Évaluation des réponses de cellules T spécifiques du Virus Zika dans les organes Immunoprivileged des Ifnar1 infecté les souris^{- / -}

Pendant l’infection par le virus Zika, les cellules T peuvent infiltrer les organes immunoprivilés pour l’élimination du virus, mais peuvent également contribuer à l’immunopathogenèse, comme le syndrome de Guillain-Barré ou les lésions des testicules. Le principal avantage de cette technique est qu’elle facilite la détection à base de tétramer de cellules T spécifiques aux antigènes dans les organes immunoprivilés, tant pendant l’infection par le virus Zika qu’après la vaccination vaccinale. Dans ce modèle, l’infection par le virus Zika est initiée chez les souris knock-out des récepteurs alpha/bêta de l’interféron, permettant le suivi des cellules T spécifiques au virus Zika dans le cerveau, les testicules et la rate.

À l’aide d’une approche de coloration du tétramer, il est possible d’étudier les caractéristiques des organes immunoprivilés infiltrant des cellules T spécifiques au virus Zika afin d’explorer les contributions des cellules T à l’immunoprotection et aux cellules immunopathogènes. Pour l’infection par le virus Zika, livrer une fois 10 aux quatre unités de formation de foyer du virus Zika dans 100 microlitres de PBS par inoculation rétro-orbitale en souris à effet de grâce à l’interféron alpha/bêta de six à huit semaines. Ensuite, surveillez le poids et les signes cliniques des animaux infectés quotidiennement pendant 15 jours.

Sept jours après l’inoculation, fixez l’animal infecté en position supine sur une mousse chirurgicale, et utilisez un scalpel stérile pour faire une incision cutanée le long de la ligne médiane de l’abdomen. Utilisez des ciseaux pour ouvrir les muscles abdominaux et extraire doucement le foie. Ensuite, retirez la rate et rincez le tissu trois fois dans PBS pour enlever le sang.

Après le dernier lavage, déposer la rate sur 1,5 millilitres de milieu rpmi glacé sur la glace jusqu’à ce que toutes les rates aient été recueillies. Pour générer une suspension à cellule unique, placez la rate dans une passoire stérile à cellules mailles de 40 micromètres au-dessus d’un tube de 50 millilitres et ajoutez deux millilitres de milieu RPMI glacé complété par du sérum bovin fœtal à 10 %, ou FBS, à la passoire. Ensuite, utilisez le piston d’une seringue de cinq millilitres pour macérer le tissu à travers le filtre, en utilisant un milieu frais pour rincer les cellules libérées à travers le maillage.

Transférez la suspension à cellule unique dans un tube conique de 15 millilitres pour centrifugation et réutilisez la pastille en cinq millilitres de tampon de lyse de globule rouge. Après cinq à six minutes à température ambiante, arrêter la lyse avec 10 millilitres de RPMI glacé plus FBS pour une deuxième centrifugation, et resuspendre la pastille en 10 millilitres de milieu complet pour le comptage. Sept jours après l’inoculation, immobiliser une souris mâle euthanasiée, infectée, en position couchée sur une planche à découper, et fixer le cuir chevelu avec des forceps droites une par deux dents.

Utilisez des ciseaux d’iris pour faire une incision de midline sur le cuir chevelu, exposant le crâne, et utilisez des pinces pointues pour serrer les deux côtés des orbites avec des pinces pointues, fixant le cerveau. Placer une pointe de ciseaux d’iris pointus dans le magnum foramen, coupé latéralement dans le crâne de chaque côté. Soigneusement coupé de la même cavité jusqu’à la ligne médiane, vers le nez, en gardant les pointes de ciseaux aussi superficielle que possible pour éviter de blesser le cerveau.

Soulevez le cerveau avec des forceps, et utilisez des ciseaux d’iris pointus pour disséquer soigneusement les fibres nerveuses crâniens. Ensuite, utilisez les forceps pour transférer le cerveau dans un tube de 15 millilitres contenant cinq millilitres de RPMI glacé plus FBS. Pour isoler les testicules, soulevez la peau abdominale avec des forceps, et utilisez les ciseaux d’iris pour faire une incision longitudinale à travers l’intégument et la paroi abdominale et exposer la partie la plus basse de l’abdomen.

Poussez les testicules jusqu’à l’incision, et utilisez des pinces à épiler pour tirer doucement la couche de graisse, pour exposer un testicule globulaire des deux côtés. Utilisez les ciseaux d’iris pour disséquer soigneusement la couche de graisse et l’épididyme, et transférez les testicules dans un tube de 15 millilitres contenant cinq millilitres de RPMI glacé plus FBS. Pour générer une suspension à cellule unique à partir de l’un ou l’autre des tissus récoltés, placez l’organe sur une passoire cellulaire stérile avec un maillage de 100 microns au-dessus d’un tube de 50 millilitres, et ajoutez deux millilitres de RPMI glacé plus FBS à la passoire.

À l’aide du piston à partir d’une seringue de cinq millilitres, écraser le tissu et laver le filtre avec un milieu frais jusqu’à ce que l’organe ait été complètement broyé à travers le maillage. Transférez la suspension à cellule unique dans un tube de 15 millilitres pour centrifugation et résuspendez la pastille en cinq millilitres de milieu de gradient de densité de 30 %. Superposez soigneusement la solution cellulaire sur deux millilitres de milieu de gradient de densité de 70 % dans un nouveau tube de 15 millilitres et séparez les cellules par centrifugation du gradient de densité.

Ensuite, transférez les cellules de l’interphase entre les deux gradients de densité à un nouveau tube de 15 millilitres contenant 10 millilitres de RPMI froid plus FBS pour une autre centrifugation, et dépensez la pastille en 10 millilitres de RPMI/FBS glacé pour le comptage. Pour analyser les cellules par cytométrie d’écoulement, diluer les cellules à cinq fois 10 à six cellules pour 100 microlitres dans la concentration tampon FACS, et incuber les échantillons de cellules avec 10 microlitres d’anti-souris CD16/CD32 bloquant l’anticorps par échantillon. Après 10 minutes à température ambiante, ajouter 20 microlitres de cellules au nombre approprié de puits d’une plaque à fond rond de 96 puits selon le protocole expérimental de coloration de cytométrie de débit, et ajouter 20 microlitres du mélange tétramet e-protéine à chaque puits pour une incubation de 30 minutes à température ambiante dans l’obscurité.

À la fin de l’incubation, ajouter les anticorps de surface cellulaire d’intérêt aux cellules pour une incubation de 30 minutes à quatre degrés Celsius, à l’abri de la lumière. Ensuite, lavez les cellules deux fois avec 200 microlitres de tampon FACS par lavage, et résuspendez soigneusement les cellules dans chaque puits avec 200 microlitres de tampon FACS frais. Ensuite, stockez les échantillons à quatre degrés Celsius, à l’abri de la lumière, jusqu’à leur analyse sur un cytomètre d’écoulement.

Des symptômes pathologiques et des signes tels que la myéloparalyse et la paraparesis motrice sont observés chez les souris à élimination alpha/bêta interféron 1 souris knock-out sept jours après l’inoculation avec le virus Zika. Des changements de poids dans les animaux infectés d’alpha/bêta de récepteur d’interféron 1 ont été surveillés pendant 15 jours, avec la perte de poids d’abord observée quatre jours après infection et rétablissement de poids commençant le septième jour après infection. Des images représentatives de cerveaux murins infectés révèlent un œdème et une hyperémie évidents sept jours après l’inoculation avec le virus Zika.

Des images représentatives de testicules infectés par le Virus Zika démontrent une diminution graduelle du septième au 30 jours après l’infection. L’analyse histopathologique des sections du cerveau et des tissus testiculaires infectés par zika illustre également l’effet des changements pathologiques destructeurs par rapport aux témoins non infectés. Comme prévu par les analyses macro et histopathologiques, des charges virales élevées sont également détectées dans le cerveau et des testicules de souris infectées par le virus Zika par immunostaining.

Cela s’accompagne d’une forte infiltration de lymphocytes T CD3 positifs dans le cerveau après l’infection à Zika. Des lymphocytes T CD3 positifs au virus Zika et positifs au CD8 sont détectés chez des souris infectées par le virus Zika et vaccinées par des taches de tétramer protéiques E. Des lymphocytes T CD8 positifs spécifiques aux tétramères e-protéine peuvent également être détectés dans le cerveau et teste sept jours après l’inoculation avec le virus Zika.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans l’étude de la caractérisation des cellules T spécifiques aux pathogènes dans les organes immunoprévalents lors d’infections naturelles chez des modèles animaux. Cette méthode peut également être appliquée à d’autres organes immuno-répandus, tels que le placenta ou l’oeil, aussi bien qu’à l’infection virale et au cancer. À la suite de cette procédure, les tétramères MHC-I peuvent être utilisés pour la détection immunohistochimique ou immunofluorescente de cellules T spécifiques aux pathogènes pour accéder à la distribution de cellules T infiltrant le cerveau ou les testicules.