNA dans les maladies neurodégénératives, même si une preuve directe pour que cela n’a pas encore été démontrée.
Compte tenu du rôle qu’isopentényl transférase joue dans la traduction et la maladie, les méthodes que j’ai mesurer directement6une activité d’isopentényl transférase sont importants pour une interprétation mécaniste de ces enzymes dans des conditions normales et états pathologiques. Un nombre croissant de méthodes est disponible pour détecter les adaptations de l’ARN de6, y compris en vitro isopentenylation essais, hybridation j’ai en l’absence d’i6A (PHA6) essais, mince chromatographie en couche (TLC), acides aminés tests d’activité acceptation et approches de la spectrométrie de masse (révision Réf. 4).
Une essai in vitro isopentenylation avec a été décrit qui utilise 14C-DMAPP et ARNt sans étiquette. Dans ce test, le carbone radioactif est transféré à l’ARN du 14C-DMAPP de l’isopentényl transférase. Bien que ce test est très sensible, il est souvent difficile de déterminer le résidu spécifique qui est modification9,20,27. PHA6 analyses reposent sur l’encombrant j’ai6A modification interférant avec l’hybridation d’une sonde marquée P 32, s’étendant sur le résidu mis à jour le. À ce titre, l’hybridation est plus grande en l’absence d’un i6une modification18,28,29. Les dosages de PHA6 sont très sensibles et capable d’analyser l’ARN total extrait de lysats cellulaires. En outre, la capacité de concevoir des sondes spécifiques de l’ARN d’intérêt permet cette méthode cible importante. Cependant, PHA6 tests sont limités à la caractérisation des modifications qui se produisent sur les résidus dans la région ciblée de la sonde et sont donc moins susceptibles d’identifier les sites de nouvelles modifications. En outre, comme l’absence de liaison est révélateur de la modification, autres modifications ou mutations qui affectent les ARN contraignantes confondre l’analyse des données.
Une autre approche combine chromatographie de cellulose de benzyle DEAE cellulose (BD) avec activité acceptation d’acides aminés comme une lecture de je6A des modifications dans le tRNA30. Cette approche tests directement la fonction du i modification6A, mais c’est une approche indirecte pour détecter j’ai6A modification et n’a pas de résolution pour mapper les modifications apportées à un résidu spécifique dans l’ARN. Une approche de TLC a été utilisée pour détecter les ARNt total j’ai6A modifications. Dans cette approche, en interne, 32P-étiqueté ARNt sont digérées en nucléotides simples et analyse bidimensionnelle de TLC est utilisé pour identifier des isopentenylation. Cette approche est très sensible dans la détection j’ai total6A dans un échantillon donné de RNA mais après digestion, toutes les informations de séquence sont perdues ; ainsi, le chercheur n’a aucun moyen de déterminer les résidus ont été mis à jour le31.
Plus récemment, les méthodes de spectrométrie de masse en tandem par chromatographie liquide (LC-MS/MS) ont été développés qui comparer quantitativement les modifications de RNA totales entre espèces, les types de cellules et conditions expérimentales32,33, 34. Une limitation de cette méthodologie est qu’il est moins en mesure de déterminer l’identité et la position au sein de l’ARN d'où le nucléoside modifié a été dérivé de34. De plus, l’expertise et l’équipement nécessaire pour exécuter ces expériences limitent l’aspect pratique de cette approche.
En outre, plusieurs technologies de séquençage de nouvelle génération ont été développés pour mapper les RNA modifications à l’échelle du transcriptome34. Immunoprécipitation d’ARN avec des anticorps spécifiques à une modification particulière (RIP-Seq) permettent à l’enquêteur d’identifier toutes les séquences contenant une modification spécifique35,36. En outre, approches axées sur la transcriptase inverse comme Chem-Seq et séquençage de décalage non aléatoire s’appuient sur les perturbations de la réaction de transcription inverse les résidus modifiés37,38,39. Malgré l’avantage de ces techniques pour mapper les modifications transcriptome-échelle de RNA, RIP-seq et Seq-Chem technologies sont limités par l’absence d’anticorps fiables ou de produits chimiques réactifs disponibles pour chaque modification spécifique, respectivement34. En outre, reverse transcriptase enzymes nécessaires à l’exécution de Chem-Seq et les techniques de séquençage de décalage non aléatoire peuvent être entravés par des structures d’ARN stables. Le caractère fortement modifié et structurellement stable des ARNt rendent particulièrement difficiles à interroger à l’aide de ces techniques. A ce jour, la nouvelle génération basée sur le séquençage des technologies n’ont pas encore été utilisés à carte j’ai6une modification34.
Ici, les auteurs décrivent une approche simple et directe pour détecter j’ai6un ARNt modifications in vitro. Cette méthode utilise l’incubation d’ARN avec recombinant S. cerevisiae isopentényl transférase (Mod5), suivie de la digestion de la RNase T1 et analyse par électrophorèse sur gel 1D à la carte j’ai6A modifications. Cette approche est directe et nécessite peu d’expertise pour analyser les données. En outre, cette méthode est adaptable aux autre RNA modification des enzymes, y compris les enzymes qui changent par covalence le poids moléculaire de l’ARN ou de mobilité d’un ARN à travers un gel.

<table><tbody><tr><td><Réactif>s forts</forts></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Concentré d’UreaGel</td><td>National Diagnostics</td><td>EC-833</td><td>Dans le cadre d’un kit</td></tr><tr><td>Diluant UreaGel</td><td>National Diagnostics</td><td>EC-833</td><td>Dans le cadre d’un kit</td></tr><tr><td>Tampon UreaGel</td><td>National Diagnostics</td><td>EC-833</td><td>Dans le cadre d’un kit</td></tr><tr><td>10x TBE</td><td>National Diagnostics</td><td>EC-833</td><td>Dans le cadre d’un kit</td></tr><tr><td>Persulfate d’ammonium (APS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7727-54-0</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&prime ;,N&prime ;-Tétraméthyléthylènediamine (TMED)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Acide borique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10043-35-3</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60-00-4</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34369-07-8</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>DMAPP</td><td>Caymen Chemical</td><td>1186-30-7</td><td></td></tr><tr><td>Super RNaseIN</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoéthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60-24-2</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Acétate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>127-09-3</td><td></td></tr><tr><td>Rnase T1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EN0541</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>Xylène cyanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2650-17-1</td><td></td></tr><tr><td>Equipment and Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plaques de verre courtes (20-40 cm L x 40 cm L)</td><td>The Gel Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Longues plaques de verre (20-40 cm L x 40 cm L)</td><td>The Gel Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Appareil vertical à gel</td><td>The Gel Company</td><td>S2-3040</td><td></td></tr><tr><td>Seringue jetable 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-377-26</td><td></td></tr><tr><td>Pinces à reliure en acier inoxydable</td><td>Idea Scientific</td><td>1066</td><td></td></tr><tr><td>Phosphoscreen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>28-9564-74</td><td></td></tr><tr><td>Pellicule plastique</td> <td>(épicerie locale)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un test in vitro pour détecter l’activité arnt-isopentényl transférase

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Modifications de N6- isopentényl RNA sont fonctionnellement variées et hautement conservée chez les procaryotes et les eucaryotes. Une des plus hautement conservée N6- isopentényl modifications se produit à la position de A37 dans un sous-ensemble des ARNt. Cette modification améliore l’efficacité de la traduction et de la fidélité en augmentant l’affinité de l’ARNt pour le ribosome. Mutation des enzymes responsables de cette modification chez les eucaryotes sont associées à plusieurs états pathologiques, dont le cancer et dysfonctionnement mitochondrial. Par conséquent, comprendre la spécificité de substrat et l’activité biochimique de ces enzymes est important pour la compréhension de la biologie eucaryote normale et pathologique. Un large éventail de méthodes a été utilisé pour caractériser les modifications6A je. Dans les présentes est décrit une approche directe pour la détection des isopentenylation par Mod5. Cette méthode utilise l’incubation d’ARN avec une transférase isopentényl recombinante, suivie de la digestion de RNase T1 et l’analyse par électrophorèse sur gel 1D pour détecter les modifications de6A je. En outre, la capacité d’adaptation éventuelle du présent protocole pour caractériser d’autres enzymes de modification des RNA est discutée.

Mod5 est incubé avec une tyrosine ARNt ou sérine ARNt en présence ou en absence de DMAPP. Suite à la réaction de la modification, produits ont été digérés RNase T1, qui s’attache à l’extrémité 3' de tous les guanosines laissant un 3' guanosine monophosphates (GMP)24 (Figure 1). La digestion complète du RNAs produit un schéma prévisible des fragments radioactifs (Figure 2A), qui sont alors ...

Nous décrivons ici un protocole pour la caractérisation biochimique de l’enzyme de RNA-modification de la levure, Mod5 et discuter de comment ce protocole pourrait être appliqué à d’autres enzymes de modification des RNA.

Un test In Vitro pour détecter l’activité ARNt-isopentényl transférase

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

L’objectif global de ce protocole est de caractériser biochimiquement l’activité de transferase tRNA-Isopentenyl in vitro. Cette méthode est utile pour la détection in vitro et la caractérisation de l’activité de transferase tRNA-isopentenyl des enzymes recombinantes purifiées. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’un essai simple et direct utilisé pour détecter une modification covalente de l’ARN.Bien que cette méthode donne un aperçu de l’activité de transferase tRNA-isopentenyl, elle est potentiellement adaptable pour la caractérisation biochimique d’enzymes modificables à large portée ou arn. La première étape de cette procédure consiste à nettoyer soigneusement les plaques de verre qui seront utilisées pour moulage du gel. Laver les assiettes avec du savon et de l’eau, bien rincer à l’eau déionisée, puis nettoyer les assiettes avec des lingettes sans isopropanol et sans peluche.Ensuite, assemblez les plaques et les entret spatiales. Mélanger les reagents suivants pour faire un 100 millilitres 20% acrylamide, 7,5 urée molaire, 1x gel TBE. 80 millilitres de concentré de gel d’urée, 10 millilitres de gel d’urée diluant, et 10 millilitres de tampon gel d’urée

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