Name: Caractérisation fonctionnelle des carboxylestérases chez les mouches maison résistant aux insecticides, Musca Domestica (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Découvrez la caractérisation fonctionnelle des carboxylestérases chez Musca domestica pour la toxicologie des insectes. Cette méthode permet de produire des protéines à grande échelle et d'étudier leur rôle dans le métabolisme de la perméthrine.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Scott, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insecticide+resistance+in+house+flies+from+the+United+States%3A+Resistance+levels+and+frequency+of+pyrethroid+resistance+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22Pesticide+Biochemistry+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Insecticide resistance in house flies from the United States: Resistance levels and frequency of pyrethroid resistance alleles.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 107 (3), 377-384 (2013).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whole+transcriptomal+linkage+analysis+of+gene+co-regulation+in+insecticide+resistant+house+flies%2C+Musca+domestica%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A whole transcriptomal linkage analysis of gene co-regulation in insecticide resistant house flies, Musca domestica.</a> BMC Genomics. 14, 803(2013).</li>
<li>Liu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insecticide+resistance+in+mosquitoes%3A+impact%2C+mechanisms%2C+and+research+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Insecticide resistance in mosquitoes: impact, mechanisms, and research directions.</a> Annual Review of Entomology. 60, 537-559 (2015).</li>
<li>Grigoraki, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+profiling+and+genetic+study+reveal+amplified+carboxylesterase+genes+implicated+in+temephos+resistance%2C+in+the+Asian+tiger+mosquito+Aedes+albopictus%5BTitle%5D)+AND+%22e0003771%22%5BJournal%5D)">Transcriptome profiling and genetic study reveal amplified carboxylesterase genes implicated in temephos resistance, in the Asian tiger mosquito Aedes albopictus.</a> e0003771. 9, e0003771(2015).</li>
<li>Grigoraki, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carboxylesterase+gene+amplifications+associated+with+insecticide+resistance+in+Aedes+albopictus%3A+Geographical+distribution+and+evolutionary+origin%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Carboxylesterase gene amplifications associated with insecticide resistance in Aedes albopictus: Geographical distribution and evolutionary origin.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 11, e0005533(2017).</li>
<li>Wheelock, C., Shan, G., Ottea, J. <a target="_blank" href="https://www.jstage.jst.go.jp/article/jpestics/30/2/30_2_75/_article/-char/ja/">Overview of carboxylesterases and their role in the metabolism of insecticides.</a> Journal of Pesticide Science. 30, 75-83 (2005).</li>
<li>Feng, X., Li, M., Liu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carboxylesterase+genes+in+pyrethroid+resistant+house+flies%2C+Musca+domestica%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Carboxylesterase genes in pyrethroid resistant house flies, Musca domestica.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 92, 30-39 (2018).</li>
<li>Mosmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+colorimetric+assay+for+cellular+growth+and+survival%3A+application+to+proliferation+and+cytotoxicity+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays.</a> J Immunol Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).</li>
<li>Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus-insect+cell+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Baculovirus-insect cell expression systems.</a> Methods in Enzymology. 463, 191-222 (2009).</li>
<li>Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus+expression+system+for+heterologous+multiprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1583(2004).</li>
<li>Gong, Y., Li, T., Feng, Y., Liu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+two+P450s%2C+CYP9M10+and+CYP6AA7%2C+in+the+permethrin+resistance+of+Culex+quinquefasciatus%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The function of two P450s, CYP9M10 and CYP6AA7, in the permethrin resistance of Culex quinquefasciatus.</a> Scientific Reports. 7 (1), 587(2017).</li>
<li>Cao, C. W., Zhang, J., Gao, X. W., Liang, P., Guo, H. L. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0048357507001538">Overexpression of carboxylesterase gene associated with organophosphorous insecticide resistance in cotton aphids, Aphis gossypii (Glover).</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 90 (3), 175-180 (2008).</li>
<li>Zhang, L., Gao, X., Liang, P. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0048357507000399">Beta-cypermethrin resistance associated with high carboxylesterase activities in a strain of house fly, Musca domestica (Diptera: Muscidae).</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 89, 65-72 (2007).</li>
<li>Van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. Cell sensitivity assays: the MTT assay. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVan+Meerloo%2C+J+%22Cancer+cell+culture%22">Cancer cell culture</a>. , Humana Press. 237-245 (2011).</li>
<li>Stockert, J. C., Blázquez-Castro, A., Cañete, M., Horobin, R. W., Villanueva, Á <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MTT+assay+for+cell+viability%3A+Intracellular+localization+of+the+formazan+product+is+in+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochemica%22%5BJournal%5D)">MTT assay for cell viability: Intracellular localization of the formazan product is in lipid droplets.</a> Acta Histochemica. 114 (8), 785-796 (2012).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. , A3-B (2001).</li>
<li>Riss, T. L., Moravec, R. A., Niles, A. L., Duellman, S., Benink, H. A., Worzella, T. J., Minor, L. Cell viability assays. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRiss%2C+TL+%22Assay+Guidance+Manual%22">Assay Guidance Manual</a>. , (2013).</li>
<li>Wheelock, C. E., Shan, G., Ottea, J. <a target="_blank" href="https://www.jstage.jst.go.jp/article/jpestics/30/2/30_2_75/_article/-char/ja/">Overview of carboxylesterases and their role in the metabolism of insecticides.</a> Journal of Pesticide Science. 30 (2), 75-83 (2005).</li>
<li>Li, X., Schuler, M. A., Berenbaum, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+metabolic+resistance+to+synthetic+and+natural+xenobiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of metabolic resistance to synthetic and natural xenobiotics.</a> Annual Review of Entomology. 52, 231-253 (2007).</li>
<li>Nakamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vitro+metabolism+of+a+pyrethroid+insecticide%2C+permethrin%2C+and+its+hydrolysis+products+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">The in vitro metabolism of a pyrethroid insecticide, permethrin, and its hydrolysis products in rats.</a> Toxicology. 235 (3), 176-184 (2007).</li>
<li>Kruger, N. J. The Bradford method for protein quantitation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKruger%2C+NJ+%22The+protein+protocols+handbook%22">The protein protocols handbook</a>. , Humana Press. 15-21 (2002).</li>
<li>Macauley-Patrick, S., Fazenda, M. L., McNeil, B., Harvey, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+protein+production+using+the+Pichia+pastoris+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system.</a> Yeast. 22 (4), 249-270 (2005).</li>
<li>Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus+expression+system+for+heterologous+multiprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1583(2004).</li>
<li>Terpe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+bacterial+expression+systems+for+heterologous+protein+production%3A+from+molecular+and+biochemical+fundamentals+to+commercial+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 72 (2), 211(2006).</li>
<li>Bulter, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+of+a+fungal+laccase+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+directed+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Functional expression of a fungal laccase in Saccharomyces cerevisiae by directed evolution.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 69 (2), 987-995 (2003).</li>
<li>Stepanenko, A. A., Dmitrenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pitfalls+of+the+MTT+assay%3A+Direct+and+off-target+effects+of+inhibitors+can+result+in+over%2Funderestimation+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability.</a> Gene. 574 (2), 193-203 (2015).</li>
</ol>

Ces dernières décennies, des systèmes d’expression hétérologue ont été employé couramment pour exprimer et isoler les grandes quantités de protéines, ce qui permet la détermination biochimique et fonctionnelle et la caractérisation des enzymes in vitro. A ce jour, plusieurs systèmes de modèles différents dont Escherichia coli, Pichia pastoris, Sacccharomyces cerevisiaeet Spodoptera frugiperda ont été adaptés pour l’expression de protéine recombinante et le choix de la système ...

Résistance aux insecticides est actuellement un enjeu majeur du contrôle de la mouche de maison dans le monde1,2. Efforts pour déterminer que le mécanisme de résistance aux insecticides permet de mieux comprendre cette question et de fournir ainsi des stratégies novatrices pour efficacement prévenir ou limiter la propagation de la résistance développement3. Carboxylestérases, comme l’une des enzymes de détoxication importants, ont attiré beaucoup d’attention pour leur rôle dans la séquestration et métabolisant les insecticides chez divers insectes4,5,6. Notre étude précédente a identifié plusieurs carboxylestérases en mouches domestiques et leurs niveaux d’expression était non seulement constitutivement régulée dans la souche résistante de ALHF mais peut également être induite à la hausse des niveaux en réponse aux traitements de perméthrine7 . Toutefois, la caractérisation fonctionnelle de ces gènes carboxylestérase dans le métabolisme des insecticides reste à explorer.
Depuis le premier rapport au début des années 19808, un système d’expression de gènes étrangers baculovirus a été largement employé en raison de son efficacité de production riche en protéines et protéines eucaryotes traitement capacités9. Ce système binaire est composé de deux éléments essentiels : le baculovirus recombinant construit des gènes étrangers dans les cellules de l’hôte et l’expression à grande échelle des protéines intéressées par les cellules infectées par des baculovirus recombinant. Ces dernières décennies, le système d’expression baculovirus médié cellulaire a été largement utilisé pour produire des milliers de protéines recombinantes, allant des enzymes cytosoliques aux protéines membranaires chez insecte et10des cellules mammifères. Notre étude précédente a exprimé avec succès plusieurs enzymes CYP450 dans des cellules d’insecte Sf9 avec ce système11. Dans cette étude, nous avons construit un baculovirus recombinant carboxylestérase pour infecter des cellules d’insecte Sf9, explore la tolérance des lymphocytes de perméthrine différents traitements et à grande échelle exprimée carboxylestérase protéines in vitro pour fonctionnelle exploration. Au lieu d’enquêter sur des mélanges d’isozymes carboxylestérase multiples d’homogénats insectes tel qu’adopté par les précédentes études12,13, ce système d’expression baculovirus insectes cellulaire permet l’expression spécifique et isolement des protéines ciblées pour une meilleure caractérisation de leurs propriétés biochimiques et structurales.
Le test de base de sels de tétrazolium (MTT) est une méthode colorimétrique de haut débit développé et optimisé pour mesurer la viabilité des cellules. Cette analyse est basée sur le mécanisme que seulement les cellules vivantes sont capables de métaboliser le réactif MTT de couleur jaune à un précipité de formazan couleur violet foncé, qui peut être analysé par colorimétrie après dissous dans des solvants organiques14, 15. Plusieurs plus précis mais les méthodes fastidieuses, telles que le bleu Trypan exclusion et la thymidine titrage dosage16,17, ont été développés ces dernières années. Cependant, le test MTT basés sur les cellules est encore actuellement reconnu comme la méthode la plus rapide et plus facilement exploités pour détecter rapidement la viabilité cellulaire. Ici, nous utilisons le test MTT pour explorer la tolérance des lymphocytes contre des traitements insecticides. La tolérance accrue des cellules lorsqu’elles sont infectées par la carboxylestérase baculovirus recombinant fortement prend en charge les rôles métaboliques des carboxylestérases aux insecticides, qui suggère à son tour leur implication dans la résistance aux insecticides.
En outre, un essai in vitro métabolique avec a été également menée dans cette étude. Par rapport aux dosages carboxylestérase générales qui utilisent des substrats communs tels que α-naphtyl acétate (α-NA) et β-naphtyl acétate (β-NA) afin de tenir compte des activités hydrolytiques des carboxylestérases, l’étude métabolique in vitro est considéré comme un moyen précis de mesurer directement les activités des carboxylestérases vers insecticides18. Cette méthode a été utilisée avec succès dans divers insectes, pour caractériser plusieurs cytochrome P450s en liaison avec l’insecticide résistance11,19,20. Toutefois, cette méthode n’a pas encore été appliquée dans les études de la carboxylestérase. Avec la disponibilité de la carboxylestérase protéines produites par le système d’expression baculovirus-négociée, nous pouvons effectuer une étude métabolique in vitro des carboxylestérases vers permethrin, qui peut fournir plus de preuves solides de l’implication des carboxylestérases en conférant une résistance aux pyréthrinoïdes dans la maison d’oiseau.

<table><tbody><tr><td>ADN polymérase haute fidélité Q5</td><td>New England Biolabs inc.</td><td>M0491L</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction</td> Kit <td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>pENTR/D-TOPO Kit de clonage, avec One Shot TOP10 Chimiquement compétent E. coli</td><td>Invitrogen par life technology</td><td>K240020</td><td>S.O.C medium et des amorces universelles de séquence M13 ont été incluses dans ce kit.</td></tr><tr><td>PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit</td><td>Invitrogen by life technology</td><td>K210002</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase II Mélange d’enzymes pour BaculoDirectTM Kits</td><td>Invitrogen by life technology</td><td>11791-023</td><td></td></tr><tr><td>Kit de transfection d’ADN linéaire BaculoDirect C-Term</td><td>Invitrogen by life technology</td><td>12562-019</td><td>Le réactif de transfection Cellfectin et le ganciclovir étaient inclus dans ce kit</td></tr><tr><td>Plasmide pENTR-CAT</td><td>Invitrogen par life technology</td><td></td><td>Inclus dans le kit de transfection d’ADN linéaire BaculoDirect C-Term, concentration : 0,5 ug/uL</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur, certifié</td><td>Gibco par Life Technologies</td><td>10082-139</td><td></td></tr><tr><td>Cellules Sf9 dans le Sf-900 III SFM</td><td>Gibco par Life</td> Technologies <td>12659017</td><td></td></tr><tr><td>Insect Cell-PE LB Insect Cell Protein Extraction & Tampon de lyse</td><td>G Biosciences par A Geno Technology Inc</td><td>786-411</td><td></td></tr><tr><td>SF-900 III SFM (1&times ;) Milieu sans sérum Complet</td><td>Gibco de Life Technologies</td><td>12658-019</td><td></td></tr><tr><td>Milieu pour insectes de Grace, non supplémenté</td><td>Gibco de Life Technologies</td><td>11595030</td><td></td></tr><tr><td>Perméthrine (isomères) étalon analytique</td><td>SUPELCO de Solutions WithinTM</td><td>442748</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol (classé analytique)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Acétonitrile (grade analytique)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75-05-8</td><td></td></tr><tr><td>GHP Acrodisc 25 mm Filtres pour seringue avec 0,45 &mu ; m Membrane GHP (certifiée HPLC)</td><td>Pall Life Sciences</td><td>21890388</td><td></td></tr><tr><td>Alliance Waters 2695 Système HPLC</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T100 Thermal</td><td>Cycle Bio-Rad Laboratories Inc.</td><td></td><td></td>1861096</tr><tr><td>Spectrophotomètres Nanodrop 2000/2000c</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND2000CLAPTOP</td><td></td></tr><tr><td>Cytation 5 Cell Imaging Lecteur multimode</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

caractérisation fonctionnelle des carboxylestérases chez les mouches maison résistant aux insecticides, musca domestica

Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica

Métabolisme médié par la carboxylestérase est censé jouer un rôle majeur dans la résistance aux insecticides chez les insectes divers. Plusieurs gènes de la carboxylestérase trouvées régulée dans la souche mouche résistant à la maison, tandis que leurs rôles en conférant la résistance aux insecticides restaient à explorer. Ici, nous avons conçu un protocole de caractérisation fonctionnelle des carboxylestérases. Trois expériences d’exemple sont présentés : (1) expression et l’isolement des protéines carboxylestérase grâce à un insecte médiée par les baculovirus Spodoptera frugiperda (Sf9) système d’expression cellulaire ; (2) un MTT à base de cellules (3-[4, 5-dimethykthiazol-2-yl] -2, 5-diphenyltetrazolium bromure) test de cytotoxicité pour mesurer la tolérance des cellules d’insectes à la perméthrine différents traitements ; et (3) in vitro études métaboliques d’explorer les capacités métaboliques des carboxylestérases vers la perméthrine. Le gène de la carboxylestérase MdαE7 a été cloné à partir d’une maison résistante voler souche ALHF et utilisé pour construire un baculovirus recombinant pour l’infection de cellules Sf9. La viabilité cellulaire contre perméthrine différents traitements ont été mesurée avec le test MTT. La tolérance des lymphocytes améliorés du groupe expérimental (cellules de baculovirus infectés MdαE7 recombinant) comparé à ceux des groupes témoins (cellules infectées de baculovirus recombinant CAT et cellules infectées de baculovirus recombinant GFP) de perméthrine traitements a suggéré les fonctionnalités de MdαE7 dans le métabolisme des insecticides, protégeant ainsi les cellules des dommages chimiques. En outre, carboxylestérase protéines étaient exprimées dans des cellules d’insecte Sf9 et isolés pour mener une étude métabolique in vitro . Nos résultats ont indiqué une significative in vitro l’efficacité métabolique de MdαE7 vers la perméthrine, directement indiquant l’implication des carboxylestérases en métabolisant les insecticides et conférant ainsi la résistance aux insecticides dans la maison d’oiseau.

La viabilité des cellules vers la perméthrine différents traitements (test MTT)
La cytotoxicité de la perméthrine a été examinée dans MdαE7-recombinant baculovirus infectés Sf9 cellules (groupe expérimental) et CAT-recombinant baculovirus (fourni par le kit de baculovirus infecté) infectés (groupe témoin). Les tolérances de cellule renforcée à la perméthrine dans MdαE7 exprimant des cellules fortement appuient les rôles métabolique...

Nous présentons ici un protocole pour produire chambre carboxylestérase mouche protéines in vitro avec un système d’expression baculovirus médiée par cellule insectes et plus tard fonctionnellement caractériser leurs rôles en métabolisant perméthrine, ainsi, conférant aux pyréthrinoïdes résistance en procédant à base de cellules MTT dosage et in vitro études métaboliques.

Caractérisation fonctionnelle des carboxylestérases chez les mouches maison résistant aux insecticides, Musca Domestica

Carboxylesterase-mediated metabolism is thought to play a major role in insecticide resistance in various insects. Several carboxylesterase genes were ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la toxicologie des insectes, telles que, si tous les gènes de détoxification métabolique exprimés sont impliqués dans la résistance aux insecticides ? Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de produire des protéines à plus grande échelle, et de caractériser la fonction de ces protéines dans le métabolisme des insecticides in vitro. Xuechun Feng, un étudiant diplômé de mon laboratoire, fera la démonstration des procédures.La recherche doctorale de Xuechen est axée sur la caractérisation de la fonction de la carboxyl estérase dans la résistance parasitaire des mouches domestiques, Musca domestica. Pour commencer, mélangez un microlitre d’ADN plasma d’entrée GFP avec cinq microlitres d’ADN linéaire C-term disponible dans le commerce dans des tubes PCR de 250 microlitres. Ensuite, ajoutez deux microlitres de mélange de recombinaison lambda disponible dans le commerce dans chacun des tubes PCR.Mélangez délicatement les tubes et incubez-les à 25 degrés Celsius pendant la nuit. Semez deux millilitres de culture cellulaire d’insecte de croissance logarithmique SF9 uniformément dans les puits d’une plaque de culture cellulaire. Laissez ensuite les cellules se fixer pendant au moins trois heures à température ambiante, dans la hotte.À l’aide d’un microscope à phase inversée à 250x, vérifiez la fixation de la cellule. Ensuite, retirez le milieu de culture cellulaire et remplacez-le par deux millilitres de milieu d’insecte de Grace. Après cela, préparez les solutions de mélange de transfection A et B selon le protocole de texte.Mélangez ensuite délicatement les mélanges de transfection A et B en tapotant les tubes. Incuber le mélange à température ambiante, dans la hotte, pendant 35 minutes. Ensuite, ajoutez le mélange goutte à goutte sur les cellules ensemencées.Scellez les puits avec du ruban adhésif et incubez les cellules à 27 degrés Celsius, pendant la nuit. Remplacez les deux millilitres de milieu d’insecte de Grace par deux millilitres de milieu de croissance complet. Ensuite, ajoutez 100 micromoles de ganciclovir, dans chaque puits.Scellez les puits avec du ruban adhésif et incubez les cellules à 27 degrés Celsius pendant 72 heures. 72 heures après l’infection, prélevez le milieu de chaque puits et transférez-le dans des tubes à centrifuger de 1,5 millilitre. Ensuite, centrifugez les tubes à 1500 fois G, pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.Ajoutez un millilitre de milieu de croissance complet dans le puits et utilisez un microscope à lumière fluorescente pour observer les signes d’infection des cellules au stade d’amplification du baculovirus P1. Transférez le surnageant dans de nouveaux tubes à centrifuger de 1,5 millilitre et stockez-les à quatre degrés Celsius, dans des conditions sombres. Après cela, ensemencez deux millilitres de culture cellulaire d’insecte de croissance en phase logarithmique SF9, uniformément, dans les puits d’une plaque de culture cellulaire.Laissez les cellules se fixer pendant au moins trois heures à température ambiante, dans la hotte. Injectez cinq microlitres de virus P1 dans les puits ensemencés de cellules, puis ajoutez 100 micromoles de ganciclovir dans chaque puits. Scellez les puits et incubez les cellules pendant 72 heures à 27 degrés Celsius.Tout d’abord, cultivez cinq millilitres de cellules d’insectes SF9 en phase logarithmique, avec un milieu de croissance complet, dans des flacons T25 non traités. Ensuite, ajoutez 25 microlitres de solution mère du virus P1 pour infecter la culture cellulaire, pendant 48 heures, en secouant doucement, à 27 degrés Celsius. À l’aide d’acétonitrile, préparez des dilutions en série de 100 millimoles de perméthrine.Ensuite, semez 200 microlitres de culture cellulaire infectée complétée par 300 microlitres de milieu de croissance complet, dans une plaque à 24 puits. Assurez-vous que la perméthrine est complètement dissoute dans l’acétonitrile et distribuée uniformément dans chaque puits de la plaque. Après avoir ajouté la perméthrine, secouez doucement la plaque pour bien mélanger la perméthrine dans le milieu.Après cela, scellez la plaque avec du ruban adhésif et incubez la plaque à 27 degrés Celsius, pendant 48 heures, dans des conditions sombres. Retirez le milieu de culture cellulaire de la plaque sans perturber la couche cellulaire inférieure attachée. Ajoutez 200 microlitres de réactif MMT dans chaque puits.Ensuite, incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant quatre heures, jusqu’à ce que des précipitants de formazan violet foncé se forment dans chaque puits. Ajoutez 500 microlitres de DMSO dans chaque puits, pour dissoudre complètement les précipitants. Transférez ensuite 200 microlitres de la solution dissoute, dans chaque puits d’une plaque de 96 puits.La dissolution complète du précipité dans le DMSO est cruciale pour la précision des résultats. Après avoir ajouté le DMSO dans les échantillons dans la plaque, les échantillons seront lavés à l’aide de la pipette, plusieurs fois, jusqu’à ce que le précipité soit complètement dissous. Enfin, utilisez un lecteur de microplaques pour mesurer les valeurs d’absorbance de la plaque à 540 nanomètres.Au stade P1, le taux d’infection est faible. Au stade P2, le taux d’infection a été considérablement amélioré. Au stade de l’infection P3, presque toutes les cellules présentaient des symptômes de détachement de la plaque de culture cellulaire, d’augmentation du diamètre des cellules, ainsi que d’arrêt de la croissance cellulaire.Sur la base des valeurs d’absorbance détectées, les cellules exprimant Md alpha E7 ont montré une viabilité significativement plus élevée que les cellules CAT témoins. Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est important d’éviter la contamination des cellules à toutes les étapes, en essuyant la surface des substances, telles que les bouteilles et les tubes, avec de l’éthanol à 70 % avant de mener les expériences sur les cellules. Suite à cette procédure, d’autres méthodes, comme la modélisation d’homologie et l’analyse sombre, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme les interactions entre la protéine carboxyl estérase et le ligand de la perméthrine.Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs en toxicologie des insectes, pour explorer la caractérisation fonctionnelle des gènes et des mécanismes de résistance aux insecticides des insectes. N’oubliez pas que travailler avec un insecticide peut être très nocif et que des précautions, telles que des gants et des blouses de laboratoire, doivent toujours être prises lors de ces procédures.

functional-characterization-carboxylesterases-insecticide-resistant

Research

Recherche

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimie

L'utilisation de deux méthodes pour estimer l'expression des gènes dans les grands appendices gustatives de Aedes aegypti, nous avons identifié l'ensemble des gènes sous-jacents supposément les réponses neuronales à des composés amers et de répulsion, comme déterminé par l'examen électrophysiologique.

Physiologiques Recordings et ARN séquençage des annexes gustatives du Mosquito fièvre jaune Aedes aegypti

La mouche méditerranéenne des fruits (medfly) Ceratitis capitata (Diptera : Tephritidae) est un ravageur mondial de l’agriculture. Une meilleure compréhension de sa biologie est essentielle pour contrôler les populations de mouches et ainsi réduire l’impact économique. La micro-injection embryonnaire est un outil fondamental permettant à la fois la transformation de la lignée germinale et l’étude de la génétique inverse chez cette espèce.

Livraison de Nucleic Acids par Embryo microinjection dans le monde entier agricole contre les insectes ravageurs,<em&gt; Ceratitis capitata</em

Une procédure pour l’élevage des mouches stables (Stomoxys calcitrans) est présentée. La procédure utilise des matériaux disponibles localement pour les composants de l’alimentation, de matériel et de fournitures.

Laboratoire d’élevage de mouches Stable et autres diptères Muscoid

Ce protocole décrit une méthode de microinjection que nous avons normalisé et utilisé depuis plusieurs années à livrer des quantités d’acides nucléiques spécifiques directement à l’hémolymphe des moustiques et des mouches domestiques. Ce protocole se traduit par la mortalité injection minime et permet des mesures de dose en corrélation de la fécondité.

DsRNA reproductible Microinjection et bioessais sur la ponte chez les moustiques et les mouches domestiques

Nous fournissons un protocole détaillé pour l’élevage, la microinjection des œufs et pour l’accouplement efficace du firebrat Thermobia domestica pour générer et maintenir des souches mutantes après l’édition du génome.

Microinjection d’oeufs et accouplement efficace pour l’édition du génome dans le Firebrat Thermobia domestica

Présenté ici est un protocole de micro-injection d’embryon Helicoverpa armigera (Hübner) et d’identification de mutant knockout créé par l’édition du génome CRISPR / Cas9. Les insectes mutants permettent de poursuivre les recherches sur la fonction des gènes et l’interaction entre différents gènes in vivo.

Microinjection embryonnaire et identification des mutants Knockout de l’Helicoverpa Armigera éditée par le génome CRISPR/Cas9 (Hübner)

Cet article présente les protocoles étape par étape pour la mutagénèse CRISPR / Cas9 de la mouche orientale des fruits Bactrocera dorsalis. Les étapes détaillées fournies par ce protocole normalisé serviront de guide utile pour générer des mouches mutantes pour les études de gènes fonctionnels chez B. dorsalis.

Protocoles pour la mutagenèse CRISPR/Cas9 de la mouche orientale des fruits Bactrocera dorsalis

Ce protocole décrit l’essai d’alimentation obligatoire pour évaluer l’effet potentiellement toxique d’un phytochimique sur les larves d’insectes lépidoptères. Il s’agit d’un essai biologique sur les insectes hautement évolutif, facile à optimiser la dose sublétale et létale, l’activité dissuasive et l’effet physiologique. Cela pourrait être utilisé pour le criblage d’insecticides respectueux de l’environnement.

Mise au point d’un système d’analyse de l’alimentation pour évaluer l’effet insecticide des composés phytochimiques sur Helicoverpa armigera

Nous présentons ici un protocole pour obtenir des champignons entomopathogènes à partir d’un foreur de bois forestier et une manière substitutive d’évaluer leurs activités entomopathogènes à l’aide d’un insecte modèle coléoptère. Cette méthode est efficace et pratique pour explorer les ressources fongiques entomopathogènes des insectes xylophages ravageurs dans les forêts naturelles.

Isolement, identification comportementale et évaluation de la pathogénicité des champignons entomopathogènes d’un xylophage forestier

Un protocole pour l’analyse structurale des polysaccharides par électrophorèse sur gel (APCE), à l’aide de mannane à titre d’exemple, est décrite.

Caractérisation des Polysaccharides pariétaux Mannan chez les plantes à l’aide de rythme

Découvrez la caractérisation fonctionnelle des carboxylestérases chez Musca domestica pour la toxicologie des insectes. Cette méthode permet de produire des protéines à grande échelle et d'étudier leur rôle dans le métabolisme de la perméthrine.

Caractérisation fonctionnelle des carboxylestérases chez les mouches maison résistant aux insecticides, Musca Domestica

Explorer plus de vidéos