Caractérisation fonctionnelle des carboxylestérases chez les mouches maison résistant aux insecticides, Musca Domestica

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la toxicologie des insectes, telles que, si tous les gènes de détoxification métabolique exprimés sont impliqués dans la résistance aux insecticides ? Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de produire des protéines à plus grande échelle, et de caractériser la fonction de ces protéines dans le métabolisme des insecticides in vitro. Xuechun Feng, un étudiant diplômé de mon laboratoire, fera la démonstration des procédures.

La recherche doctorale de Xuechen est axée sur la caractérisation de la fonction de la carboxyl estérase dans la résistance parasitaire des mouches domestiques, Musca domestica. Pour commencer, mélangez un microlitre d’ADN plasma d’entrée GFP avec cinq microlitres d’ADN linéaire C-term disponible dans le commerce dans des tubes PCR de 250 microlitres. Ensuite, ajoutez deux microlitres de mélange de recombinaison lambda disponible dans le commerce dans chacun des tubes PCR.

Mélangez délicatement les tubes et incubez-les à 25 degrés Celsius pendant la nuit. Semez deux millilitres de culture cellulaire d’insecte de croissance logarithmique SF9 uniformément dans les puits d’une plaque de culture cellulaire. Laissez ensuite les cellules se fixer pendant au moins trois heures à température ambiante, dans la hotte.

À l’aide d’un microscope à phase inversée à 250x, vérifiez la fixation de la cellule. Ensuite, retirez le milieu de culture cellulaire et remplacez-le par deux millilitres de milieu d’insecte de Grace. Après cela, préparez les solutions de mélange de transfection A et B selon le protocole de texte.

Mélangez ensuite délicatement les mélanges de transfection A et B en tapotant les tubes. Incuber le mélange à température ambiante, dans la hotte, pendant 35 minutes. Ensuite, ajoutez le mélange goutte à goutte sur les cellules ensemencées.

Scellez les puits avec du ruban adhésif et incubez les cellules à 27 degrés Celsius, pendant la nuit. Remplacez les deux millilitres de milieu d’insecte de Grace par deux millilitres de milieu de croissance complet. Ensuite, ajoutez 100 micromoles de ganciclovir, dans chaque puits.

Scellez les puits avec du ruban adhésif et incubez les cellules à 27 degrés Celsius pendant 72 heures. 72 heures après l’infection, prélevez le milieu de chaque puits et transférez-le dans des tubes à centrifuger de 1,5 millilitre. Ensuite, centrifugez les tubes à 1500 fois G, pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Ajoutez un millilitre de milieu de croissance complet dans le puits et utilisez un microscope à lumière fluorescente pour observer les signes d’infection des cellules au stade d’amplification du baculovirus P1. Transférez le surnageant dans de nouveaux tubes à centrifuger de 1,5 millilitre et stockez-les à quatre degrés Celsius, dans des conditions sombres. Après cela, ensemencez deux millilitres de culture cellulaire d’insecte de croissance en phase logarithmique SF9, uniformément, dans les puits d’une plaque de culture cellulaire.

Laissez les cellules se fixer pendant au moins trois heures à température ambiante, dans la hotte. Injectez cinq microlitres de virus P1 dans les puits ensemencés de cellules, puis ajoutez 100 micromoles de ganciclovir dans chaque puits. Scellez les puits et incubez les cellules pendant 72 heures à 27 degrés Celsius.

Tout d’abord, cultivez cinq millilitres de cellules d’insectes SF9 en phase logarithmique, avec un milieu de croissance complet, dans des flacons T25 non traités. Ensuite, ajoutez 25 microlitres de solution mère du virus P1 pour infecter la culture cellulaire, pendant 48 heures, en secouant doucement, à 27 degrés Celsius. À l’aide d’acétonitrile, préparez des dilutions en série de 100 millimoles de perméthrine.

Ensuite, semez 200 microlitres de culture cellulaire infectée complétée par 300 microlitres de milieu de croissance complet, dans une plaque à 24 puits. Assurez-vous que la perméthrine est complètement dissoute dans l’acétonitrile et distribuée uniformément dans chaque puits de la plaque. Après avoir ajouté la perméthrine, secouez doucement la plaque pour bien mélanger la perméthrine dans le milieu.

Après cela, scellez la plaque avec du ruban adhésif et incubez la plaque à 27 degrés Celsius, pendant 48 heures, dans des conditions sombres. Retirez le milieu de culture cellulaire de la plaque sans perturber la couche cellulaire inférieure attachée. Ajoutez 200 microlitres de réactif MMT dans chaque puits.

Ensuite, incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant quatre heures, jusqu’à ce que des précipitants de formazan violet foncé se forment dans chaque puits. Ajoutez 500 microlitres de DMSO dans chaque puits, pour dissoudre complètement les précipitants. Transférez ensuite 200 microlitres de la solution dissoute, dans chaque puits d’une plaque de 96 puits.

La dissolution complète du précipité dans le DMSO est cruciale pour la précision des résultats. Après avoir ajouté le DMSO dans les échantillons dans la plaque, les échantillons seront lavés à l’aide de la pipette, plusieurs fois, jusqu’à ce que le précipité soit complètement dissous. Enfin, utilisez un lecteur de microplaques pour mesurer les valeurs d’absorbance de la plaque à 540 nanomètres.

Au stade P1, le taux d’infection est faible. Au stade P2, le taux d’infection a été considérablement amélioré. Au stade de l’infection P3, presque toutes les cellules présentaient des symptômes de détachement de la plaque de culture cellulaire, d’augmentation du diamètre des cellules, ainsi que d’arrêt de la croissance cellulaire.

Sur la base des valeurs d’absorbance détectées, les cellules exprimant Md alpha E7 ont montré une viabilité significativement plus élevée que les cellules CAT témoins. Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est important d’éviter la contamination des cellules à toutes les étapes, en essuyant la surface des substances, telles que les bouteilles et les tubes, avec de l’éthanol à 70 % avant de mener les expériences sur les cellules. Suite à cette procédure, d’autres méthodes, comme la modélisation d’homologie et l’analyse sombre, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme les interactions entre la protéine carboxyl estérase et le ligand de la perméthrine.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs en toxicologie des insectes, pour explorer la caractérisation fonctionnelle des gènes et des mécanismes de résistance aux insecticides des insectes. N’oubliez pas que travailler avec un insecticide peut être très nocif et que des précautions, telles que des gants et des blouses de laboratoire, doivent toujours être prises lors de ces procédures.